何暢 ，李達(dá)，高巖松，劉佳彤，蘇穎*，王景會*

1. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（長春 130033）；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（長春 130118）

分蘗洋蔥（Allium cepavar. Aggregatum）又被稱為鬼子蔥，東北人稱之為分蘗蔥頭，它屬于百合科的一種植物，屬于草本類植物，具有球形的外形，被赤紅色的皮膜包裹著。分蘗洋蔥以蔬菜方式銷售并遠(yuǎn)銷世界各國，因在加工方面不夠深入，技術(shù)含量非常低且產(chǎn)品附加值不高，導(dǎo)致具有豐富營養(yǎng)價值的分蘗洋蔥被忽視。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)證實分蘗洋蔥具有抑制細(xì)菌增長[1]，降低血糖[2]和血脂含量，抑制血小板凝固[3]等功效，并且在各種疾病方面有很好療效[4]，對軟化脂肪中的血管分蘗洋蔥的療效作用更加顯著。

微膠囊是一種將固體、液體或氣體包封形成微小粒子的保護(hù)技術(shù)，可以在保留芯材物質(zhì)原有特性的前提下實現(xiàn)其緩慢釋放、瞬間釋放或持久保存，在功能材料領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[5]。微膠囊技術(shù)可賦予產(chǎn)品優(yōu)良的阻隔及緩釋特性，同時有效改善芯材的顏色及風(fēng)味不佳的情況，使其在食品領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，成為國內(nèi)外專家研究熱點[6-7]。大多數(shù)氣體、液體、固體均可被包囊。近年來，針對精油[8]及多肽[9]等進(jìn)行微膠囊的研究較多，而黃酮類化合物相關(guān)研究主要集中于提取[10]、純化[11]等方面，以海藻酸鈉為壁材通過銳孔凝固浴法包埋分蘗洋蔥黃酮微膠囊仍鮮見報道。

因此，試驗以分蘗洋蔥黃酮為芯材，海藻酸鈉為壁材，通過響應(yīng)面法優(yōu)化銳孔法制備分蘗洋蔥黃酮微膠囊工藝，在提高黃酮穩(wěn)定性的同時，也能擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。將分蘗洋蔥黃酮微膠囊進(jìn)行品質(zhì)分析，探究黃酮微膠囊理化特性及緩釋效果，為其在食品領(lǐng)域應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分蘗洋蔥黃酮（實驗室自制）；海藻酸鈉（浙江一諾生物科技有點公司）；吐溫80（酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司）；胰蛋白酶、胃蛋白酶（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；無水氯化鈣、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇、鹽酸（南京化學(xué)試劑股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋（HH-2，常州朗越儀器制造有限公司）；磁力攪拌器（78HW-1，杭州儀表電機(jī)有限公司）；冷凍干燥機(jī)（FD-1PF，北京德天佑科技發(fā)展有限公司）；紫外分光光度計（Cary50，美國VARIN公司）；蔡司（ZEISS）掃描電鏡（evo18，德國卡爾蔡司公司）。

1.3 方法

1.3.1 制備工藝

無水氯化鈣為凝固浴↘

海藻酸鈉完全溶解→加分蘗洋蔥黃酮與乳化劑吐溫80→混合均勻→銳孔造粒→固化→分離洗滌→濕囊→干燥→成品

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 海藻酸濃度對包埋率的影響

分別配制濃度1%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%的海藻酸鈉溶液，添加一定量分蘗洋蔥黃酮凍干粉，使得芯壁比1∶3（g/g），緩慢向其加入1.3%吐溫80，繼續(xù)攪拌至黃酮完全溶解形成混合液，將裝有混合液的燒杯放置在45 ℃水浴鍋中；配制氯化鈣濃度1.5%凝固浴，置于4 ℃下冷藏；用0.6 mm注射器吸取適量混合溶液，以較快速度推動活塞，但要維持注射器滴下的液滴為明顯顆粒，滴入凝固浴氯化鈣溶液中，造粒結(jié)束后置于4 ℃下固化45 min；經(jīng)過濾、洗滌、干燥制得黃酮微膠囊，考察其包埋率。

