程麗慧 陳興強(qiáng) 陳運(yùn)忠 孫恒聰 陳達(dá)佳

(三亞市人民醫(yī)院，海南 三亞 572000)

礦物質(zhì)和骨骼疾病在慢性腎臟病中很常見，透析患者的骨代謝異常尤為常見，由于骨活檢昂貴且麻煩，因此使用骨生物標(biāo)志物，但其準(zhǔn)確性仍然有限〔1〕。改善全球預(yù)后臨床實(shí)踐指南建議臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)生物標(biāo)志物的趨勢或變異進(jìn)行慢性腎臟病礦物質(zhì)和骨骼疾病治療〔2,3〕。許多骨蛋白已被證明與慢性腎臟病的患者有關(guān)，如骨保護(hù)素、成纖維細(xì)胞生長因子、堿性磷酸酶(ALP)及硬化蛋白〔4,5〕。硬化蛋白是骨細(xì)胞中SOST基因的22 kD糖蛋白產(chǎn)物，其抑制成骨細(xì)胞和骨形成〔6〕。ALP在大多數(shù)體液中可測量，并且在肝膽疾病或骨骼疾病中，血清ALP活性增加〔7〕。在不合并肝臟疾病的慢性腎臟病患者中，ALP水平可以在高周轉(zhuǎn)性骨病中增加〔8〕。血清ALP與血液透析患者的全因死亡率和心血管疾病發(fā)病率獨(dú)立相關(guān)〔9〕。在血液透析患者中，血清甲狀旁腺激素(PTH)與全因死亡率相關(guān)，PTH具有與死亡率相關(guān)的U形或J形，并且長期低PTH水平與年齡較大，營養(yǎng)不良和含鈣的磷酸鹽結(jié)合劑和維生素D過度使用相關(guān)〔10〕。與血清PTH相比，血清ALP似乎與死亡率呈線性和遞增相關(guān)〔11〕。本研究探討血液透析影響血清ALP、骨硬化蛋白與骨代謝的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年4月至2018年6月三亞市人民醫(yī)院163例受試者，男87例(53.37%)，女76例(46.63%)，平均年齡(54.16±7.84)歲。將參與者分為兩組：血液透析組(血液透析患者，n=79)，健康對(duì)照組(醫(yī)院健康體檢參與者，n=84)，兩組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者進(jìn)行6個(gè)月以上的血液透析治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：神經(jīng)或精神障礙患者；嚴(yán)重的心、肝、肺等臟器功能障礙患者；嚴(yán)重的腫瘤疾病患者；甲狀旁腺切除術(shù)史患者；前3個(gè)月接受雙膦酸鹽、擬鈣劑或類固醇治療患者。本研究經(jīng)醫(yī)院研究倫理審查委員會(huì)審查和批準(zhǔn)，每位參與者或其家屬均簽署了知情同意書，本研究是在遵守赫爾辛基宣言的情況下進(jìn)行的。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法

1.2.1臨床數(shù)據(jù)收集 從電子病歷，透析治療日志和電子病歷的審查中收集每位患者的人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，包括年齡，性別、身高和體重等臨床信息。實(shí)驗(yàn)室變量包括透析前和透析后肌酐、尿素氨、ALP和PTH。

1.2.2血液透析肌酐和尿素氮檢測 血液透析的血管通路是前臂上的原生動(dòng)靜脈瘺。超濾根據(jù)患者的實(shí)際體重而變化。所有血液透析患者使用聚砜膜(Fresenius，Bad Homburg，德國)和碳酸氫鹽緩沖透析液進(jìn)行透析。血液透析的高血壓給予未分級(jí)肝素作為抗凝血?jiǎng)?。其余患者用低分子量肝?依諾肝素(Clexane，Aventis，Montrouge，F(xiàn)rance)抗凝。所有患者有殘余腎功能，因此在每位患者中我們都可以獲得尿樣以評(píng)估肌酐。在早晨8∶00～9∶00抽取血液以避免肝素給藥和晝夜變化影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。停止體外循環(huán)(僅用于Kt/V測定所需的尿素濃度)。將靜脈血樣以9∶1的體積比收集到3.8%檸檬酸鈉中。將血液在室溫下以1 900 r/min離心20 min，收集血清用于生化參數(shù)測量。將樣品等分并在測定前儲(chǔ)存在-80 ℃。在研究期間，所有血液透析的患者也接受伴隨的藥物，如碳酸鈣(劑量范圍為3～11 g/d)和阿爾法哌啶醇(為0.25 μg/d)。沒有患者接受氫氧化鋁或其他已知影響骨代謝的藥物。

