吳纖愫，鄭平安，周勇，陳才軍

1. 舟山市食品藥品檢測(cè)檢驗(yàn)研究院（舟山 316021）；2. 浙江海力生生物科技股份有限公司（舟山 316021）

香蘭素、乙基香蘭素、甲基香蘭素、麥芽酚和乙基麥芽酚等是食品中重要的增香劑。增香劑具備彌補(bǔ)食品本身味道缺陷、賦予或加強(qiáng)食品生動(dòng)滋味的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品，特別是乳制品、固體飲料、保健食品、特醫(yī)食品中[1-2]。添加食品級(jí)香料不會(huì)出現(xiàn)食品質(zhì)量安全問題，但如果超標(biāo)使用或者帶入，則會(huì)對(duì)人體造成潛在性危害，嬰幼兒、危重患者及圍手術(shù)期病人是對(duì)有害物質(zhì)最敏感的群體[3-4]。特醫(yī)食品是為滿足進(jìn)食受限，消化吸收障礙或代謝紊亂等這些最敏感的群體，專門加工配制而成的配方食品[5-7]。因此建立特醫(yī)食品中香精香料的檢測(cè)方法具有重要意義。

國(guó)內(nèi)較多文獻(xiàn)中有關(guān)于香蘭素、乙基香蘭素等添加劑的檢測(cè)方法，主要有毛細(xì)管電泳法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氫火焰-氣相色譜法、伏安法、氣相色譜-質(zhì)譜法等，多是應(yīng)用于乳制品、牛奶、飲料等食品中[8-9]。對(duì)這些樣品而言，成分都過為單一，并沒有針對(duì)特醫(yī)食品的檢測(cè)方法，在樣品處理方法和檢測(cè)的靈敏度與特醫(yī)食品存在差異。在特醫(yī)食品中需要考察基質(zhì)效應(yīng)對(duì)含量準(zhǔn)確性的影響，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)均不能滿足具有復(fù)雜基質(zhì)的特醫(yī)食品檢測(cè)的需要。最新的有關(guān)文獻(xiàn)中有GC-MS和LC-MS這2種檢測(cè)技術(shù)來檢測(cè)食品中香料，但前處理操作復(fù)雜，儀器運(yùn)行成本較為昂貴，不能很好滿足基層檢測(cè)單位的實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。因此，需要對(duì)上述方法進(jìn)行優(yōu)化和建立簡(jiǎn)單易行的固相萃取檢測(cè)技術(shù)來滿足特醫(yī)食品中食用香精香料的檢測(cè)需要[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品；香蘭素（純度99.9%）、香草酸（純度98.9%）、愈創(chuàng)木酚（純度98.9%）、4-羥基苯甲酸（純度99.9%）（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；乙基香蘭素（純度98.5%）（美國(guó)Sigma）；甲基香蘭素（純度98%）、乙基麥芽酚（純度98%）、鄰香草醛（純度97%）（加拿大TRC公司）；麥芽酚（純度99.8%）、丁香酚（純度99.0%）、香豆素（純度99.7%）（德國(guó)Dr. Ehrenstorfer）。

甲醇（色譜純，德國(guó)Meker公司）；磷酸（GR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；色譜柱Poroshell 120 SB-Aq（4.6 mm×100 mm，2.7 μm，美國(guó)安捷倫），Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭科技（上海）股份有限公司）；固相萃取柱Welchrom?C18E（150 mg/6 mL）、Welchrom?P-SAX（150 mg/6 mL）、Welchrom P-WAX（150 mg/6 mL）（月旭科技（上海）股份有限公司），Poly-Sery HLB（500 mg/6 mL，上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司），Captive EMR-Lipid小柱（600 mg/6 mL，美國(guó)安捷倫公司）；防交叉污染固相萃取裝置（SUPELCO VISIPREP 24TM DL，美國(guó)Supelco公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液的配制

將11個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品分別精密稱取至20 mL容量瓶中，加甲醇配制成單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液。質(zhì)量濃度分別為2.572 5，3.010 0，3.036 2，3.305 1，2.655 5，2.732 3，4.049 8，2.557 3，3.048 6，3.198 7和4.812 7 mg/mL，于-18 ℃冷凍保存。分別精密移取2.5 mL單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液，用甲醇準(zhǔn)確定容至50 mL容量瓶，混勻后得到混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1；精密移取1.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1，用甲醇準(zhǔn)確定容至50 mL容量瓶，混勻得到混合標(biāo)準(zhǔn)中間液2。精密移取11種標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00，0.50，0.20，0.10，0.05和0.02 mL，分別置于20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 SB-Aq（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；DAD檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣體積5 μL；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；流動(dòng)相：A 0.1%磷酸水溶液；B甲醇；梯度洗脫條件見表1。