1.3.2.2 芯壁比對包埋率的影響

配制2%海藻酸鈉溶液，芯壁比分別為3∶2，2∶1，1∶1，1∶3和1∶5（g/g），加入1.3%吐溫80，將混合液放置在45 ℃水浴鍋中；配制氯化鈣濃度1.5%凝固浴，置于4 ℃下冷藏；后續(xù)步驟同1.3.2.1。

1.3.2.3 氯化鈣濃度對包埋率的影響

配制2%海藻酸鈉溶液，芯壁比1∶3（g/g），緩慢向其加入1.3%吐溫80，將混合液放置在45 ℃水浴鍋中；分別配制氯化鈣濃度為1.2%，1.5%，1.8%，2.1%和2.4%的凝固浴，置于4 ℃下冷藏；后續(xù)步驟同1.3.2.1。

1.3.2.4 乳化劑用量對包埋率的影響

配制2%海藻酸鈉溶液，芯壁比1∶3（g/g），緩慢向其分別加入0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%乳化劑吐溫80，將混合液放置在45 ℃水浴鍋中；配制氯化鈣濃度1.5%凝固浴，置于4 ℃下冷藏；后續(xù)步驟同1.3.2.1。

1.3.2.5 水浴溫度對包埋率的影響

配制2%海藻酸鈉溶液，芯壁比1∶3（g/g），加入1.3%乳化劑吐溫80，將裝有混合液的燒杯分別放置在35，40，45，50和55 ℃水浴鍋中；配制氯化鈣濃度1.5%的凝固浴，置于4 ℃下冷藏；后續(xù)步驟同1.3.2.1。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化微膠囊工藝試驗

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，海藻酸鈉濃度、芯壁比、氯化鈣的濃度和乳化劑用量對微膠囊包埋率影響較大，應(yīng)用Design-Expert 8.0.5 b軟件，進(jìn)行采用4個因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化，以微膠囊包埋率為響應(yīng)值，重復(fù)試驗3次。響應(yīng)面設(shè)計編碼值與因素設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計編碼值與因素

1.3.4 包埋率計算

1.3.4.1 黃酮含量測定

黃酮含量測定采用硝酸鋁法[12]。在λ=510 nm處測定其吸光度。得吸光度A與質(zhì)量濃度c（mg/mL）的回歸方程A=9.345 4c-0.008 4，R2=0.999 2。

1.3.4.2 微膠囊包埋率測定

微膠囊包埋率的測定參考文獻(xiàn)[13]，按式（1）進(jìn)行計算。

式中：A為微膠囊表面黃酮含量，mg/g；B為微膠囊總黃酮含量，mg/g。

1.3.5 微膠囊理化指標(biāo)

1.3.5.1 感官評價

將復(fù)合微膠囊放在無異味、光線充足的條件下，對微膠囊的色澤、氣味、組織狀態(tài)進(jìn)行評價[14]。

1.3.5.2 粒徑的分析

黃酮微膠囊化后的采用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測定。

1.3.5.3 含水量的測定

含量的測定參照GB/T 5009.3—2016[15]直接干燥法測定。

1.3.5.4 密度的測定

將微膠囊通過漏斗倒入已知質(zhì)量、體積的容器中，容器頂部成錐形后，用平板將錐形粉料輕輕推平，鋪滿頂部，稱量容器和微膠囊總質(zhì)量，按式（2）計算密度[16]。

