劉生，徐偉琴，鄧少歡，惠愛玲，張文成

合肥工業(yè)大學/農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心（合肥 230009）

蛹蟲草又名北冬蟲夏草，與冬蟲夏草是同一種藥用真菌，是由蛹蟲草真菌寄生于鱗翅目昆蟲的蛹而獲得的子座、菌核復合體[1]，是我國特有的名貴藥用真菌，具有很高的藥用價值，與中華“千年國藥”“藥中之王”冬蟲夏草有著相同的活性成分和藥理功效。因冬蟲夏草價格昂貴，蛹蟲草一度作為冬蟲夏草替代品。

現(xiàn)在市面上有蛹蟲草保健酒、飲料、含片等產(chǎn)品。黃小丹等[2]以蛹蟲草菌絲體發(fā)酵液為原料，調(diào)制出具有蟲草和番茄混合味的保健飲料；賀瑩等[3]以蛹蟲草為原料，添加其他輔料，制成具有蛹蟲草特殊風味的新型復方蛹蟲草含片。由于野生蟲草受生長環(huán)境的影響，且隨著近年來人們的過度采摘，野生蛹蟲草已經(jīng)遠遠不能滿足人們的需求。隨著科技的不斷發(fā)展和人們對蛹蟲草研究的深入，人工種植的蛹蟲草已廣泛存在于國內(nèi)的安徽、湖北、云南、山東等地，但是目前主要產(chǎn)地蛹蟲草質量參差不一。金莉莉等[4]比較了幾種不同蟲草中蟲草素含量順序，發(fā)現(xiàn)蠶蛹蟲草（3.68 mg/g）＞小麥蟲草（2.86 mg/g）＞大米蟲草（2.63 mg/g）＞頭狀蟲草（0.95 mg/g）；腺苷順序為蠶蛹蟲草（1.11 mg/g）＞小麥蟲草（0.79 mg/g）＞頭狀蟲草（0.64 mg/g）＞大米蟲草（0.09 mg/g）。李琴等[5]比較了湖北、云南、實驗室自己培養(yǎng)的3種蟲草差異，結果發(fā)現(xiàn)湖北地區(qū)的蟲草素含量為6.04 mg/g，實驗室通過不同硒濃度梯度培養(yǎng)的蛹蟲草中蟲草素含量在25.93～26.93 mg/g之間。大量的研究證明不同來源的蛹蟲草存在質量差異，且隨著人工種植規(guī)模的擴大，當前首要面臨的問題就是質量控制。蟲草素含量一般作為衡量蛹蟲草質量的標準，人們對蟲草素的研究較多，對N-6-2羥乙基腺苷和其他核苷類活性物質研究較少，還有對蛹蟲草鮮藥和干藥的比較鮮有報道。

腺苷、蟲草素和N-6-2羥乙基腺苷為蛹蟲草中具有代表性的核苷活性物質，其中N-6-2羥乙基腺苷是蛹蟲草中特有物質。2009年衛(wèi)生部公告3號文規(guī)定蛹蟲草腺苷的含量不低于0.05%。高效液相色譜法已被廣泛應用于測定蛹蟲草中的腺苷和蟲草素。此次試驗從蛹蟲草主產(chǎn)地中選取安徽、湖北、云南、山東作為原料產(chǎn)地，分別采用烘干、凍干等方法處理，從蟲草素、腺苷和N-6-2羥乙基腺苷三種活性物質上，利用高效液相色譜法測定其中的含量和每個產(chǎn)地核苷種類，旨在通過腺苷、蟲草素和N-6-2羥乙基腺苷的比較尋找蛹蟲草的較好來源及其加工方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4種蛹蟲草子實體來自安徽地區(qū)、湖北地區(qū)、云南地區(qū)、山東地區(qū)，均為小麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)的蛹蟲草，頭部呈圓狀，顏色為蛋黃色，通體長10 cm左右，直徑為1.5 mm左右。將4種蛹蟲草子實體分別做4 ℃冷藏、65 ℃烘干48 h、真空冷凍干燥12 h至恒重處理，干燥后的蛹蟲草子實體均打粉，過60目篩，密封放干燥皿中保存。

蟲草素、腺苷、N-6-2羥乙基腺苷標準品，上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%；乙腈（色譜純），美國Honeywell公司。

1.2 儀器與設備

FA1004電子天平，上海精科公司；UV2100紫外分光光度計，上海光譜公司；DHG9070A電熱恒溫干燥箱，上海驚鴻公司；FD-1冷凍干燥機，北京博醫(yī)康公司；Agilent 1260液相色譜儀，美國安捷倫；TDZ5-WS離心機，湖南湘儀公司；R205旋轉蒸發(fā)儀，上海申勝公司；DK-626恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；JY98-IIIDN超聲波細胞粉碎機，寧波新芝公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草含水率測定

