王文華，郭麗，劉爽

1. 上海震旦職業(yè)學(xué)院（上海 201908）；2. 綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院（綏化 152061）

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand-Mazz）是菊科多年生植物[1]，富含綠原酸、咖啡酸、生物堿、多糖等多種功能成分[2]，是良好的藥食兩用佳品。大量研究表明，蒲公英提取物具有抑菌[3-4]、抗炎[5]、止血[6-7]、護(hù)肝[8-9]、抗癌[10-12]、抗氧化[13-17]等作用。

葵花籽中綠原酸主要分布在葵花籽仁的糊粉層中或細(xì)胞的蛋白質(zhì)顆粒內(nèi)。去油后的葵花籽粕中綠原酸含量高于其他油料作物，達(dá)到2.8%左右[18]。研究發(fā)現(xiàn)，葵花籽中綠原酸是其主要的抗氧化活性物質(zhì)[19-20]。

試驗(yàn)以蒲公英和葵花籽為原料，以其中的活性物質(zhì)綠原酸為主要研究對(duì)象，研究不同溫度（5，25，37和45 ℃）和不同pH（2.0，4.0，6.0，7.0和8.0）條件下蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液的抗氧化活性。在此基礎(chǔ)上探究蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液復(fù)配的抗氧化活性，為開發(fā)天然、高效的新型復(fù)合抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英、葵花籽：市售。

試劑：綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），Summus公司；ABTS（純度≥98%，2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽），北京酷爾化學(xué)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FW135高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì)，杭州齊威儀器有限公司；DL-6000B低速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DZ-1BC真空干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；752紫外-可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)內(nèi)容

1.3.1 綠原酸的提取

將蒲公英表面灰塵清洗后，置恒溫干燥箱中40 ℃干燥至恒質(zhì)量，經(jīng)萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎后過孔徑0.250 mm篩，密封保存，備用。用分析天平稱取4.000 0 g蒲公英干燥粉末于三角瓶中，加入80 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，采用超聲波輔助提取蒲公英中綠原酸。提取條件：超聲功率80 W，超聲處理110 min，提取溫度60 ℃，用濾布過濾后備用。

將葵花籽去皮后置恒溫干燥箱中60 ℃干燥至恒質(zhì)量，經(jīng)萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎后過孔徑0.250 mm篩，根據(jù)GB 5009.6—2016中索氏抽提法除去葵花籽仁中脂肪，再經(jīng)真空干燥后備用。稱取4.000 0 g的脫脂干燥葵花籽仁粉末于三角瓶中，加入80 mL體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，采用乙醇浸提法提取葵花籽仁中綠原酸，提取pH 6.0，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間2 h，于3 000 r/min下離心20 min，取上清液備用。

1.3.2 綠原酸提取液抗氧化研究

研究不同溫度（5，25，37和45 ℃）和pH（2.0，4.0，6.0，7.0和 8.0）條件下蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液的抗氧化活性。通過蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液的抗氧化動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，根據(jù)2種樣品綠原酸提取液?jiǎn)为?dú)作用時(shí)的 IC50值，將蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液進(jìn)行復(fù)配，比例分別為1∶9，2∶ 8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1，利用ABTS自由基清除法對(duì)兩者協(xié)同抗氧化能力進(jìn)行研究。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 綠原酸含量的測(cè)定

1.4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用分析天平準(zhǔn)確稱取5.3 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇定容于100 mL容量瓶中備用，質(zhì)量濃度為0.053 mg/mL。分別吸取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和12.0 mL于25 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，用紫外分光光度計(jì)于325 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，做平行試驗(yàn)，并以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，所測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.1.2 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確吸取1.0 mL蒲公英提取液，用60%乙醇定容至10 mL容量瓶中，即為蒲公英綠原酸待測(cè)液；從葵花籽仁提取液中準(zhǔn)確吸取1.0 mL于10 mL容量瓶中，在pH 6.0的條件下，用50%乙醇定容即為葵花籽綠原酸待測(cè)液，在325 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)液中綠原酸含量。

1.4.2 綠原酸抗氧化活性測(cè)定

ABTS自由基清除能力測(cè)定：參照Re等[21]的方法，并稍作修改。分別用超純水配制25 mL 7 mmol/L ABTS溶液和25 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，將兩者混合后置于避光處16～24 h制備ABTS反應(yīng)液，采用不同pH的緩沖溶液對(duì)ABTS反應(yīng)液進(jìn)行稀釋，使其在波長(zhǎng)734 nm下測(cè)得的吸光度為0.70±0.02；用移液器準(zhǔn)確吸取30 μL的樣品提取液和3 mL 稀釋后的ABTS反應(yīng)液于避光離心管中，分別置于5，25，37和45 ℃下反應(yīng)5 min，以不同pH緩沖液作為空白對(duì)照，并于波長(zhǎng)734 nm下測(cè)定吸光度。