式中：ρ為微膠囊密度，g/mL；m1為容器質(zhì)量，g；m2為容器和微膠囊總質(zhì)量，g；V為容器體積，mL。

1.3.5.5 流動性的測定

顆粒的流動性常用休止角表示，參照GB 11986—1989《表面活性劑 粉體和顆粒休止角的測定》[17]固定圓錐底法。

1.3.5.6 掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察

將分蘗洋蔥黃酮微膠囊樣品用離子濺射器鍍金膜，觀察并拍照具有代表性的微膠囊顆粒形態(tài)[18]。

1.3.5.7 人工胃腸液的配制

依據(jù)2010年版《中國藥典》附錄相關(guān)方法，分別制備人工胃液及人工腸液[19]。

1.3.5.8 微膠囊在模擬胃腸液中的釋放

取0.1 g干燥的微膠囊放至100 mL配制好的模擬胃腸液中，37 ℃下反應(yīng)，定時取出1 mL，用0.45 μm微膜過濾，補(bǔ)充同量模擬胃腸液。將其稀釋至100 mL，于510 nm波長下檢測OD值，計算得出模擬胃液中黃酮含量，計算累積釋放量[20]。

1.3.5.9 累積釋放量計算

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Origin Pro 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；采用Design- Expert 8.0.5 b軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗的設(shè)計、數(shù)據(jù)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 海藻酸鈉濃度對包埋率的影響

由圖1可知，海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋率的影響較為明顯，海藻酸鈉濃度1.6%時包埋率最高，隨著濃度增加，包埋率反而下降，這是由于海藻酸鈉濃度增高，導(dǎo)致擠壓很難進(jìn)行，需要加大壓力[21]，增加造粒難度，而且產(chǎn)品易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，形狀也不規(guī)則。因此，制備分蘗洋蔥黃酮微膠囊時，海藻酸濃度1.6%較適宜。

圖1 海藻酸鈉濃度對包埋率的影響

2.1.2 芯壁比對包埋率的影響

由圖2可知，微膠囊包埋率隨著壁材增加而逐步增加，芯壁比1∶2（g/g）時包埋率最高，隨著壁材添加量繼續(xù)增大，但是包埋率卻降低?？赡苁怯捎诒诓暮Ｔ逅徕c與分蘗洋蔥黃酮的結(jié)合達(dá)到一定程度時，繼續(xù)添加壁材使其濃度過大，不利于壁材的固化[22]，造成包埋率減小，同時也會造成海藻酸鈉的不必要浪費(fèi)。因此，制備分蘗洋蔥黃酮微膠囊時，芯壁比1∶2（g/g）較適宜。

2.1.3 氯化鈣濃度對包埋率的影響

由圖3可知，微膠囊包埋率隨著氯化鈣濃度增加而逐步升高，氯化鈣濃度2.0%時包埋率最高，隨著氯化鈣濃度繼續(xù)增大，但是包埋率卻降低?？赡苁怯捎诼然}濃度較低時，產(chǎn)品黏度較大，易膠黏結(jié)成團(tuán)，且不易成型。氯化鈣濃度過高時，微膠囊成型迅速，在內(nèi)層固化前形成致密的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，質(zhì)地較硬，使囊壁變厚、變脆，阻礙Ca2+向微膠囊內(nèi)層的繼續(xù)擴(kuò)散和內(nèi)層的充分包埋，干燥時易發(fā)生破碎[23]。因此，凝固浴氯化鈣濃度2.0%較適宜。

圖2 芯壁比對包埋率的影響

圖3 氯化鈣濃度對包埋率的影響

2.1.4 乳化劑用量對包埋率的影響

如圖4所示，微膠囊包埋率隨著乳化劑用量增加而逐步升高，乳化劑用量1.0%時包埋率最高，形成的微膠囊大小、質(zhì)地均比較均勻，結(jié)構(gòu)致密。隨著乳化劑用量增加，乳化劑黏度會增加[24]，并影響氣味，而且其包埋率逐步下降。因此，制備分蘗洋蔥黃酮微膠囊時，乳化劑用量1.0%較適宜。

