孫慧琴，軒慧勇，買占海，楊紫嫣，夏利寧

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種典型的革蘭氏陰性無芽孢直桿菌，是人和動(dòng)物腸道菌群的重要組成部分，在衛(wèi)生學(xué)上被作為衛(wèi)生監(jiān)督的指示菌[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大腸桿菌作為條件性致病菌，在一定條件下可引起人體或動(dòng)物胃腸道感染、尿道感染、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎以及敗血型感染等疾病，在細(xì)菌引發(fā)的疾病中居世界首位[2]?？咕幬锏膲毫x擇下使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性和抗生素抗性基因[3]。【本研究切入點(diǎn)】大腸桿菌作為人和動(dòng)物的腸道共棲菌以及耐藥基因貯存庫，可以通過質(zhì)粒和耐藥基因傳遞等多種方式將耐藥性傳播給人類[4]。目前有關(guān)新疆阿克蘇地區(qū)豬源大腸桿菌的耐藥情況鮮見報(bào)道。研究豬源大腸桿菌耐藥性及相關(guān)耐藥基因檢測(cè)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究新疆阿克蘇地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)豬源大腸桿菌耐藥性以及對(duì)耐藥菌株進(jìn)行相關(guān)耐藥基因檢測(cè)。分析該地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥基因攜帶情況，為該地區(qū)大腸桿菌流行病學(xué)研究和臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品來源

2018年11月9～12日，在新疆阿克蘇地區(qū)某規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行豬源肛拭子的采集。通過滅菌棉簽采集豬直腸糞樣于裝有1 mL MH肉湯的2 mL EP管中，共采集1 203份樣品，分離試驗(yàn)用大腸桿菌。

1.1.2 菌株及培養(yǎng)基

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌(ATCC 25922)購自杭州天和微生物試劑有限公司；麥康凱培養(yǎng)基、普通肉湯和Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 藥 品

酰胺醇類：氟苯尼考(FFC/含量98.0%)；喹諾酮類：環(huán)丙沙星(CIP/含量93.9%)、諾氟沙星(NOR/含量99.9%)和恩諾沙星(ENR/含量100%)；氨基糖苷類：鏈霉素硫酸鹽(STR/含量95.0%)、慶大霉素硫酸鹽(GM/含量59.0%)、阿米卡星(AMK/含量99.1%)、安普霉素(APR/含量599 μ/mg)、鹽酸大觀霉素(SPT/含量97.0%)；四環(huán)素類：鹽酸土霉素(OTC/含量89.5%)、鹽酸金霉素(AM/含量90.0%)；β-內(nèi)酰胺類：頭孢噻呋(CEF/含量89.6%)；多肽類：多黏菌素E(CL/含量100%)。

1.2 方 法

1.2.1 大腸桿菌的分離鑒定

用滅菌棉簽輕輕旋轉(zhuǎn)插入豬的肛門內(nèi)，將沾有糞樣的棉簽放入含有1 mL滅菌MH肉湯的2 mL EP管中。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)增菌培養(yǎng)3～6 h，用接種環(huán)蘸取少量增菌液在麥康凱瓊脂平板上劃線，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，挑取平板上粉紅色的單菌落，為疑似大腸桿菌，對(duì)分離到的疑似大腸桿菌進(jìn)行大腸桿菌管家基因uidA的鑒定[5]，uidA基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)：2 ×TaqPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板0.5 μL，dd H2O 8.5 μL，用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)后將目的片段進(jìn)行膠回收并送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。確定為大腸桿菌的菌株，用滅菌的60%甘油保菌，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藥物敏感性

按歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(EUCAST)推薦的瓊脂稀釋法[6]，對(duì)分離得到的大腸桿菌進(jìn)行臨床常用13種抗菌藥物最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)值測(cè)定。以ATCC 25922菌株作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌，結(jié)果判定參照EUCAST標(biāo)準(zhǔn)，以敏感、中介和耐藥3種形式記錄結(jié)果。表1

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.2.3 DNA模板制備與耐藥基因的檢測(cè)