1.2.3 樣品制備

樣品溶液制備：固體樣品用研缽研磨混合均勻，稱取1 g置于刻度比色管中，加10 mL甲醇，渦旋1 min，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心10 min，靜置分層，取5.0 mL上清液，供凈化用（液體樣品取1 g置于刻度比色管，加甲醇至10 mL，與固體樣品同法制備）。

文言文是考試中的重頭戲，也是我們常說的“學(xué)生有三怕”之一。我們?cè)诮淌谡n內(nèi)文言文的同時(shí)，雖然能讓學(xué)生積累到不少有用的文言字詞，但如果不做上幾篇課外文言文，似乎也難以招架考試，而做課外文言文的目的主要在于熟悉題型，培養(yǎng)考感。

1.2.4 樣品凈化

Captive EMR-Lipid小柱處理方法：直接取上清液加至柱管內(nèi)，上樣接收，重力自流，抽干小柱，接收液用氮吹儀35 ℃吹至溶液不到1 mL，用甲醇定容至1 mL。過0.45 μm濾膜濾過，濾液供高效液相色譜測(cè)定。

SPE固相萃取小柱處理方法：分別用5 mL甲醇、5 mL超純化水活化和平衡SPE柱，將上清液全部上柱，用8 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮吹儀35 ℃吹至2 mL左右溶液，加甲醇定容至2 mL。

1.2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

稱取樣品（全營(yíng)養(yǎng)配方粉、高脂配方粉、勻漿膳（高纖維）、營(yíng)養(yǎng)混懸液）各3份，每份1 g，置于刻度比色管中，分別加入2.0和0.1 mL混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液1以及2.0 mL混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液2，分別作為高、中、低濃度回收率，加甲醇至10 mL，按樣品制備的方法制成加標(biāo)回收溶液，待測(cè)定。

2 色譜條件的優(yōu)化和選擇

取11種香料標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，通過紫外可見分光光度計(jì)對(duì)每個(gè)單標(biāo)進(jìn)行最大波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)280 nm吸收波長(zhǎng)處，各分析物的響應(yīng)、峰型、分離度均有較好效果?？疾旒状?水、乙腈-水混合溶劑體系及其添加0.1%磷酸、0.1%三氟乙酸時(shí)對(duì)11種香料的色譜行為影響。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相且以1.2.2的梯度條件洗脫待測(cè)物質(zhì)的分離度及峰形較好。

同時(shí)測(cè)定11種香料化合物對(duì)色譜柱的分離度等條件要求較高，難度在于目標(biāo)物物理化學(xué)性質(zhì)很接近，彼此間的微小差異不明顯，流動(dòng)相中甲醇初始體積分?jǐn)?shù)的改變會(huì)導(dǎo)致色譜峰出峰順序波動(dòng)較大，且使用不同的色譜柱檢測(cè)11種香料化合物，出峰順序也不盡相同，普通色譜柱難以在較短的保留時(shí)間內(nèi)分離。在儀器、流動(dòng)相、柱溫、進(jìn)樣量等條件相同的情況下，比較Agilent Poroshell 120 SB-AQ（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）和Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）等不同類型、不同粒徑色譜柱對(duì)11種人工合成香料的分離情況。在梯度條件下，Ultimate LP-C18上除乙基香蘭素和香豆素外其他的香料化合物均達(dá)到分離目標(biāo)，但出峰時(shí)間較長(zhǎng)，丁香酚流出時(shí)間95 min左右，不適用于目標(biāo)成分較多的分析測(cè)試；Agilent Poroshell 120 SB-AQ則在20 min內(nèi)將目標(biāo)峰全部流出，且11種目標(biāo)被測(cè)組分與相鄰物質(zhì)分離度良好。通過實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期使用發(fā)現(xiàn)AQ柱柱效高、重現(xiàn)性好，可耐受高水相、低pH及高柱溫的極端條件，可匹配高效液相色譜儀（HPLC）和超高效液相色譜儀（UPLC），快速且高效地完成11種目標(biāo)物質(zhì)的色譜分離，提高檢測(cè)效率，適用于批次較大、樣品基質(zhì)復(fù)雜的基層實(shí)驗(yàn)室使用。圖2為最佳色譜條件下11種人工香料化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖2 Agilent Poroshell 120 SB-AQ對(duì)11種人工合成香料的分離色譜圖