圖4 乳化劑用量對包埋率的影響

2.1.5 水浴溫度對包埋率的影響

如圖5所示，水浴溫度對微膠囊包埋率影響較小，在一定范圍內(nèi)，隨著水浴溫度增加，海藻酸鈉與鈣離子結(jié)合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，聚合反應(yīng)也會加劇[25]，在表面形成保護(hù)層。但溫度過高，導(dǎo)致海藻酸鈉與黃酮發(fā)生分子結(jié)構(gòu)的改變，生物活性也會逐漸減弱。因此，制備分蘗洋蔥黃酮微膠囊時，水浴溫度40 ℃較適宜。

2.2 響應(yīng)面法對工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，從單因素中選擇對微膠囊包埋率有相對顯著影響的因素進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗。試驗方案設(shè)計及結(jié)果見表2。

圖5 水浴溫度對包埋率的影響

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.5 b軟件，建立海藻酸鈉濃度、芯壁比、氯化鈣濃度、乳化劑用量4因素數(shù)學(xué)回歸模型：Y=75.50-0.12A-0.072B-0.87C+0.44D+ 2.28AB-0.75AC+2.15AD-0.71BC+0.76BD+0.055CD-3.28A2-2.58B2-3.15C2-3.35D2。

從表3可看出，一次項中，C（氯化鈣濃度）、D（乳化劑用量）對黃酮含量的線性效應(yīng)均極顯著（p＜ 0.01），A（海藻酸鈉濃度）、B（芯壁比）對提取黃酮含量的線性效應(yīng)不顯著（p＞0.05），二次項中，A2、B2、C2、D2影響均極顯著（p＜0.001），AD、AC、AD、BD影響極顯著（p＜0.01），BC影響顯著（p＜0.05），CD影響不顯著（p＞0.05）。此模型顯著性檢測p＜0.001，極顯著；失擬項p=0.992 3，不顯著，校正模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.984 9，決定系數(shù)R2adj= 0.969 8，說明選用的模型與實際得出的數(shù)據(jù)擬合較好、誤差小，能較好反映各因素與包埋率之間的關(guān)系。由F值可知，C（氯化鈣濃度）、D（乳化劑用量）在試驗范圍內(nèi)對包埋率的影響較大，A（海藻酸鈉濃度）在試驗范圍內(nèi)對包埋率的影響相對于B（芯壁比）較大些，而B（芯壁比）對包埋率的影響較小。

表3 回歸模型方差分析

通過Design-Expert 8.0.5 b響應(yīng)面分析軟件求解回歸方程，得到分蘗洋蔥超聲波提取黃酮適宜工藝條件：海藻酸鈉濃度1.51%、芯壁比1∶3.03（g/g）、氯化鈣濃度1.97%、乳化劑用量1.02%，在此條件下所得的理論包埋率75.578 6%。為方便試驗操作，將上述條件修正為海藻酸鈉濃度1.50%、芯壁比1∶3（g/g）、氯化鈣濃度2.0%、乳化劑用量1.00%，進(jìn)行驗證試驗，平行3次所得的包埋率的平均值為75.472%，與理論包埋率相差0.106 6%，由此可見實際值與理論值，該多元二次方程建立的響應(yīng)面模型預(yù)測包埋率可行。

2.3 微膠囊理化指標(biāo)分析

2.3.1 質(zhì)量指標(biāo)

從圖7能夠看出，分蘗洋蔥黃酮微膠囊呈現(xiàn)淡黃色，這是因為黃酮本身具有顏色，進(jìn)行微膠囊包埋后仍然呈現(xiàn)淡黃色。圖7A為未干燥的濕微膠囊色澤均勻，呈飽滿球形，并且大小均勻，粒徑較大，為2.1± 0.2 mm；含水量92%。圖7B為干燥后的微膠囊，狀態(tài)呈現(xiàn)為顆粒狀，顏色與黃酮純化后凍干粉顏色基本一致，粒徑0.6±0.1 mm、含水量2.29%、密度0.541 g/cm3、休止角32.91°。