將純化的大腸桿菌復(fù)蘇后劃線接種在麥康凱固體培養(yǎng)基上，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取1個(gè)單菌落至裝有50 μL Tris-EDTA 緩沖液的滅菌八聯(lián)管中。95℃煮沸15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[7～10]合成4大類10種耐藥基因(酰胺醇類floR；喹諾酮類qnrS、qnrD、oqxA、oqxB；氨基糖苷類ant(3″)-Ia、aac(6′)-Ib、rmtB；四環(huán)素類tetM、tetK)，引物序列具體信息見表2。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照分析，將目的片段進(jìn)行膠回收并送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，獲取的序列利用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序進(jìn)行比對(duì)分析，最后確定基因型。表2

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌的分離鑒定

共采集阿克蘇地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)1 203份樣品，經(jīng)過麥康凱培養(yǎng)基2次純化及大腸桿菌管家基因uidA鑒定后，最終分離出大腸桿菌443株，總體分離率為36.8%。

2.2 大腸桿菌藥敏

研究表明，大腸桿菌對(duì)土霉素的耐藥率最高(100%)；對(duì)金霉素(99.0%)、鏈霉素(99.0%)、大觀霉素(95.0%)、恩諾沙星(92.0%)的耐藥率均高于90.0%；對(duì)慶大霉素(81.0%)、氟苯尼考(75.0%)、環(huán)丙沙星(73.0%)的耐藥率均高于70.0%；對(duì)諾氟沙星(48.0%)耐藥率未超過50.0%；對(duì)阿米卡星(4.9%)、安普霉素(16.6%)、頭孢噻呋(23.5%)和多黏菌素E(15.8%)具有較好的敏感性，耐藥率未超過25.0%。圖1

表2 耐藥基因引物序列Table 2 The resistant genes primer sequences

2.3 大腸桿菌多藥耐藥結(jié)果

研究表明，該豬場(chǎng)大腸桿菌對(duì)被檢13種抗菌藥物的多藥耐藥在0耐(0.2%)和3～13耐有分布，以7～9耐為主，占63.6%，且以9耐最高，為26.1%。圖2

2.4 大腸桿菌耐藥基因檢出結(jié)果

研究表明，對(duì)floR(66.4%)和ant(3″)-Ia(66.4%)檢出率最高；對(duì)qnrS(31.4%)和tetM(31.4%)檢出率次之；對(duì)aac(6′)-Ib(17.8%)、oqxA(17.6%)、oqxB(17.4%)、rmtB(4.3%)、qnrD(1.4%)耐藥基因均有檢出，未檢出tetK基因。

3 討 論

3.1 大腸桿菌耐藥

大腸桿菌的分離率僅為36.8%，分離率遠(yuǎn)低于南海辰(83.6%)[9]和程偉華(99.9%)[11]所報(bào)道的菌株分離率，與張瑜(54.0%)[12]報(bào)道的豬源大腸桿菌的分離率較為相近，高于王桂琴[13]報(bào)道的奶牛乳房炎大腸桿菌分離率(7.51%～15.84%)。分析大腸桿菌分離率較低的原因是，11月新疆阿克蘇地區(qū)氣溫較低，低溫季節(jié)不利于菌株的生長(zhǎng)和繁殖[14]，可能會(huì)導(dǎo)致所采樣品中活菌數(shù)量較少；此外，從阿克蘇到烏魯木齊有長(zhǎng)達(dá)1 015.3 km的路途，樣品運(yùn)輸時(shí)間較長(zhǎng)，未能及時(shí)增菌致使部分樣菌失活，可能也是導(dǎo)致分離率較低的原因之一。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該養(yǎng)殖場(chǎng)豬源大腸桿菌對(duì)被檢抗菌藥物呈現(xiàn)高耐藥和高敏感現(xiàn)象。對(duì)酰胺醇類、喹諾酮類和四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥情況嚴(yán)重，耐藥率均高達(dá)90%以上，耐藥率由高到低依次為土霉素>金霉素=鏈霉素>大觀霉素>恩諾沙星>氟苯尼考>環(huán)丙沙星，耐藥結(jié)果高于軒慧勇[15]的報(bào)道，但與李崇[16]報(bào)道的廣西某地區(qū)的耐藥結(jié)果一致。長(zhǎng)期反復(fù)的使用喹諾酮類和酰胺醇類抗菌藥物，盡管采用聯(lián)合用藥方式，但隨著該類抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致該養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類和酰胺醇類的耐藥情況嚴(yán)重，且存在交叉耐藥[17]；由于加大劑量用藥甚至是不按療程用藥，不僅導(dǎo)致藥物殘留，也使菌株產(chǎn)生耐藥。