分別取100 g云南、安徽、湖北、山東產(chǎn)地新鮮蛹蟲草，放入恒溫干燥箱中，每個產(chǎn)地取3份，于65 ℃烘干至恒重，收集干品稱定其質量，取平均值，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.2 回歸方程

分別精確稱取1.0 mg腺苷、蟲草素和N-6-2羥乙基腺苷于10 mL離心管內(nèi)，加5 mL乙腈和水混合液（5∶95，流動相）超聲溶解，然后制成0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5和0.006 25 mg/mL標準溶液，以腺苷、蟲草素和N-6-2羥乙基腺苷標準溶液質量濃度為X軸，峰面積為Y軸，得回歸方程。

色譜條件：Agilent 1260液相色譜儀配二極管陣列檢測器，SGE protecol C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相為水-乙腈（95∶5，V/V），柱溫為30 ℃，檢測波長為260 nm，檢測時間為30 min，流速為1 mL/min，等度洗脫。

所有提取樣品均過0.22 μm微孔濾膜后上樣檢測。

1.3.3 提取方法對含量影響

將20 g云南新鮮蛹蟲草子實體，按1∶5（g/mL）的料液比加雙蒸水用榨汁機粉碎，分別取2 g烘干和凍干的蛹蟲草子實體，各粉碎按1∶5（g/mL）料液比加水混勻。上述樣品分別采用超聲[6]和熱水提取法提取。超聲提取方法：將處理好的樣品放入超聲波細胞粉碎儀中超聲45 min，功率為800 W。熱水提取方法：將處理好的樣品放在恒溫水浴鍋內(nèi)，于100 ℃水浴提取30 min，并放入磁石攪拌。上述兩種方法處理完后加水定容至原始刻度，將處理完的樣品收集提取液，離心，過濾，放置冰箱冷藏備用。

1.3.4 不同產(chǎn)地新鮮蟲草的核苷類物質含量測定

分別取云南、安徽、湖北、山東產(chǎn)地新鮮蟲草，按照熱水提取方法對不同產(chǎn)地蛹蟲草進行提取，每個產(chǎn)地提取3組，用1.3.2中的色譜條件測定其中腺苷、蟲草素和N-6-2羥乙基腺苷的含量。

1.3.5 不同加工方法對蟲草中核苷類物質影響

樣品提取用1.3.3中的條件對來自云南地區(qū)新鮮、烘干、凍干不同處理的樣品進行提取，每組提取3次，并按照1.3.2色譜條件進行高效液相方法測定。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)來自3組平行試驗，結果表示為平均數(shù)±標準差。采用SPSS 19.0軟件進行分析，顯著性以p＜ 0.05為差異顯著，p＞0.05為差異不顯著。所有數(shù)據(jù)全部折合成新鮮蛹蟲草含量。

2 結果與討論

2.1 不同地區(qū)含水率差異

由表1可知，云南產(chǎn)地蛹蟲草含水率最低，為87.93%±0.70%，和安徽、湖北、山東差異顯著（p＜ 0.05），山東產(chǎn)地（92.37%±0.45%）、安徽產(chǎn)地（91.27%±0.50%）蛹蟲草含水率較高，與云南和湖北差異顯著（p＜0.05）。由此可見，云南產(chǎn)的蛹蟲草干重很高，比其他地區(qū)更占優(yōu)勢。

表1 各產(chǎn)地蛹蟲草含水率 %

2.2 核苷類物質含量測定方法建立

2.2.1 檢測條件

分別精確稱取1.0 mg腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷標準品，用5.0 mL去離子水溶解，以去離子水做空白參照，用全波長掃描儀測定各種核苷類物質的吸光度。結果發(fā)現(xiàn)它們的吸光度均在260 nm處，故后面的液相檢測波長為260 nm，這與李進等[7]的檢測波長一致。

采用不同比例的乙腈、水作為流動相，對樣品中腺苷、N-6-2羥乙基腺苷和蟲草素的分離效果進行比較。經(jīng)反復試驗，最終確定流動相比例乙腈-水（5∶95，V/V），這與李兵[8]的檢測條件一致。

2.2.2 回歸方程

由表2可知，腺苷、蟲草素和N-6-2羥乙基腺苷均在0.006 25～0.2 mg/mL質量濃度范圍內(nèi)，且相關性良好。

表2 回歸方程

2.2.3 精密度、準確度

取混合標準品溶液重復進樣6次，測定腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷的峰面積。結果表明，腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷的相對標準偏差分別為0.42%，0.51%和0.53%，表明精密度良好。將上述混合標準溶液分別在1，3，5，7，9和11 h時間段進樣，結果表明，腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷的相對標準偏差分別為0.49%，0.54%和0.58%，表明穩(wěn)定性良好、準確度高。