ABTS自由基清除率按式（1）計(jì)算。

式中：I為ABTS自由基清除率，%；A0為空白對(duì)照反應(yīng)后的吸光度，AS為蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液分別反應(yīng)后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英、葵花籽仁中綠原酸含量

以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得出綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=37.09x+0.031，R2=0.994。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品在0～0.024 mg/mL的濃度范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系，見圖1。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出蒲公英提取液中綠原酸含量為4.5%，葵花籽仁提取液中綠原酸含量為1.2%。吳婉瑾等[22]通過乙醇回流法測(cè)得不同生態(tài)型蒲公英中綠原酸含量范圍在2.21%～7.03%，與試驗(yàn)結(jié)果相一致；胡鮮寶等[23]利用乙醇提取法提取葵花粕中綠原酸，提取率為2.57%，可見脫脂程度不同對(duì)綠原酸含量有所影響。

2.2 蒲公英綠原酸提取液對(duì)ABTS自由基的清除能力

ABTS是目前常用來評(píng)價(jià)抗氧化劑清除自由基能力的重要方法之一。ABTS在氧化劑的作用下會(huì)氧化變?yōu)榫G色，而多酚類物質(zhì)因能提供氫離子，將綠色的ABTS還原為無色，在734 nm波長(zhǎng)下，通過測(cè)定ABTS溶液的吸光度即可計(jì)算出樣品中綠原酸的抗氧化能力。

蒲公英綠原酸提取液在pH為2～8時(shí)，提取液對(duì)ABTS自由基的清除率隨著pH增大，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，見圖2。

圖2 不同條件下蒲公英提取液綠原酸對(duì)ABTS自由基的清除能力

當(dāng)綠原酸提取液的pH為6.0時(shí)，其對(duì)ABTS自由基清除能力最大，這主要是由于綠原酸的第一解離常數(shù)pKa1為0.36，在提取液pH低于解離常數(shù)時(shí)，綠原酸被質(zhì)子化不能進(jìn)行解離來猝滅ABTS自由基；當(dāng)提取液pH高于第一解離常數(shù)時(shí)，促使綠原酸分子酚羥基的電離效率進(jìn)一步放大，使其抗氧化能力增加。當(dāng)綠原酸提取液pH為2.0時(shí)，其對(duì)ABTS自由基清除能力最差，綠原酸分子在pH 2.0時(shí)的溶解度很低，強(qiáng)酸環(huán)境限制了綠原酸分子結(jié)構(gòu)的水合解離，導(dǎo)致其抗氧化能力較低[24]。綠原酸提取液pH為4.0，7.0和8.0時(shí)，其對(duì)ABTS自由基清除能力差異不明顯。

蒲公英綠原酸提取液在濃度為0.225～2.025 mg/mL范圍時(shí)，綠原酸提取液對(duì)ABTS自由基清除率隨著溫度的升高，呈現(xiàn)出逐漸遞增的趨勢(shì)，見圖3。

在相同濃度下，反應(yīng)溫度為45 ℃時(shí)，蒲公英綠原酸提取液對(duì)ABTS自由基清除作用均高于5，25和37 ℃。當(dāng)提取液綠原酸濃度為2.025 mg/mL、反應(yīng)溫度為45 ℃時(shí)，提取液綠原酸對(duì)ABTS自由基清除作用最強(qiáng)，清除率為91.78%，而反應(yīng)溫度為5 ℃時(shí)，提取液綠原酸對(duì)ABTS自由基清除能力最弱，為90.58%。

圖3 pH 6.0不同溫度下蒲公英提取液綠原酸對(duì)ABTS自由基的清除能力

葵花籽仁綠原酸提取液在pH為2～8時(shí)，提取液對(duì)ABTS自由基的清除率隨著pH的增大，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，見圖4。

圖4 不同條件下葵花籽仁綠原酸對(duì)ABTS自由基的清除能力

當(dāng)綠原酸提取液的pH為6.0時(shí)，其對(duì)ABTS自由基清除能力最好，可能是綠原酸分子在pH 6.0的條件下其內(nèi)部的酚羥基結(jié)構(gòu)電離度更高，更有利于終止ABTS自由基的連鎖反應(yīng)。當(dāng)綠原酸提取液pH為2.0時(shí)，其對(duì)ABTS自由基清除能力最差，可能在強(qiáng)酸體系下綠原酸的溶解性會(huì)受到一定程度的干擾，使部分綠原酸質(zhì)子化帶正電，而造成綠原酸抗氧化活性的顯著降低[24]。綠原酸提取液pH為4.0，7.0和8.0時(shí)，其對(duì)ABTS自由基清除能力差異不明顯。

