謝鵬 任真奎，3 呂菊 胡玉梅 官志忠 張春林 禹文峰

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3黔西南州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；4貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

心腦血管疾病嚴(yán)重影響人類生活健康、生活質(zhì)量〔1〕。其中腦卒中已成為全球“第二大死亡殺手”。目前，臨床的主要治療手段是溶栓治療〔2，3〕。機(jī)械溶栓(手術(shù))或者化學(xué)藥物溶栓都是為了實(shí)現(xiàn)局部缺血血管血流再通〔4〕。然而，伴隨著溶栓治療會(huì)出現(xiàn)再灌注損傷和繼發(fā)性出血且神經(jīng)細(xì)胞功能缺損加重等現(xiàn)象〔5，6〕。因此，尋找有效的腦卒中治療藥物或者干預(yù)治療靶點(diǎn)迫在眉睫。研究顯示抗氧化物質(zhì)在腦卒中的病理過(guò)程具有積極保護(hù)作用〔7〕。α-硫辛酸(LA)是丙酮酸脫氫酶的輔助因子，參與三羧酸循環(huán)過(guò)程中的重要物質(zhì)。α-LA被認(rèn)為是生物體內(nèi)的強(qiáng)抗氧化劑，對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有保護(hù)作用〔8～10〕。在大鼠腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)炎癥細(xì)胞模型中，α-LA能夠顯著恢復(fù)MCAO大鼠的神經(jīng)功能和減少白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α 和IL-10 的表達(dá)，并能抑制炎癥信號(hào)通路NF-κB的激活等〔11，12〕。大量的研究結(jié)果都證明α-LA在缺血再灌注損傷的病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但是其確切的分子機(jī)制尚不清楚，有待闡明。因此本研究擬在神經(jīng)細(xì)胞PC12缺血再灌注模型上探討α-LA發(fā)揮保護(hù)作用的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)基配方為10%FBS+1%雙抗+89%的高糖DMEM，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。長(zhǎng)至80%～90%匯合度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基(8119058，賽默飛世爾科技有限公司)；胎牛血清(2045512CP，美國(guó)Gibco 公司);DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基(1951286，美國(guó)Gibco 公司)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0031019，以色列Biological Industries);蛋白酶抑制劑(#5872，CST)；R-(+)-α-LA(07039，Sigma);CCK8(A311-01，Vazyme Biotech);雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BB-4101，貝博生物)；Hoechst 33258染色液(C1017，上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Phospho-mTOR(Ser2448)(49F9)兔mAb(#2976，CST);mTOR(7C10)兔mAb(#2983，CST);SQSTM1/p62(D6M5X)兔mAb(#23214，CST);LC3A/B(D3U4C)XP?兔mAb(#12741，CST);重組Anti-Bax抗體(ab32503，Abcam);酶切Caspase-3(Asp175)抗體(#9661，CST)。

1.3α-LA溶解 精準(zhǔn)電子天平秤取硫辛酸0.020 6 g，于0.5 ml DMSO中溶解后加0.5 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成母液濃度100 mmol/L儲(chǔ)液，4℃避光保存?zhèn)溆?。?LA使用濃度中DMSO不超過(guò)0.1%。

1.4缺血再灌注模型建立與實(shí)驗(yàn)分組 PC12細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%之后，吸棄培養(yǎng)基，用3～5 ml預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞1～2次，0.25%胰酶消化細(xì)胞，含F(xiàn)BS完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，10%FBS完全培養(yǎng)基制成2×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液并取1 ml細(xì)胞懸液加入每孔內(nèi)，每孔再補(bǔ)加1 ml完全培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度至70%～80%時(shí)，進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理。正常組細(xì)胞換完全培養(yǎng)基置正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)，缺氧/復(fù)氧組用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2遍后，換無(wú)糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基置于三氣培養(yǎng)箱(94%N2+5%CO2+1%O2)中培養(yǎng)4 h，模擬缺血缺氧處理后，PBS洗細(xì)胞2次更換無(wú)血清高糖培養(yǎng)基置于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h以模擬再灌注損傷;α-LA組在復(fù)氧前給予α-LA處理共培養(yǎng)18 h；Baf A1組在缺氧/復(fù)氧處理12 h后給予20 nmol/L的Baf A1繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.5CCK8檢測(cè)法 細(xì)胞長(zhǎng)至合適密度后，將細(xì)胞制成5×104/ml的細(xì)胞懸液，以每孔100 μl接種于96孔板，細(xì)胞貼壁過(guò)夜生長(zhǎng)到50%～60%密度時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔分別加入100 μl無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱(1%O2+5%CO2)中培養(yǎng)4 h，模擬缺血缺氧處理，正常組含完全培養(yǎng)基于正常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。缺氧處理后分別加入含不同濃度α-LA的高糖無(wú)血清培養(yǎng)基置于正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h行復(fù)氧處理。復(fù)氧18 h后，每孔加入10 μl CCK8工作液反應(yīng)1 h左右，以空白孔調(diào)零，每組6個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(OD)。細(xì)胞存活率=(OD給藥-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)×100%。

1.6流式細(xì)胞術(shù) PC12接種至12孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至合適密度后，分組行實(shí)驗(yàn)干預(yù)處理。0.25%不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞1次，根據(jù)貝博凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求操作后續(xù)步驟。緩沖液重懸細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，加凋亡染色液反應(yīng)5～10 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。

