方麗，周建松，繆悅嘯，郭婷婷，謝昀燁，武軍，王連平，王漢榮*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021；2.桐鄉(xiāng)市農(nóng)技推廣中心，浙江 桐鄉(xiāng) 314500；3.桐鄉(xiāng)市緣緣食用花卉專業(yè)合作社，浙江 桐鄉(xiāng) 314500)

杭白菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)又稱甘菊、小湯黃、菊茶，為多年生草本菊科植物，原產(chǎn)地為浙江桐鄉(xiāng)，以干燥的頭狀花絮入藥，歷史上曾享有“杭白菊與龍井茶”并提之譽(yù)，是中藥材“浙八味”之一。味道清醇甘美，具有散風(fēng)清熱、平肝明目等功效，為衛(wèi)生部首批批準(zhǔn)的藥食同源的道地藥材之一。

目前，廣泛種植的杭白菊品種為早小洋菊，浙江的杭白菊常年種植面積近4 700 hm2，干花總產(chǎn)量達(dá)到5 000～7 000 t，年均總產(chǎn)值超過5億元，占全年菊花總銷量的近90%[1]。隨著杭白菊需求量的增加，杭白菊的種植規(guī)模不斷擴(kuò)增，伴隨著杭白菊的枯萎病、白絹病及葉枯病等病害發(fā)生率也在不斷增加，同時也出現(xiàn)了由新病原菌引起的已知病害[2]，以及未見報道的新病害[3-4]。本研究針對一種新的引起杭白菊葉枯病的病原菌，經(jīng)鑒定，該病原菌為Didymellasp.。本文通過分析其生物學(xué)特性，以期了解該病原菌的生長和侵染相關(guān)信息，并為該病的防治研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 杭白菊葉斑病病樣的鏡檢

2018—2019年自桐鄉(xiāng)石門鎮(zhèn)杭白菊種植基地采集病樣，杭白菊品種為早小洋菊。將采集的杭白菊葉斑病標(biāo)樣置于紙袋帶回實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 杭白菊葉斑病病原菌的分離與致病性測定

采用常規(guī)組織分離法，切取病健交界處5 mm×5 mm葉片組織，用70%乙醇消毒處理1 min，清水漂洗3次后，置于PSA培養(yǎng)基上，于霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃下黑暗培養(yǎng)，所得菌株產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢純化培養(yǎng)。

參照柯赫氏法則，對寄主植物“早小洋菊”離體和活體葉片進(jìn)行接種。培養(yǎng)5 d的P3-1-1菌株菌塊，用打孔器打取直徑 5 mm的菌絲塊，選擇同等葉位的葉片，用滅菌的針扎3個眼，菌絲塊置于傷口處，用濕潤的無菌脫脂棉保濕，并套上保鮮袋保濕，在25 ℃的XT5401-CD275TJH智能生物人工氣候箱內(nèi)，RH 90%以上，12 h光照/12 h黑暗保濕培養(yǎng)48 h，重復(fù)3次，每天定時觀察記錄發(fā)病情況。對照為無菌絲體的PSA培養(yǎng)基。選取出現(xiàn)類似田間癥狀的葉片進(jìn)行病原菌的再次分離鑒定。

1.3 培養(yǎng)基對菌落生長的影響

配置麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基(MEA)、燕麥培養(yǎng)基(OMA)、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(CA)、理查德培養(yǎng)基(Richard)、察氏培養(yǎng)基(Czapek)、杭白菊莖葉汁(杭白菊枝葉200 g+水1 000 mL+瓊脂20 g)、土豆蔗糖培養(yǎng)基(PSA)、土豆葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)共計8種培養(yǎng)基[5]。當(dāng)菌落直徑長至80 mm時，于菌落邊緣取直徑5 mm的菌絲塊，分別接種于上述不同培養(yǎng)基，每處理設(shè)5個重復(fù)，置25 ℃恒溫培養(yǎng)，隔日觀察菌落形態(tài)，并用十字交叉法測量菌落大小及生長速度、產(chǎn)孢情況和菌落質(zhì)量等。

