李慧萍 徐 秀

（復旦大學附屬兒科醫(yī)院兒童保健科 上海 201102）

由于血腦屏障的存在，中樞神經系統(tǒng)一直被認為是一個“免疫豁免器官”。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)在神經發(fā)育及認知、社交功能中發(fā)揮調控作用［1］。多種免疫相關分子與哺乳動物大腦發(fā)育和功能有關［2］。

主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）是一組高度多態(tài)性、緊密連鎖的基因簇，在脊椎動物中編碼蛋白參與免疫應答。MHCⅠ類分子（MHC classⅠ molecule，MHC-Ⅰ）特異性表達于有核細胞表面，提呈細胞內抗原給特定的細胞毒性淋巴細胞及自然殺傷細胞介導免疫應答［3］。MHC-Ⅰ具有異三聚體結構，由1條跨膜重鏈、1條非共價附加的β-2-微球蛋白亞單位（β2m）及1條8～15個氨基酸的短肽（主要用于區(qū)分自身蛋白或外來蛋白）組成［4］。MHC-Ⅰ在不同細胞類型中表達水平有所差異［3］。由于中樞神經系統(tǒng)中極少見淋巴細胞及自然殺傷細胞，大腦被認為缺乏MHC-Ⅰ表達［5-6］。但是動物實驗發(fā)現(xiàn)，MHC-Ⅰ在神經元中表達［7-8］，并參與突觸形成、重構、可塑性等與免疫應答完全無關的生理過程［9-12］，MHC-Ⅰ調節(jié)活性依賴的視覺投射修剪，負向調節(jié)神經元突觸密度，并且在海馬依賴的記憶以及NMDAR門控依賴的海馬LTD中發(fā)揮重要作用［11］。

已知MHC-Ⅰ分子表達于神經細胞，但是其在腦中不同腦區(qū)的分布情況尚不清楚。本研究運用OX-18抗體標記成年野生型小鼠腦片，從不同腦區(qū)觀察MHC-Ⅰ蛋白分布情況，以深入了解MHC-Ⅰ在中樞神經系統(tǒng)中的表達譜。

材料和方法

實驗動物C57BL/6J小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immuno-deficiency，SCID）小鼠購自美國Jackson實驗室。動物均在清潔標準環(huán)境飼養(yǎng)，12 h/12 h光暗周期。實驗操作符合復旦大學附屬兒科醫(yī)院倫理委員會對動物實驗倫理的要求。

免疫熒光染色組織制備出生后2月齡小鼠用過量12%水合氯醛處死，打開胸腔，從心臟灌流預冷的0.1 mol/L PBS，然后灌流4%PFA固定。打開顱骨，分離出小鼠全腦，4℃下浸沒于4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA），固定4 h。同樣在4℃下分別使用15%及30%蔗糖溶液梯度脫水48 h，直至組織沉底。組織脫水后吸干表面液體，低溫包埋于OCT（日本Sakura公司）。使用德國LEICA公司冰凍切片機，冠狀切片，切片厚度為40μm，切片漂浮保存于4℃0.1 mol/L PBS中，用于免疫熒光染色。

免疫熒光染色取3～4片腦片于24孔板中，用PBS清洗3次，去除多余的PFA及OCT。使用含5% 牛血清蛋白（bull serum albumin，BSA）、0.2%Triton X-100和0.1%Tween20的PBS溶液作為封閉液，在室溫環(huán)境下封閉1 h。標記一抗：去除封閉液，加入相應的一抗，按照抗體要求濃度稀釋于封閉液中。一抗使用小鼠來源OX-18抗體（1∶500，英國AbDSerotec公司）及兔源Alex Fluor 647-NeuN抗體（1∶500，英國Abcam公司）。4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次15 min。熒光標記二抗，室溫下避光孵育1.5 h，根據一抗來源確定抗體特異性。細胞核使用二脒基苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美國Sigma公司）標記，PBS漂洗3次，每次15 min。然后貼片，待組織微干，使用封片液封片。

圖像采集及分析圖像采集使用德國Leica公司TCS SP8型共聚焦顯微鏡。圖像分析使用FIJI軟件（美國國家衛(wèi)生研究院）。小鼠腦區(qū)分布參考Allen小鼠腦圖譜（Allen Mouse Brain Atlas）。