2.3 蟲草中核苷類物質含量分析

2.3.1 不同提取方法對含量結果影響

通過分析比較，熱水提取效果比超聲處理效果要好，新鮮熱提比新鮮超聲在腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷含量上明顯要高（p＜0.05），烘干熱提比烘干超聲在腺苷、蟲草素含量上差異不顯著（p＞0.05），但在N-6-2羥乙基腺苷含量上烘干熱提比烘干超聲要高3.73%，差異顯著（p＜0.05）。凍干熱提和凍干超聲在蟲草素含量上差異不明顯（p＞0.05），但在腺苷和N-6-2羥乙基腺苷上含量差異明顯（p＜ 0.05），分別要高出8.30%和4.77%。綜上所述，熱水提取效果比超聲提取效果要好，這與王英娟等[9]研究比較結果一致。故在后面的試驗中，選用熱水提取法作為蛹蟲草核苷類物質研究的提取方法。

2.3.2 不同產(chǎn)地蛹蟲草的種類差異

由圖1可以看出，液相結果很好，各個主要的峰分離度很好，通過液相圖譜可以看出各個產(chǎn)地在核苷種類上并無太多差異，只有云南產(chǎn)的蛹蟲草在12 min左右與其他產(chǎn)地有明顯的出峰差異，表明云南產(chǎn)的蛹蟲草在活性物質種類上比其他產(chǎn)地更有優(yōu)勢，這可能與云南當?shù)貧夂蛴嘘P，溫暖的氣候可能更適合蛹蟲草生長。

2.3.3 不同產(chǎn)地（新鮮）的含量差異

由圖2可知，各地新鮮原料中，云南產(chǎn)地腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷含量（0.19，0.21和0.24 mg/g）明顯高于安徽（0.15，0.15和0.22 mg/g）、湖北（0.13，0.16和0.20 mg/g）和山東（0.17，0.15和0.19 mg/g）（p＜0.05），其他3個地區(qū)腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷含量有高有低。4個地區(qū)整體核苷含量與楊昕等[10]研究結果一致，均在0.27%～0.87%范圍內(nèi)。其中蟲草素含量與唐曉雙等[11]研究結果相同，均在0.05%～0.51%之間。從腺苷含量來看，4個產(chǎn)地差異顯著（p＜0.05），依次為云南＞山東＞安徽＞湖北。從蟲草素來看，安徽和山東產(chǎn)地含量差異不顯著（p＞0.05），其他產(chǎn)地差異顯著（p＜00.05），依次為云南＞湖北＞安徽＞山東。從N-6-2羥乙基腺苷來看，各產(chǎn)地之間含量差異顯著（p＜0.05），依次為云南＞安徽＞湖北＞山東。綜上所述，4個產(chǎn)地中云南產(chǎn)地質量最好，其他3個產(chǎn)地各有優(yōu)勢。

圖1 液相圖

圖2 不同產(chǎn)地新鮮蛹蟲草腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷含量

2.3.4 不同加工方法的比較

由表3可知，在超聲提取和熱水提取方法中，新鮮、烘干、凍干提取后腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷含量高低順序為新鮮＞凍干＞烘干，且差異顯著（p＜0.05）。由此可知，新鮮和凍干處理能更好地保持蛹蟲草中的活性成分。但由于新鮮蛹蟲草含水量高達90%，不適于工業(yè)化保存，只適合作為新鮮保健飲品等。又由于新鮮蛹蟲草中活性成分含量沒有達到遠遠高于凍干處理程度，故綜合考慮，凍干處理是最適合的加工方法，這與孫軍德等[12]研究結果一致。

表3 不同加工后和不同方法提取后含量比較 mg/g

3 結論

云南地區(qū)新鮮蛹蟲草含水率最低，為87.93%± 0.70%，此產(chǎn)地蛹蟲草用熱水提取和超聲法提取后，腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷含量普遍比烘干、凍干含量高，故熱水提取為蛹蟲草較好的提取方法。

云南產(chǎn)地蛹蟲草中腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷含量明顯比安徽、湖北、山東高，最高分別為0.19，0.21和0.24 mg/g。

3種不同加工方法后的腺苷、蟲草素、N-6-2羥乙基腺苷含量依次為新鮮＞凍干＞烘干，但由于新鮮蛹蟲草含水量高達90%，不適于工業(yè)化保存，凍干加工更適于保存，且能較好地的保存其中的活性成分，故凍干的加工方法更適應于現(xiàn)代社會需要。