1.2.3骨代謝標(biāo)志物檢測 所有患者在同一時(shí)刻抽取血液樣品，并立即離心并在-80 ℃下冷凍。在基線時(shí)收集樣品，然后在血液透析6個(gè)月后收集樣品，使用來自美國Metra Biosystem的市售試劑盒檢測ALP，使用來自芬蘭Suomen Bioanalytiikka Oy的市售試劑盒檢測血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)-5b，使用來自丹麥Osteometer的市售試劑盒，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定血清Ⅰ型膠原C端肽(CTX),使用來自法國Cis的試劑盒通過放射免疫測定研究完整的PTH濃度。

1.2.4Western印跡 將血液在7 000 r/min離心5 min后，用含有0.1 mmol/L二硫蘇糖醇和蛋白酶抑制劑混合物的組織蛋白提取試劑在冰上裂解沉淀物。使用二辛可寧酸試劑盒(Pierce Corporation，Rockford，IL，USA)測定蛋白質(zhì)濃度。使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(zhì)級(jí)分，然后在100 mmol/L的Tris-甘氨酸緩沖液中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Millipore Corporation，USA)上55 min。用含有0.05%(V/V)Tween-20(TBST)的Tris緩沖鹽水中的5%(W/V)脫脂奶粉在室溫下封閉膜2 h。在4℃下與適當(dāng)?shù)囊豢狗跤^夜后，用TBST洗滌膜3次，在室溫下與二抗孵育2 h，然后用TBST再洗滌3次。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液行Western印跡。使用Bio-Rad成像系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)檢測蛋白質(zhì)條帶，使用Quantity One軟件包(West Berkeley，CA，USA)定量。

1.2.5實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù) 使用TRizol試劑(Invitrogen)提取總RNA。通過UV光分光光度計(jì)在260nm(ND-1000-NanoDrop)定量RNA樣品，并通過A260/A280比率驗(yàn)證RNA質(zhì)量。使用逆轉(zhuǎn)錄c-DNA試劑盒(AB-Applied Biosystems)從1 μg RNA合成cDNA。使用ABI Prism 7500序列檢測系統(tǒng)設(shè)備(Applied Biosystems)，在以下條件下進(jìn)行測定：在50℃下激活A(yù)mpEraseUNG酶2 min，然后在95℃下初始變性10 min，40個(gè)循環(huán)在95℃下15 s以結(jié)束變性過程，最后60℃退火和延伸引物和探針1 min。使用循環(huán)閾值(Ct)方法計(jì)算相對(duì)于內(nèi)源對(duì)照表達(dá)(β-actin：Hs01060665-g1，Applied Biosystems)的基因表達(dá)水平。RT-PCR引物序列：TNF-α上游引物5′-CGTATATGTCTAGATATGGTCCT-3′，下游引物5′-CGCGCTAATTGTAAATGCATACGAT-3′；IL-6上游引物5′-CGTATGGATGAATCACATAGCTA-3′,下游引物5′-AACGCGTATATGCTTAGCATGCTC-3′;β-actin上游引物5′-CTAGTTTATGATAGCCTAGAGGAT-3′，下游引物5′-GGGTATATCTAATTGGATAGCCTC-3。

1.3統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS15.0軟件進(jìn)行方差分析、t、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1血液透析對(duì)肌酐和尿素氮的影響 血液透析后，血液透析組肌酐和尿素氮含量均明顯低于血液透析前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

2.2骨硬化蛋白和血清ALP蛋白表達(dá)量 血液透析后，血液透析組骨硬化蛋白和血清ALP蛋白表達(dá)量均明顯低于血液透析前，但仍明顯高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖1，表3。

1～3：血液透析組透析前、血液透析組透析后、健康對(duì)照組，下圖同

表3 Western印跡檢測骨硬化蛋白、ALP蛋白表達(dá)

2.3腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6 mRNA表達(dá)的變化 血液透析后，血液透析組TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量均明顯低于血液透析前，但仍明顯高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量