結 果

MHC-I分子在各腦區(qū)分布廣泛小鼠大腦冠狀切面染色如圖1所示，分別為2月齡野生型小鼠（圖1A）和相應月齡SCID小鼠（圖1B）。野生型小鼠MHC-Ⅰ陽性細胞廣泛分布于大腦皮層、海馬、丘腦、下丘腦、杏仁核等腦區(qū)，但不同腦區(qū)蛋白表達水平不同，同一腦區(qū)中不同細胞間MHC-Ⅰ表達水平也不相同。B細胞、T細胞均缺失的SCID小鼠中，MHC-Ⅰ同樣在大腦各腦區(qū)分布，與野生型小鼠基本相仿。

圖1 MHC-Ⅰ在小鼠大腦廣泛表達Fig 1 MHC-Ⅰwildly expressed in the brains of mice

初級軀體感覺皮層MHC-Ⅰ表達模式野生型小鼠初級軀體感覺皮層MHC-Ⅰ染色如圖2所示，距Bregma點-1.70 mm，距中線1 mm左右。MHC-Ⅰ集中分布于2/3層、5層神經元胞體，4層部分神經元胞體表達MHC-Ⅰ，而6層神經元僅有少量神經元細胞高表達MHC-Ⅰ，并可見MHC-Ⅰ表達延伸至樹突及樹突末梢（1層）。

圖2 MHC-I陽性細胞在野生型小鼠初級軀體感覺皮層的分布Fig 2 The expression pattern of MHC-Ipositive cells in primary somatosensory cortex of wild-type mice

海馬MHC-Ⅰ表達模式從野生型小鼠的冠狀切面海馬來看，在齒狀回（dentate gyrus，DG）、海馬角1（cornuammonis 1，CA 1）、CA 2、CA 3顆粒細胞層及錐體細胞層MHC-Ⅰ表達水平均不高。許多散在分布的神經元核特異性標記（NeuN）陽性細胞高表達MHC-Ⅰ（圖 3）。

圖3 MHC-I高表達神經元在野生型小鼠海馬中散在分布Fig 3 MHC-Ihighly expressed neurons scattered in the hippocampus of wild-type mice

杏仁核MHC-Ⅰ表達模式MHC-Ⅰ高表達神經元特異性聚集于底外側杏仁核前部（basolateral amygdala nucleus，anterior part，BLAa），而在相鄰的外側杏仁核（lateral amygdalar nucleus，LA）及底外側杏仁核后部（basolateral amygdalar nucleus，posterior part，BLAp）僅有少量細胞低表達MHC-Ⅰ（圖4）。

圖4 野生型小鼠底外側杏仁核前部MHC-I陽性神經元密度高Fig 4 The density of MHC-Ipositive neurons was high in the basolateral amygdala nucleus，anterior part（BLAa）of wild-type mice

MHC-Ⅰ在中腦、丘腦核團高表達距Bregma點-2.8 mm的小鼠大腦切面（圖5）可見：在中腦位置的 環(huán) 狀 核（nucleus circularis，NC）、后 連 合 核（nucleus of the posterior commissure，NPC）、運動相關上丘，灰質間層，b亞層（superior colliculus，motor related，intermediate gray layer，sublayer b，SCig-b）、頂蓋前核（anterior pretectal nucleus，APN）、黑質網狀 帶（substantia nigrareticular parts，SNr）高 表 達MHC-Ⅰ；在部分丘腦結構中，外側膝狀體背部（dorsal part of the lateral geniculate complex，LGd）、外側膝狀體腹部（ventral part of the lateral geniculate complex，LGv）、內 側 膝 狀 體（medial geniculate complex，MG）高表達 MHC-Ⅰ。

討 論

本文檢測了MHC-Ⅰ在小鼠大腦中的分布情況。結果表明，MHC-Ⅰ在大腦分布非常廣泛，各個腦區(qū)均可見到在不同神經元細胞間的非均勻分布。

OX-18是一種特異性單克隆小鼠抗體，多篇文獻曾報道OX-18抗體用于檢測MHC-Ⅰ表達水平［13］，OX-18 抗體抗 MHC-Ⅰ RT 1A 的胞外段 α3 結構域在多種MHC-Ⅰ變體中保守結構穩(wěn)定，一直以來被用于免疫親合純化、免疫染色等檢測MHC-Ⅰ分子。OX-18抗體可以特異性識別非神經組織MHC-Ⅰ蛋白，也可以識別中樞神經系統(tǒng)MHC-Ⅰ。已有研究使用OX-18抗體檢測MHC-Ⅰ蛋白在大鼠視皮層中的表達情況［13］：在出生7天后的大鼠中，MHC-Ⅰ在視皮層5層高表達，淺層表達水平低，6層基本無表達。在年紀較大的動物中，MHC-Ⅰ在整個淺層大腦皮層分布，但在6層表達水平仍較低［13］。孕中期小鼠大腦中同樣檢測到MHC-Ⅰ蛋白表達于胚胎期神經元及神經前體細胞［14］。本研究中大腦皮層 MHC-Ⅰ染色結果與 Needleman 等［13］的視皮層染色結果基本一致，外側膝狀體也與Corriveau等［15］報道的該部位神經元高表達MHC-Ⅰ相一致，說明MHC-Ⅰ染色準確可信。