1.7Western印跡分析 棄培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗細(xì)胞一次，每孔加500 μl PBS，用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞，離心收集，根據(jù)細(xì)胞多少加100～200 μl含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于振蕩器上震搖均勻，細(xì)胞于冰上充分裂解30 mins后離心收集蛋白上清，BCA蛋白定量后加入4∶1(蛋白上清∶5倍緩沖液)比例的5倍緩沖液于恒溫金屬浴100℃變性蛋白10 min，120 V恒壓十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，250 mA濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜1.5 h，1×TBST配置的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃搖床孵育抗體過(guò)夜，室溫孵育二抗2 h，ECL發(fā)光液成像檢測(cè)信號(hào)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0.1軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1α-LA抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率降低 與正常組比較，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞活性顯著降低，存活率降低至51.06%±0.97%；當(dāng)給予α-LA處理后，缺氧/復(fù)氧處理的細(xì)胞存活率顯著升高，α-LA 0.010 mmol/L、0.025 mmol/L、0.050 mmol/L、0.250 mmol/L、0.500 mmol/L、1.000 mmol/L、2.000 mmol/L、2.500 mmol/L、5.000 mmol/L和10.000 mmol/L時(shí)細(xì)胞的存活率分別為52.98%±0.44%、63.91%±1.04%、66.56%±0.57%、73.68%±0.13%、85.83%±0.28%、81.10%±0.22%、78.85%±1.39%、77.08%±0.95%、69.60%±1.53%和35.66%±0.77%；α-LA在0.500 mmol/L時(shí)細(xì)胞活性升高至85.83%±0.28%，表明α-LA在0.500 mmol/L對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的抑制作用最強(qiáng)；然而，當(dāng)α-LA的工作濃度在10.000 mmol/L時(shí)，PC12細(xì)胞存活率顯著受到抑制，表明較高濃度的α-LA具有毒副作用；以上結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2α-LA抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡 正常組、缺氧/復(fù)氧組和缺氧/復(fù)氧+α-LA組細(xì)胞的凋亡率分別為2.58%±0.16%、13.23%±1.09%和8.58%±0.56%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明：缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞的凋亡水平升高，當(dāng)給予0.500 mmol/L的α-LA與缺氧復(fù)氧的PC12細(xì)胞共培養(yǎng)處理后能顯著降低缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平升高，顯示α-LA對(duì)缺血再灌注損傷具有抑制作用。見(jiàn)圖1。

圖1 各組PC12細(xì)胞凋亡

2.3Western印跡檢測(cè)自噬和凋亡相關(guān)蛋白的變化 與正常組比較，缺氧/復(fù)氧組自噬標(biāo)志分子LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值增加，P62的表達(dá)減少；與此同時(shí)，凋亡相關(guān)分子酶切caspase-3和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平增加。缺氧/復(fù)氧后給予α-LA處理能夠顯著降低LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值，增加P62的表達(dá)，同時(shí)降低了凋亡分子酶切caspase-3和Bax的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1和圖2。

表1 Western印跡檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡及自噬標(biāo)志分子的表達(dá)變化

1～3：正常組、缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+α-LA組

2.4Baf A1抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡 正常組、缺氧/復(fù)氧組和缺氧/復(fù)氧+Baf A1組細(xì)胞的凋亡率分別為3.77%±0.47%、16.74%±0.86%、6.80%±0.04%，較缺氧/復(fù)氧組比較，給予缺氧/復(fù)氧后的PC12細(xì)胞自噬抑制劑巴弗洛霉素A1(20 nmol/L)處理后，Baf A1能夠顯著降低缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 流式檢測(cè)Baf A1處理后各組PC12細(xì)胞凋亡變化

2.5α-LA激活mTOR通路的磷酸化水平 如圖4的Western印跡結(jié)果顯示：與正常組比較，缺氧/復(fù)氧組p-mTOR的水平顯著降低，當(dāng)給予α-LA處理后能夠顯著升高p-mTOR水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示α-LA抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的異常自噬水平可能是通過(guò)激活p-mTOR水平進(jìn)而達(dá)到抑制自噬的作用。見(jiàn)圖4和表1。

1～3：正常組、缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+α-LA組

3 討 論

缺血性腦卒中患者在溶栓治療后經(jīng)常伴隨出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷并加劇患者病灶及病情〔13，14〕。溶栓治療后減少再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死具有重要意義。

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)一個(gè)高度保守的生理代謝過(guò)程〔15〕。正常生理狀態(tài)下，自噬維持在低水平以維持細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，在外源性應(yīng)激、饑餓等刺激條件下自噬被誘導(dǎo)至較高的水平〔16，17〕。細(xì)胞內(nèi)自噬水平的異常調(diào)控會(huì)導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生，比如癌癥、肌肉疾病、代謝疾病、感染和神經(jīng)退行性疾病等〔18～20〕。研究證實(shí)自噬是一個(gè)具有雙重作用的生理過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有積極作用，異常細(xì)胞自噬調(diào)控過(guò)程又會(huì)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞出現(xiàn)“自噬性的死亡”〔21〕。但是，其在缺血再灌注損傷過(guò)程中的病理分子機(jī)制尚不清楚，有待深入研究。

本研究結(jié)果證明自噬水平的增加也伴著細(xì)胞凋亡水平的升高。α-LA具有抗氧化性，清除自由基的能力，對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有保護(hù)作用。有研究報(bào)道α-LA能有效改善急性缺血性腦卒中患者的病癥，但其潛在分子機(jī)制有待闡釋〔9〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-LA能有效降低缺血再灌注誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬和凋亡水平。體現(xiàn)在自噬標(biāo)志分子LC3-Ⅱ/Ⅰ的比率降低和凋亡蛋白Bax、酶切casepase-3表達(dá)減少。

綜上，我們推測(cè)α-LA通過(guò)抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的過(guò)度自噬進(jìn)而減少過(guò)度自噬誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。其發(fā)揮保護(hù)功能的可能分子機(jī)制是激活mTOR的磷酸化降低自噬水平進(jìn)而抑制過(guò)度自噬誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。