表2 2種色譜柱的性能區(qū)別

3 結(jié)果與討論

3.1 5種SPE固相萃取柱對(duì)11種香料化合物的加標(biāo)回收率比較

由于特醫(yī)食品中蛋白質(zhì)含量較高，用水對(duì)樣品進(jìn)行浸泡處理時(shí)會(huì)帶入大量水溶性蛋白質(zhì)，因此測(cè)定前需對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理。根據(jù)香蘭素、乙基香蘭素、甲基香蘭素、愈創(chuàng)木酚、香草酸、丁香酚、麥芽酚、乙基麥芽酚、香豆素、4-羥基苯甲酸、鄰香草醛這11種人工合成香料弱酸性的特質(zhì)[11]，設(shè)計(jì)多種固相萃取小柱[12-13]，分別是Welchrom? P-SAX混合強(qiáng)陰離子小柱、Welchrom P-WAX混合弱陰離子小柱、Poly-Sery HLB親水-親脂小柱[14]、Welchrom C18E封尾的C18小柱和Captive EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除過濾柱，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行有效的分離、凈化和富集。通過加入混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1（1.0 mL）直接上柱，甲醇10 mL洗脫、35 ℃氮吹至近干，定容1 mL，過0.45 μm濾膜，按1.2.2色譜條件上機(jī)檢測(cè)，測(cè)定5種小柱凈化處理后回收率。Welchrom C18E柱、Poly-Sery HLB柱和Captive EMR-Lipid小柱混標(biāo)過柱回收率均為滿意。結(jié)果見表3。

3.2 樣品加標(biāo)過固相萃取柱的回收率影響

選擇特醫(yī)食品中全營(yíng)養(yǎng)配方粉和營(yíng)養(yǎng)混懸液各1 g，加1.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1，加甲醇至10 mL，與1.2.3和1.2.4樣品前處理方法同法處理過柱，見表4。Poly-Sery HLB柱的固體樣品回收率為22%～63%，Welchrom C18E小柱作為分散固相萃取基質(zhì)難以完全去除脂質(zhì)，過柱后的樣液有部分乳狀物積蓄，難以濾過，對(duì)儀器損害較大，需復(fù)溶至2～5 mL，想要達(dá)到檢出限需加倍稱樣量。Captive EMR-Lipid小柱有較好回收率和重復(fù)性，快速、簡(jiǎn)便，滿足檢測(cè)要求且回收率良好，對(duì)樣品基質(zhì)選擇范圍更廣泛，操作過程中上樣無需活化和平衡，樣液直接加載至Captive EMR-Lipid小柱以吸附脂肪和磷脂及蛋白質(zhì)，除雜凈化效果好，可明顯提高樣品前處理工作效率，適用于基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)特醫(yī)食品的初篩。試驗(yàn)均使用Captive EMR-Lipid為固相萃取小柱進(jìn)行處理。

表3 不同類型固相萃取小柱對(duì)11種人工合成香料的回收率結(jié)果 %

表4 不同固相萃取方法對(duì)樣品中11種人工合成香料回收率影響

3.3 不同溶劑對(duì)特醫(yī)食品基質(zhì)中11種人工合成香料的提取回收率影響

考慮到11種人工合成香料均極性較大，易溶于醇，試驗(yàn)用甲醇、甲醇-水（不同比例）、乙醇、乙腈等為提取溶劑，以常見全營(yíng)養(yǎng)配方粉為研究對(duì)象，考察回收率影響。由于廠家會(huì)采用一些分子包埋技術(shù)來保護(hù)營(yíng)養(yǎng)粉配方成分[15]，因此在加入提取溶劑前，先添加適量水分來浸潤(rùn)樣品，添加甲醇提取以增加待測(cè)組分的包埋釋放；因目標(biāo)化合物有酚羥基基團(tuán)，具有弱酸性[16]，考慮其提取凈化過程在酸性條件下進(jìn)行。由圖3和圖4可知，選用乙醇、乙腈雖可沉淀蛋白，降低干擾物的響應(yīng)，但目標(biāo)物隨之流失。以甲醇為提取溶劑時(shí)，可獲得理想的回收率；選擇不同酸度、不同比例甲醇溶液則對(duì)4-羥基苯甲酸、乙基麥芽酚、鄰香草醛這3種香料影響較大，回收率隨著甲醇比例增加而明顯提高，且重現(xiàn)性好。確定甲醇為提取溶劑。

圖3 不同溶劑提取11種人工合成香料的回收率結(jié)果

圖4 不同比例的甲醇和不同酸度的甲醇提取11種人工合成香料的回收率結(jié)果

3.4 11種香料化合物萃取效果的優(yōu)化

3.4.1 甲醇提取量的選擇

考察10 mL甲醇直接提取和10 mL甲醇分2次提?。? mL、5 mL），取5.0 mL上清液氮吹至1 mL，結(jié)果表明，2種提取方式結(jié)果差別不大，直接提取混標(biāo)過柱回收率較好，可達(dá)95%～101%。

