張亞濤，包曉瑋，曾蘭君，魏晨業(yè)，何夢(mèng)夢(mèng)，金渭荃

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】刺山柑(CapparisspinosaL.)白花菜科山柑屬植物，又名野西瓜、老鼠瓜、槌果藤、菠里克果等，主要分布于中東地區(qū)和地中海國(guó)家以及中國(guó)新疆、甘肅、西藏等地[1-3]。刺山柑是藥食兩用植物，根皮、葉以及果實(shí)均可入藥，味辛苦，性溫，研究表明，刺山柑果實(shí)提取物在抗菌、抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤、降血糖、降血酯、利尿、治療痛風(fēng)和風(fēng)濕等方面均有一定的功效[4-12]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】陳義磊等[13]證明了刺山柑果實(shí)中的黃酮類物質(zhì)具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用；張瑜[14]、高瑩瑩[15]、包曉瑋等[16]利用動(dòng)物試驗(yàn)，證明刺山柑黃酮具有抗炎、鎮(zhèn)痛效果；楊濤等[17]以抗炎、鎮(zhèn)痛活性為指標(biāo)篩選刺山柑果實(shí)乙醇提取物、石油醚、乙酸乙酯萃取部位和水溶性部位得出刺山柑果實(shí)具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用；蔣思思等[18]通過(guò)小鼠足腫脹試驗(yàn)、二甲苯致小鼠耳廓腫脹動(dòng)物試驗(yàn)證明刺山柑果實(shí)水提取物具有良好的抗急性炎癥作用；朱曉薇等[19]研究刺山柑提取物不同極性部位的降血糖作用，認(rèn)為刺山柑果實(shí)正丁醇提取物對(duì)鏈脲佐菌素所致的高血糖有著較好的活性；郭艷等[20]對(duì)刺山柑果實(shí)的5個(gè)化學(xué)部位分離，得出抗炎活性部位以及致敏部位，乙酸乙酯部位、甲醇部位具有顯著的抗炎活性，乙酸乙酯部位具有中度致敏性，甲醇部位無(wú)致敏性。【本研究切入點(diǎn)】有關(guān)刺山柑提取物的抗炎鎮(zhèn)痛活性研究報(bào)道很多，但有關(guān)刺山柑正丁醇萃取部位抗炎、鎮(zhèn)痛活性分析的研究報(bào)道未見(jiàn)。研究選取刺山柑乙醇提取物正丁醇部位進(jìn)行抗炎鎮(zhèn)痛活性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以總黃酮提取量為指標(biāo)采用超聲波輔助提取法并結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化乙醇提取物最佳工藝，并將乙醇提取物浸膏通過(guò)萃取得到正丁醇部位。采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹、小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性分析正丁醇萃取部位抗炎效果；以熱板法和醋酸扭體分析正丁醇萃取部位鎮(zhèn)痛效果。研究刺山柑果實(shí)乙醇提取物正丁醇部位的抗炎鎮(zhèn)痛活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用刺山柑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 動(dòng)物

KM小鼠200只，清潔級(jí)，體重(20±2)g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK(新)2018003)。

1.1.2 藥材與試劑

刺山柑成熟果實(shí)，購(gòu)自新疆烏魯木齊。刺山柑 (新疆吐魯番野生果實(shí)) 、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所, ≥97%) 、阿司匹林(Aspirin,ASP)(山東新華制藥股份有限公司，批號(hào)：H20030396)、地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀集團(tuán)湖北天耀藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H42020019)、氯化鈉注射液(河南科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H41023828)、氫氧化鈉、硝酸鈉、硝酸鋁、三氯化鋁、冰醋酸、二甲苯、伊文思蘭、CMC-Na等試劑(所用試劑均為分析純)。

1.1.3 儀器

搖擺式高速中藥粉碎機(jī)DFY-500(溫嶺市大德中藥器械限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9240A(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)超聲波清洗器KQ5200DE(昆山市超聲儀器有限公司)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)TU-1810(北京普析通用儀器責(zé)任有限公司)、AL204-IC電子天平 (梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， (上海亞榮生化儀器廠) 、RB-200智能熱板儀(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)

以蘆丁標(biāo)品為對(duì)照品，掃描200～800 nm，選定510 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)原理, 選擇乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C), 利用Deign-Expert.V8.0.6以提取率為優(yōu)化目標(biāo), 進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行后, 采用Design Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合, 求得回歸方程, 預(yù)測(cè)刺山柑中黃酮的最佳工藝參數(shù)。表1

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

1.2.2 供試品溶液的制備

以總黃酮提取量為指標(biāo)采用超聲波輔助提取法并結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化最佳提取工藝，并制備刺山柑乙醇提取物浸膏，取正丁醇部位浸膏用1%CMC-Na溶液配制正丁醇部位高劑量組、正丁醇部位中劑量組、正丁醇部位低劑量組和地塞米松、阿司匹林陽(yáng)性對(duì)照，模型組均用0.9%NaCl(NS)溶液[20]。