2.4血液透析影響骨代謝標(biāo)志物含量 TRAP 5b和PTH正相關(guān)(r=0.756;P<0.05)，血液透析后，血液透析組骨代謝標(biāo)志物ALP、TRAP 5b、CTX和PTH含量均明顯低于血液透析前，但仍明顯高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表4。

表4 骨代謝標(biāo)志物含量及TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)量比較

3 討 論

ALP是一種負(fù)責(zé)去磷酸化的酶，較高的血清ALP水平與一般人群和維持性血液透析患者的死亡率增加有關(guān)〔3〕。在血管平滑肌細(xì)胞膜內(nèi)骨化過程中，ALP表達(dá)消除鈣化抑制劑焦磷酸鹽，為血管組織提供局部可用性〔11〕。較高的ALP水平主要與6個(gè)月內(nèi)血液透析患者的非心血管死亡率相關(guān)，因此，ALP已被提出作為高轉(zhuǎn)換率骨病的新型預(yù)測因子〔12〕。研究報(bào)道血清PTH水平與血液透析患者的死亡率呈U形或J形相關(guān)，血清ALP水平升高是血清PTH水平分層的3組之間死亡的危險(xiǎn)因素(低組<150 pg/ml，中組150～300 pg/ml，高組>300 pg/ml)〔13〕。由于ALP在肝臟、腎臟、骨骼、腸道和白細(xì)胞中表達(dá)，除了肝功能障礙和骨代謝異常外，高血清ALP水平可能是炎癥和中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志〔14〕。較高的血清ALP水平與炎癥反應(yīng)有關(guān)，因?yàn)锳LP由IL-6、TNF-α和細(xì)菌脂多糖有效誘導(dǎo)，這些因子通常與炎癥和癌癥誘導(dǎo)的高氧化應(yīng)激有關(guān)〔15〕。

硬化蛋白作為Wnt-輔助受體LRP5/6的抑制劑，在深部礦化骨中，骨細(xì)胞可以檢測到機(jī)械應(yīng)變，當(dāng)骨受到機(jī)械力時(shí)，不會(huì)分泌硬化蛋白，并且會(huì)發(fā)生骨形成。因此，硬化蛋白在骨骼適應(yīng)機(jī)械力中發(fā)揮重要作用。Wnt信號(hào)通路抑制骨吸收并上調(diào)骨保護(hù)素，骨保護(hù)素結(jié)合并抑制核因子κB配體的受體激活劑〔16〕。血透析患者血清硬化蛋白水平升高。Marinho等〔17〕報(bào)道，在血液透析患者中，血清硬化蛋白水平與PTH水平呈負(fù)相關(guān)，與骨密度和骨量呈正相關(guān)。在動(dòng)物模型中，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)與動(dòng)脈和瓣膜鈣化有關(guān)，并且在血管平滑肌細(xì)胞鈣化期間已證實(shí)硬化蛋白表達(dá)增加〔7〕。

到目前為止，有關(guān)骨代謝的數(shù)據(jù)及其在血液透析濾過患者中的評(píng)估是有限的，特別是與血液透析患者相比。TRAP的破骨細(xì)胞特異性5b同種型作為骨吸收的敏感和特異性標(biāo)志物。Bertocchio等〔18〕報(bào)道通過該免疫測定確定激素替代治療6個(gè)月后血清TRAP 5b的變化與所有骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的變化顯著相關(guān)，包括Ⅰ型膠原和無尿的血清N-和C-末端前肽脫氧吡啶，骨質(zhì)疏松患者的TRAP 5b升高。由Niloofar等〔19〕報(bào)道慢性腎衰竭和維持性血液透析患者的TRAP 5b活性沒有顯著增加，但血液透析患者的TRAP 5b濃度顯著高于健康志愿者。Henrich等〔13〕表明存在TRAP 5b活性增加的血液透析患者亞群。在腹膜透析患者中，在Wang等〔16〕的初步報(bào)告中，TRAP 5b與bALP，PTH和骨鈣素高度相關(guān)。Gombos等〔20〕還描述了透析患者(血液透析和腹膜透析)中TRAP 5b和PTH之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性。Deuk等〔8〕發(fā)現(xiàn)血液透析患者血清鈣、磷酸鹽、ALP、骨鈣素、胰島素樣生長因子(IGF)-1、iPTH和骨保護(hù)素水平顯著高于對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn)，血液透析患者的骨形成和骨吸收都有顯著升高的標(biāo)志物，血液透析治療可以增加尿素氮清除率。