1.4 培養(yǎng)溫度對菌落生長的影響

培養(yǎng)溫度為5～40 ℃，間隔5 ℃，設(shè)8個溫度梯度。以PSA培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，每處理設(shè)5個重復(fù)，置恒溫下培養(yǎng)，隔日觀察菌落形態(tài)，并用十字交叉法測量菌落大小及生長速度等。

1.5 培養(yǎng)基pH值對菌落生長的影響

以PSA為供試培養(yǎng)基，用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH調(diào)配成4～10共計7個pH值。每處理設(shè)5個重復(fù)，置于25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，隔日觀察菌落形態(tài)，并用十字交叉法測量菌落大小及生長速度等。

1.6 碳源氮源對菌落生長的影響

碳源。以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中，碳源以等質(zhì)量碳素的阿拉伯糖(ALBT)、半乳糖(BRT)、甘露醇(GLC)、甘露糖(GLT)、果糖(GT)、海藻糖(HZT)、木糖(MT)、木糖醇(MTC)、麥芽糖(MYT)、棉子糖(MZT)、葡萄糖(PTT)、乳糖(RT)、蔗糖(ZT)、甘油替代，以無碳為對照，每處理重復(fù)3次。置于25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，隔日觀察并記錄菌落形態(tài)及分生孢子數(shù)量。

氮源。同樣以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用等質(zhì)量氮素的(NH4)2SO4、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、KNO3、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Lso)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、NaNO3、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Try)、胰蛋白胨(Tryptone)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、酵母提取物(Yeast)、尿素和牛肉粉代替，設(shè)無氮為對照，每處理重復(fù)3次。置于25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，隔日觀察菌落形態(tài)并用十字交叉法測量菌落直徑及分生孢子數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 杭白菊葉斑病發(fā)生危害及田間癥狀

杭白菊葉斑病主要發(fā)生在杭白菊的中下部葉片，病斑向上向下蔓延，嚴(yán)重時整株發(fā)病。該病最先在葉面形成不規(guī)則形褪綠小點(diǎn)，后變枯黃色，病健交界清晰，有明顯黃暈，病斑后期變棕黃色至橄欖色，有時有輪紋。在雨后或潮濕天氣時，發(fā)病處可見少量白色霉層，發(fā)病老葉枯死后葉片卷曲懸掛于枝條上不落。6—7月梅雨季和8—9月臺風(fēng)多雨季是發(fā)病高峰，6—10月均可發(fā)病，雨后更容易造成病害的傳播蔓延。

2.2 杭白菊葉斑病菌的分離、鑒定和致病性測定

通過組織分離法多次重復(fù)獲得相同的病原分離物。單孢純化后，該菌在PSA培養(yǎng)基上呈放射狀生長，菌落初為白色，短絨毛狀，后期灰褐色，背面黃褐色。分生孢子器球形或亞球形，棕褐色至黑色，單生，有孔口，185～460 μm；分生孢子，單生、透明、橢圓或卵圓形，有2個油球，一端有微凸起的乳突，1.67～3.31 μm×0.61～1.19 μm。

以病原菌P3-1-1的基因組DNA為模板，采用ITS和TUB的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ITS(MN871865.1)和TUB(MT027253)序列的擴(kuò)展長度分別為522和323 bp。測序后將這些序列提交至NCBI/GenBank，并與GenBank中已登錄的Didymella屬序列進(jìn)行同源性對比，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)該菌與D.bellidis、D.glomerata、D.molleriana和D.rosae等同源性較高的種不能類聚，因此，該菌所歸屬種還有待進(jìn)一步研究。

該病原菌P3-1-1菌塊對杭白菊葉片接種6 d后，病斑如圖1所示，病斑較田間癥狀更加均勻，呈深橄欖色，病斑邊緣清晰，有時有黃暈。再次從該病斑中分離出相同的病原菌，因此，經(jīng)柯赫氏驗(yàn)證，該病原菌為杭白菊葉斑病的病原物。