葵花籽仁綠原酸提取液濃度在0.054～2.7 mg/mL范圍時(shí)，其對(duì)ABTS自由基清除能力隨著溫度的升高，呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì)，見圖5。

在相同濃度下，反應(yīng)溫度為45 ℃時(shí)，葵花籽仁綠原酸提取液對(duì)ABTS自由基清除作用最好，均高于5，25和37 ℃時(shí)提取液對(duì)ABTS自由基的清除率。當(dāng)提取液綠原酸濃度為2.7 mg/mL，反應(yīng)溫度為45 ℃時(shí)，提取液綠原酸對(duì)ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到90.51%。提高溫度后綠原酸分子的解離度增加，促使綠原酸分子和自由基之間的碰撞概率增大[24]。

圖5 pH 6.0不同溫度下葵花籽仁綠原酸對(duì)ABTS自由基的清除能力

2.3 ABTS自由基的清除能力回歸方程

IC50表示達(dá)到半數(shù)抑制率或者半數(shù)清除自由基活性時(shí)的物質(zhì)濃度，常用來表示物質(zhì)的抗氧化活性，物質(zhì)的IC50越小，表明物質(zhì)的抗氧化活性越強(qiáng)，反之亦然。

確定在pH 6.0條件下，蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液對(duì)ABTS自由基清除能力最佳，分析不同溫度下、不同濃度綠原酸提取液的抗氧化活性。不同反應(yīng)溫度下，葵花籽仁綠原酸提取液的IC50值均顯著高于蒲公英綠原酸提取液的IC50值。隨著反應(yīng)溫度的升高，IC50值均呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，見表1。

表1 pH 6.0時(shí)不同反應(yīng)溫度下綠原酸ABTS自由基清除能力回歸方程

在溫度為45 ℃時(shí)蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液的IC50值分別為0.071 933和0.938 96，是5 ℃時(shí)IC50值的48%和41%，可見溫度升高顯著提升了綠原酸的抗氧化活性。反應(yīng)溫度升高會(huì)提升反應(yīng)發(fā)生的速度，但不改變達(dá)到平衡時(shí)的抗氧化活性，可能提高溫度后綠原酸在體系中的分散度和電離電勢(shì)增大[24]。

2.4 綠原酸復(fù)配體系對(duì)ABTS自由基清除能力研究

協(xié)同抗氧化作用的發(fā)生不僅與抗氧化劑分子本身的抗氧化特性有關(guān)，還與規(guī)整有序的分子排列體系有關(guān)，有序性縮短了分子之間的接觸距離和電子以及氫原子的傳遞路徑，從而促進(jìn)協(xié)同抗氧化現(xiàn)象發(fā)生。

為研究蒲公英綠原酸與葵花籽仁綠原酸對(duì)清除ABTS自由基的協(xié)同效應(yīng)，將2種樣品中綠原酸提取液用pH 6.0緩沖液稀釋至最適濃度后，按比例（1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1）混合，測(cè)定樣品組合清除ABTS自由基的能力，判定協(xié)同關(guān)系。

復(fù)配液對(duì)ABTS自由基的清除能力均大于蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液?jiǎn)为?dú)對(duì)ABTS自由基的清除能力，蒲公英綠原酸提取液對(duì)ABTS自由基的清除能力相對(duì)于葵花籽仁綠原酸提取液較弱，見圖6。隨蒲公英綠原酸提取液濃度的增加，復(fù)配液對(duì)ABTS自由基的清除率呈緩慢遞增的趨勢(shì)，當(dāng)蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液體積比為7∶3時(shí)，在所有的比例組合中顯示出較強(qiáng)的協(xié)同抗氧化作用，反應(yīng)溫度大于37 ℃時(shí)，復(fù)配液的協(xié)同抗氧化能力保持較高水平。

圖6 不同復(fù)配比例對(duì)ABTS自由基的清除能力

3 結(jié)論

試驗(yàn)是在不同溫度和不同pH條件下，以蒲公英和葵花籽仁綠原酸為原料，研究蒲公英和葵花籽仁綠原酸單獨(dú)作用時(shí)對(duì)ABTS自由基的清除能力，并分析復(fù)配體系的抗氧化能力。得到主要結(jié)論如下：

1) 反應(yīng)體系的pH和溫度對(duì)蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液對(duì)ABTS自由基清除能力具有顯著性影響，兩種樣品液在pH 6.0和45 ℃條件下抗氧化活性最佳，分別為91.78%和90.51%。

2) 在復(fù)配體系中，當(dāng)蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液體積比為7∶3時(shí)ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，為91.74%。蒲公英和葵花籽仁綠原酸具有協(xié)同抗氧化能力。