盡管該養(yǎng)殖場(chǎng)耐藥情況嚴(yán)重，但對(duì)被檢的氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類和多肽類的抗菌藥物具有較好的敏感性，與傅力等[18]報(bào)道的耐藥結(jié)果一致。

由于該養(yǎng)殖場(chǎng)呈現(xiàn)高耐藥和高敏感結(jié)果，所以該養(yǎng)殖場(chǎng)的多藥耐藥集中在7～9耐，并以9耐譜型FFC+CIP+NOR+ENR+STR+GM+SPT+AM+OTC為主，該養(yǎng)殖場(chǎng)可結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，在目前的用藥模式上調(diào)整或合理選用具有較高敏感性的抗菌藥物，結(jié)合其他未使用過的抗菌藥物進(jìn)行聯(lián)合用藥并規(guī)范用藥，在提高治療效果的同時(shí)，也降低該養(yǎng)殖場(chǎng)豬源耐藥大腸桿菌的出現(xiàn)。

3.2 大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)

耐藥基因與耐藥表型基本一致，研究耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)喹諾酮類耐藥率在70.0%～90.0%，對(duì)喹諾酮類耐藥基因檢出率為67.8%(31.4%攜帶qnrS基因、17.6%攜帶oqxA基因、17.4%攜帶oqxB基因、1.4%攜帶qnrD基因)；對(duì)酰胺醇類耐藥率為75.0%，對(duì)酰胺醇類floR基因檢出率為66.4%；對(duì)部分氨基糖苷類耐藥率高達(dá)90.0%以上，對(duì)氨基糖苷類耐藥基因檢出率高達(dá)88.5%(66.4%攜帶ant(3″)-Ia基因、17.8%攜帶aac(6′)-Ib基因、4.3%攜帶rmtB基因)，以上結(jié)果表明，細(xì)菌攜帶的耐藥基因在細(xì)菌產(chǎn)生耐藥中具有重要的作用。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，該養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)酰胺醇類和氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥主要是由于攜帶floR(66.4%)和ant(3″)-Ia(66.4%)耐藥基因所致，對(duì)喹諾酮類抗菌藥物的耐藥主要是由于攜帶qnrS(31.4%)耐藥基因；對(duì)四環(huán)素類的耐藥主要是tetM(31.4%)耐藥基因所致，但對(duì)四環(huán)素類耐藥率高達(dá)95.0%以上，但四環(huán)素類耐藥基因檢出率僅為31.4%，眾所周知，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制十分復(fù)雜，存在多個(gè)同類耐藥基因共同介導(dǎo)一種藥物耐藥的現(xiàn)象，比如對(duì)四環(huán)素類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，不僅是tetM、tetK這2個(gè)基因決定，還有其他基因(如tetA、tetB等)[19]和質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥，甚至是新的耐藥基因(如tetX3、tetX4)[20]、耐藥決定區(qū)基因的變異和新的耐藥機(jī)制同樣介導(dǎo)細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生。研究所選取的10種耐藥基因僅是4大類抗菌藥物中的主要耐藥基因，細(xì)菌對(duì)上述被檢抗菌藥物耐藥的產(chǎn)生可能是由于這些耐藥基因所介導(dǎo)，阿克蘇地區(qū)豬源大腸桿菌很可能還存在其他非耐藥基因介導(dǎo)或未知耐藥基因介導(dǎo)的耐藥機(jī)制。

4 結(jié) 論

新疆阿克蘇地區(qū)某規(guī)?；i場(chǎng)豬源大腸桿菌對(duì)被檢的13種抗菌藥物耐藥結(jié)果呈現(xiàn)高耐藥和高敏感，對(duì)臨床常用抗菌藥物如氟苯尼考、環(huán)丙沙星等耐藥率高達(dá)90%以上；對(duì)阿米卡星、多黏菌素E等具有較好的敏感性；多藥耐藥集中在6～9耐，主要以攜帶floR和ant(3″)-Ia基因?yàn)橹?。因此，該豬場(chǎng)在治療大腸桿菌病時(shí)應(yīng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，合理輪換使用抗菌藥物，同時(shí)加強(qiáng)環(huán)境消毒意識(shí)，減少菌株間耐藥性的傳播。