A—杭白菊葉斑病田間病癥；B—p3-1-1接種6 d后的病癥；C—杭白菊接種對照。

2.3 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響

由圖2可知，菌株P(guān)3-1-1在上述8種不同的培養(yǎng)基上均能生長，其中，以PDA、PSA上生長最好，菌絲生長快速，在PDA上的生長速度可達(dá)1.3 cm·d-1，平均菌落直徑分別為7.93和7.80 cm，這2個處理間無顯著差異；其次為MEA，培養(yǎng)6 d后菌落直徑為6.96 cm(杭白菊莖葉汁培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d后的直徑為7.2 cm，由于病原菌在該培養(yǎng)基上菌絲生長非常稀薄，因此，該培養(yǎng)基不適宜該病原菌的生長)；最差為Richard培養(yǎng)基，平均菌落直徑為5.5 cm。該菌初生菌絲白色，然后菌落呈現(xiàn)肉粉色，最后變?yōu)榛液稚慌囵B(yǎng)4 d后即可產(chǎn)生大量密集分生孢子器，初肉粉色，后為棕褐色至黑色。

圖2 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響

2.4 溫度對病原菌菌絲生長的影響

由圖3可知，菌株P(guān)3-1-1在10～35 ℃均能正常生長，適宜生長溫度為25～30 ℃，在此溫度區(qū)間內(nèi)，平均菌落直徑分別為6.33和6.57 cm；35 ℃時呈下降趨勢，菌落直徑為5.72 cm；在20 ℃以下溫度培養(yǎng)時，菌落直徑平均在5 cm以下，菌落生長緩慢，抑制菌絲生長。

圖3 溫度對病原菌菌絲生長的影響

2.5 pH值對病原菌菌絲生長的影響

由圖4可知，菌株P(guān)3-1-1在pH值4～10的培養(yǎng)基上均能正常生長，平均菌落直徑依次為5.83、5.97、6.13、6.10、5.47、4.98和3.50 cm。當(dāng)pH值為4～7時，菌落直徑均大于5.5 cm，且生長較快；pH值大于7時，菌落直徑迅速變小。由此可見，該菌株適宜在酸性和中性環(huán)境下生長，而堿性環(huán)境不利于菌株的生長。

圖4 pH值對病原菌菌絲生長的影響

2.6 碳源氮源對菌絲生長的影響

由圖5可知，菌株P(guān)3-1-1在15種供試的碳源培養(yǎng)基上菌絲均能生長。其中，以棉子糖(MZT)生長最好，培養(yǎng)5 d后菌落直徑達(dá)5 cm，顯著高于其他碳源處理。其次為甘露糖(GLT)，平均菌落直徑為4.25 cm；木糖(MT)和阿拉伯糖(ALBT)生長較差，菌落直徑分別為2.75和2.70 cm。無碳情況下該菌生長非常稀薄，但菌絲仍能存活，并快速生長。

圖5 碳源和氮源對病原菌菌絲生長的影響

菌株P(guān)3-1-1在23種供試氮源培養(yǎng)基上均能生長。其中，以酵母提取物(Yeast)、苯丙氨酸(Phe)和牛肉粉最好，菌落直徑分別為6.65、6.40和6.35 cm；而該菌株在半胱氨酸(Cys)上生長最差，菌落直徑僅為接種直徑0.5 cm。蛋氨酸(Met)和脯氨酸(Pro)的利用率也較低，菌落直徑分別2.10、2.15 cm，可見這幾種氨基酸不利于該菌的生長。

3 討論

本研究結(jié)果表明，引起杭白菊葉斑病的病原菌為亞隔孢殼屬真菌Didymellasp.，為首次發(fā)現(xiàn)該屬真菌能引起對杭白菊葉斑病。本文研究了該菌的生物學(xué)特性，該病原菌最適宜在PDA或PSA培養(yǎng)基上生長，最佳培養(yǎng)溫度為25～30 ℃，尤以30 ℃為宜；適宜的環(huán)境為酸性兼中性，在pH 4～7生長迅速。該病原菌對棉子糖、甘露糖等作為碳源，以酵母提取物、苯丙氨酸和牛肉粉為氮源時利用率最高。