1.2.3 抗炎試驗(yàn)1.2.3.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)

取小鼠50只，雌雄對(duì)半，隨機(jī)分為5組，每組10只。分別按正丁醇部位高(46.4 mg/(kg·d))、中(23.2 mg/(kg·d))、低(11.6 mg/(kg·d))試驗(yàn)組及模型(NS)和陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松10 mg/(kg·d))，0.1 mL/10g體重。每天1次給藥7 d，末次給藥1 h后，均勻涂抹二甲苯30 μL于小鼠右耳，左耳作為對(duì)照。致炎20 min后處死小鼠，取下雙耳用直徑8 mm的打孔器取相同部位耳廓，稱重，耳片重量之差為腫脹度，計(jì)算各試驗(yàn)?zāi)[脹度抑制率。

腫脹抑制率(%)=

1.2.3.2 小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)

取小鼠50只，雌雄對(duì)半，給藥劑量和方法與1.2.3.1相同。分別于末次給藥1 h后，尾靜脈注射0.5%伊文思蘭(0.1 mL/10g)，立即腹腔注射0.6%醋酸溶液(0.3 mL/只)。20 min后，處死小鼠，剪開(kāi)腹腔，用5 mL 0.9% NaCl溶液(NS)沖洗腹腔數(shù)次，收集洗滌液于5 mL容量瓶，用NS定容至刻度，3 000 r/min離心5 min，以NS為模型，于590 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的吸收度(OD值)，記錄結(jié)果并計(jì)算毛細(xì)血管通透性抑制率。

毛細(xì)血管通透性抑制率(%)=

1.2.4 鎮(zhèn)痛試驗(yàn)1.2.4.1 熱板法

取篩選合格雌性小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只。分別按正丁醇部位高(46.4 mg/kg·d)、中(23.2 mg/(kg·d))、低(11.6 mg/(kg·d))試驗(yàn)組及模型(NS)和陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林(0.080 g/(kg·d))，0.1 mL/10g體重。分別于末次給藥后30、60、90、120 min按上述測(cè)定法分別測(cè)定痛閾值，計(jì)算其痛閾提高百分率。

痛閾值提高率(%)=

1.2.4.2 醋酸扭體法

取小鼠50只，雌雄對(duì)半，試驗(yàn)分組及給藥劑量和方法與1.2.4.1相同。末次給藥后l h，根據(jù)體重腹腔注射0.6%醋酸溶液0.l mL/10g，5 min后，觀察并記錄15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體次數(shù)，按下式計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率。

扭體反應(yīng)抑制率(%)=

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，用Deign-Expert.V8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)；用SPSS19.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面

研究表明，對(duì)其響應(yīng)值與各內(nèi)部因素進(jìn)行回歸擬合，黃酮提取量與各因素變量的二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=+30.68-0.15A+0.51B+0.61C+0.34AB-0.23AC-0.81BC-0.62A2-0.62B2-1.13C2。表2

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Test design and results

研究表明, 二次回歸方程整體模型極顯著 (P<0.01) , 同時(shí)失擬項(xiàng)不顯著, 該方程可以預(yù)測(cè)工藝方案。經(jīng)Deign-Expert.V8.0.6軟件處理, 得到了乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖。各因素交互作用對(duì)果膠提取率的影響可由等高線圖看出來(lái), 等高線圖形的形狀可以直觀的反映出交互影響的強(qiáng)弱, 等高線中圓形代表作用不顯著, 橢圓形代表作用顯著[21,22]。乙醇濃度與提取時(shí)間、乙醇濃度與提取溫度、提取時(shí)間與提取溫度的交互作用均顯著, 提取時(shí)間與乙醇濃度、提取時(shí)間與提取溫度、液料比與乙醇濃度的交互作用均不顯著。刺山柑黃酮提取對(duì)提取溫度的變化敏感。影響刺山柑黃酮提取率的各因素主次順序?yàn)樘崛囟?提取時(shí)間>提取乙醇濃度，且提取溫度,提取時(shí)間的影響達(dá)到極顯著的水平。圖1～3

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)得到的二次回歸方程，經(jīng)Deign-Expert.V8.0.6軟件處理，得到超聲波輔助法提取刺山柑黃酮的最優(yōu)提取參數(shù)條件為：提取溫度71.77℃，提取時(shí)間42.76 min，59.21%乙醇濃度，在此條件下刺山柑黃酮的得率理論上可達(dá)到30.808 5 mg/g。調(diào)整工藝參數(shù)為提取溫度72℃，提取時(shí)間43 min，60%乙醇濃度。在此參數(shù)下進(jìn)行5組驗(yàn)證性試驗(yàn)，5次平均值黃酮提取率為30.791 9 mg/g，與理論值較為接近，RSD值為0.11%(n=5)，試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。表3～9