圖6 各因素交互作用等高線和響應(yīng)面圖

圖7 未干燥的濕黃酮膠囊（A）及干燥后的黃酮微膠囊（B）

2.3.2 微膠囊產(chǎn)品表面超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果

從圖8能夠看出，（A）粒徑大的微膠囊顆粒外形較圓整，表面無明顯破洞，但凹凸不平。（B）、（C）粒徑小的黃酮微膠囊顆粒表面細(xì)膩圓滑、沒有大的褶皺、裂縫、空洞等不良的表面缺陷。（D）在50 000×顯微倍數(shù)下，微膠囊顆粒外表面完整，外壁組織結(jié)構(gòu)致密，但有細(xì)微的裂紋，可能是微膠囊在干燥后失去了水分導(dǎo)致膠囊壁的外殼較易受損[26]，其表面凹凸不平，可能是由于在干燥過程中，濕膠囊本身水分分布不均勻[27]，在干燥過程中易造成其產(chǎn)生這種現(xiàn)象。微膠囊產(chǎn)品表面超微結(jié)構(gòu)照片可以看出微膠囊顆粒較完整[28]，可以證明微膠囊顆粒的成型性較好，從整體結(jié)構(gòu)的成型及干燥后的形態(tài)可以看出，此最佳工藝包埋分蘗洋蔥黃酮成型效果較好，并且包埋率也相對良好。所優(yōu)化的微膠囊配方參數(shù)制得的黃酮微膠囊具有良好的微膠囊理化效果，證明響應(yīng)面法得到配方的合理性。

圖8 微膠囊產(chǎn)品表面超微結(jié)構(gòu)

2.3.3 胃腸液體外釋放

通過體外模擬胃腸液試驗測定分蘗洋蔥黃酮微膠囊在胃腸液中的累計釋放量，結(jié)果如圖9。在模擬胃液中，微膠囊消化6 h后，其釋放量累積達(dá)到7.476 0%；但在6～11 h范圍內(nèi)，釋放量累積的速度明顯變低，11 h時達(dá)到11.825%。以海藻酸鈉為壁材的微膠囊在模擬胃液中具有較低的釋放量與海藻酸鈉的敏感性有關(guān)，海藻酸鈉在較低pH條件下基本不溶脹，但在堿性條件下能溶脹。因而在胃液中的黃酮微膠囊受到海藻酸鈉壁材的保護(hù)，故能阻止微膠囊芯材的釋放[29]。同時其在腸液內(nèi)的累計釋放量大于胃液，在腸液內(nèi)釋放8 h后，累計釋放量71.964%；在8～11 h范圍內(nèi)，相對于前8 h，釋放速率增加開始減慢，釋放11 h后累計釋放量85.932%。故在模擬人工腸液中，微膠囊外殼溶脹破裂，使芯材釋放。

制備的微膠囊的模擬體外胃腸液釋放的試驗結(jié)果表明，11 h后微膠囊在胃液中累計釋放量11.825%，腸液中85.932%，可以看出其緩釋效果較好。

圖9 模擬胃腸液中黃酮累積釋放量的變化

3 結(jié)論

試驗以海藻酸鈉為壁材，以分蘗洋蔥黃酮為芯材，采用銳孔法制備黃酮微膠囊。根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定水浴溫度對微膠囊包埋率的影響較小，故選海藻酸鈉濃度、芯壁比、氯化鈣濃度、乳化劑用量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，在確定操作溫度為40 ℃時，最佳制備工藝參數(shù)：海藻酸鈉濃度1.50%、芯壁比1∶3（g/g）、氯化鈣的濃度2.0%、乳化劑用量1.00%，在此條件下，微膠囊包埋率75.472%；微膠囊粒徑、含水量、密度及休止角分別為0.6±0.1 mm、2.29%、0.541 g/cm3和32.91°；經(jīng)電鏡法觀察超微結(jié)構(gòu)看出產(chǎn)品成形性較好，無漏洞，分布均勻。在模擬胃腸液體外釋放時，在胃液中釋放緩慢，而在腸液中能充分釋放，有利于黃酮類化合物在人體內(nèi)的消化吸收，為分蘗洋蔥黃酮化合物研究奠定基礎(chǔ)。