圖5 MHC-I陽性神經元在野生型小鼠中腦和丘腦部分核團中聚集性分布Fig 5 MHC-I selectively high-expressed in the nucleiof midbrain and thalamusof wild-type mice

MHC-Ⅰ被認為參與神經元突觸形態(tài)和功能調控，與神經環(huán)路形成有關，且在SCID小鼠神經元中的表達分布與普通小鼠基本相仿。為什么在不同的神經元中會出現(xiàn)如此明顯的表達差異？哪些神經元需要更高的 MHC-Ⅰ水平？Needleman 等［13］認為，神經元具有MHC-Ⅰ儲存庫作用，當神經突觸需要修剪時，MHC-Ⅰ可被運輸表達于神經元突觸前膜及后膜，而當突觸修剪減少時MHC-Ⅰ回流至胞體儲存。按照該理論，本研究MHC-Ⅰ高染色的神經元為突觸修剪較少的神經元，但目前尚無充足的實驗證實該假設。有文獻報道MHC-Ⅰ受到神經元活化鈣信號調控［15-17］。外側膝狀體（lateral geniculate nuclei，LGN）灌注河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）降低神經興奮性，局部MHC-ⅠmRNA水平降低。通過單眼注射TTX下調視網膜膝狀體活性，也可以下調 LGN MHC-Ⅰ mRNA 水平［15］。然而，在神經元激活即刻MHC-Ⅰ與早期基因c-fos共染實驗中，MHC-Ⅰ與c-fos并不完全共定位。參考海馬區(qū)域GABA能神經元分布及形態(tài)特征研究［18］，在海馬區(qū)域MHC-Ⅰ高表達的神經元從分布及形態(tài)來看是GABA能神經元。此外，黑質是大腦皮層直接或間接通過紋狀體與網狀結構發(fā)生聯(lián)系的中間站，分為背側的致密帶和腹側的網狀帶，致密帶細胞富含黑色素顆粒，能合成多巴胺，而網狀帶主要為GABA能神經元［19］。從染色來看，網狀帶可見的神經元均為MHC-Ⅰ陽性，而致密帶多巴胺能神經元均MHC-Ⅰ陰性。我們猜測MHC-Ⅰ更傾向于在GABA能神經元中表達。但杏仁核中，MHC-Ⅰ陽性神經元高度集中于BLAa。BLA參與恐懼記憶及成癮的行為過程［20］，包括 LA、BLAa、BLAp。BLAa有靶向特異性投射神經元，這些神經元胞體及樹突形態(tài)互不相同。該區(qū)域GABA能神經元占比據估計在10%～15%，顯然低于被染色的MHC-Ⅰ陽性神經元比率。而LA、BLAp區(qū)域的GABA能神經元未見同樣MHC-Ⅰ染色。因此GABA能神經元高表達MHC-Ⅰ并不能解釋MHC-Ⅰ表達特點。軀體感覺皮層染色來看也可見到有一批MHC-Ⅰ陽性神經元為椎體神經元。

MHC-Ⅰ在中樞神經系統(tǒng)表達不僅在發(fā)育中存在并發(fā)揮作用［11］，而且在成年期大腦中同樣表達。已知MHC-Ⅰ表達異常參與孤獨癥譜系障礙、帕金森癥等神經精神疾病進程［21-23］。研究發(fā)現(xiàn)MHC-Ⅰ在大腦多數腦區(qū)表達，但僅局限于腦區(qū)中的部分神經元，MHC-Ⅰ選擇性表達的因素尚不明確，深入探究其決定因素對了解MHC-Ⅰ在中樞神經元中的作用具有重要意義，可能為理解孤獨癥譜系障礙、帕金森癥等難治性神經精神疾病提供幫助。

致謝Jonathan kipms教授及付忠孝博士給予建議及指導。

作者貢獻聲明李慧萍 完成實驗，分析數據，撰寫論文。徐秀 研究構思，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。