表3 最優(yōu)方案驗(yàn)證性Table 3 Experimental results of optimal scheme validation (n=5)

2.3 抗 炎

2.3.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹

研究表明，刺山柑正丁醇部位不同劑量對(duì)甲苯致小鼠耳郭腫脹的影響不同，陽(yáng)性對(duì)照藥(地塞米松)、正丁醇部位的高、中劑量組對(duì)模型(NS)組極顯著(P<0.01)，正丁醇部位低劑量組不顯著。表4

表4 刺山柑正丁醇部位下二甲苯致小鼠耳郭腫脹變化Table 4 Effects of n-butanol of capers on ear swelling induced by xylene in mice

2.3.2 小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性

研究表明，刺山柑正丁醇部位不同劑量對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性具有不同影響，陽(yáng)性對(duì)照藥(ASP)、正丁醇部位的高、中劑量組對(duì)模型(NS)組極顯著(P<0.01)，正丁醇部位低劑量組不顯著。表5

表5 刺山柑正丁醇部位下小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性變化Table 5 Influence of capillaries permeability in mice abdominal cavity by n-butanol of capillaries

2.4 鎮(zhèn) 痛

2.4.1 熱板法鎮(zhèn)痛

研究表明，刺山柑正丁醇部位不同劑量對(duì)小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)痛閾的影響，相對(duì)模型(NS)組，給藥組均能明顯提高小鼠熱板法試驗(yàn)的痛閾，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，鎮(zhèn)痛效果越明顯，陽(yáng)性對(duì)照組和高劑量組起效快，其他試驗(yàn)組均顯示一定的鎮(zhèn)痛作用，正丁醇部位各劑量組持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。

表6 刺山柑正丁醇部位下小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)痛閾變化Table 6 Effects of capers n-butanol on pain threshold of hot plate analgesia test in mice

2.4.2 醋酸扭體法試驗(yàn)

研究表明，刺山柑正丁醇部位不同劑量對(duì)小鼠醋酸扭體反應(yīng)具有一定的影響，陽(yáng)性對(duì)照組(ASP)、正丁醇部位的高、中劑量組對(duì)模型(NS)組極顯著(P<0.01)，正丁醇部位低劑量組顯著(P<0.05)。表7

表7 刺山柑正丁醇部位下醋酸扭體反應(yīng)的鎮(zhèn)痛變化Table 7 Analgesic experiment of capers with n-butanol on acetic acid writhing

3 討 論

試驗(yàn)在提取時(shí)間43 min，60%乙醇濃度，料液比1∶20，提取溫度72℃，超聲次數(shù)2次的條件下，刺山柑果實(shí)總黃酮的提取量為30.79 mg/g，提取率為3.079%。比王巖巖[23]選取刺山柑果實(shí)在纖維素酶輔助下提取刺山柑總黃酮(提取率為2.47%)的效率更高。與包曉瑋[16]選取刺山柑果實(shí)室溫下(70%乙醇濃度、液料比20∶1、超聲60 min)提取總黃酮(提取率2.21%)相比，具有增加溫度因素，升溫促進(jìn)滲透和擴(kuò)散，提高提取效率。刺山柑黃酮提取量的因素主次順序?yàn)樘崛囟?提取時(shí)間>提取乙醇濃度，響應(yīng)面交互作用分析、預(yù)測(cè)最佳條件，驗(yàn)證確定最佳工藝。在抗炎試驗(yàn)中，正丁醇部位高劑量組對(duì)耳廓腫脹抑制率(33.33%)比楊濤等[17]山柑果實(shí)醇提物及不同萃取部位的抑制率都高(最高為32.2%)；對(duì)毛細(xì)血管通透性抑制率(12.8%)，皆表現(xiàn)為極顯著，刺山柑乙醇提取物正丁醇部位具有顯著抗炎活性。在鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中分別為和試驗(yàn)中，正丁醇部位高、中劑量組能有效(P<0.01)提高小鼠熱板痛閾、減少醋酸致小鼠扭體的次數(shù)，說(shuō)明刺山柑乙醇提取物正丁醇部位具有顯著外周性鎮(zhèn)痛作用和中樞性鎮(zhèn)痛作用。

4 結(jié) 論

最佳工藝為提取時(shí)間43 min，60%乙醇濃度，料液比1∶20，提取溫度72℃，超聲次數(shù)2次，在此條件下黃酮提取量為30.791 9 mg/g。通過(guò)二甲苯致小鼠耳廓腫脹、小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性考察正丁醇萃取部位抗炎效果；以熱板法和醋酸扭體考察正丁醇萃取部位鎮(zhèn)痛效果。刺山柑果實(shí)的乙醇總提物的正丁醇萃取部位的抗炎、鎮(zhèn)痛效果較為顯著。