3.4.2 萃取時(shí)間的優(yōu)化

選擇不同的超聲時(shí)間萃取，取上清液過EMR-Lipid小柱，洗脫液濃縮后，濾過，檢測(cè)。圖5表明，11種人工合成香料在不同超聲時(shí)間上的萃取結(jié)果，最佳萃取時(shí)間10 min。

綜合比較混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1（各取2.0 mL）加標(biāo)水平下各因素組合的回收率和凈化效果，使用10 mL甲醇作為提取劑，漩渦1 min，超聲10 min，以10 000 r/min離心10 min，5.0 mL上清液直接上樣過EMR-Lipid柱，重力自流，可獲得良好提取、凈化效果。

圖5 不同萃取時(shí)間下11種人工合成香料的回收率結(jié)果

3.5 Captive EMR-Lipid凈化及濃縮步驟的優(yōu)化

試驗(yàn)采用通過式凈化方式將提取溶液加載到EMR- Lipid固相萃取柱[17]，針對(duì)脂類物質(zhì)進(jìn)行必要的凈化，直接收集流出液完成凈化，取定量濃縮管，用氮吹儀濃縮至少于1 mL，定容至1 mL，達(dá)到最低檢出限。香料屬于揮發(fā)性物質(zhì)，會(huì)隨著溫度升高而揮發(fā)，故分別以35，40和45 ℃為氮吹溫度考察11種人工香料化合物的回收率，以35 ℃為氮吹溫度時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)幾乎沒有損失，確定最佳氮吹溫度35 ℃。見圖6。

圖6 氮吹儀水浴溫度對(duì)11種人工合成香料的回收率影響

3.6 液-液萃取法和Captive EMR-Lipid柱的檢測(cè)結(jié)果比較

利用香蘭素等成分在酸性和堿性溶液中分別以鹽和分子形式存在的特點(diǎn)，采用液液萃取的方法進(jìn)行前處理，乙醚液萃取加酸溶液的樣品，棄去水層；加一定量NaOH溶液萃取后，棄去乙醚層；加酸調(diào)pH至酸性，用乙醚萃取后，揮干乙醚，用甲醇定容，濾過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣檢測(cè)，與Captive EMR-Lipid柱的檢測(cè)結(jié)果比較，樣品加標(biāo)回收率為21.9%～76.9%。

3.7 不同類型的特醫(yī)食品加標(biāo)回收率結(jié)果

按特醫(yī)食品脂肪、蛋白質(zhì)含量的高低和劑型的不同，在4種樣品中添加不同濃度的各分析物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，3種添加水平的平均回收率為84%～107%。所得結(jié)果見表5。

表5 各成分的回收率及精密度結(jié)果（n=3）

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接表5

化合物 添加水平/(μg·mL-1) 全營(yíng)養(yǎng)配方粉 高脂配方粉 勻漿膳 (高纖維型) 營(yíng)養(yǎng)混懸液回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/%鄰香草醛 404.980 0 98 2.9 92 2.9 94 2.3 102 2.6 20.249 0 90 0.7 90 0.7 96 1.7 95 6.3 8.099 6 87 3.4 86 1.0 85 0.5 84 6.6香豆素 255.730 0 104 0.1 101 1.0 101 2.6 96 3.6 12.786 5 90 1.8 94 0.6 92 1.6 94 2.3 5.114 6 87 2.2 98 0.4 87 0.6 92 1.2乙基香蘭素 304.860 0 104 1.3 93 0.9 92 2.1 96 3.0 15.243 0 100 2.9 96 1.4 98 0.99 100 0.3 6.097 2 89 0.4 84 2.2 84 0.5 86 3.3甲基香蘭素 319.870 0 96 2.9 98 2.7 101 3.1 95 1.0 15.993 5 87 0.6 107 3.1 84 2.1 86 0.3 6.397 4 103 3.3 86 0.9 89 2.6 87 4.6丁香酚 481.270 0 100 2.6 86 2.1 90 1.9 94 0.6 24.063 5 88.6 2.4 100 1.4 87 2.5 88 2.3 9.625 4 107 2.7 90 0.8 89 3.8 87 1.0

4 結(jié)論

針對(duì)特醫(yī)食品基質(zhì)通過不同種固相萃取柱凈化后的加標(biāo)回收率考察試驗(yàn)，選擇對(duì)特醫(yī)食品基質(zhì)凈化效果較好的Captive EMR-Lipid（增強(qiáng)型脂質(zhì)去除過濾柱），并結(jié)合高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，DAD光譜圖定位，方法具有回收率高、操作簡(jiǎn)便快速、易于批處理等優(yōu)點(diǎn)，可用于特醫(yī)食品中香蘭素等11種人工合成香料的檢測(cè)分析。