鄧 至 鄒依寧 畢 晶 閔智慧 曾瑜真 毛若琳 姜志龍 陳智鴻△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院急診科，2病理科，3呼吸科，4實(shí)驗(yàn)研究中心 上海 200032）

哮喘是最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)慢性疾病，影響全球3.6億人口，患病率約為12.6%，每年導(dǎo)致至少40萬(wàn)人死亡［1］，中國(guó)約有三千萬(wàn)哮喘患者［2］。糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）是治療哮喘的一線(xiàn)藥物，大部分患者正規(guī)使用吸入糖皮質(zhì)激素（inhaled corticosteroid，ICS）能達(dá)到疾病控制效果［3］。然而，有5%～10%的患者在使用高劑量ICS或長(zhǎng)期口服GC情況下仍有哮喘的持續(xù)癥狀，這些患者被歸為重度哮喘或難治性哮喘，其病情控制一直是哮喘治療的難題［4-5］。

GC因其強(qiáng)大的抗炎作用，在慢性氣道炎性疾病的治療中占據(jù)重要地位?？寡鬃饔玫陌l(fā)揮主要通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）介導(dǎo)。GC穿過(guò)細(xì)胞膜并與細(xì)胞質(zhì)中的GR結(jié)合，使GR構(gòu)象發(fā)生改變并與熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）解離，GR隨之磷酸化，從而暴露核定位信號(hào)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，GR通過(guò)直接基因調(diào)控和間接基因調(diào)控調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗炎作用。直接基因調(diào)控主要依賴(lài)GR形成同二聚體并結(jié)合抗炎基因啟動(dòng)子區(qū)的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（glucocorticoid response element，GRE），促進(jìn)組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）的結(jié)合，從而增加抗炎基因轉(zhuǎn)錄；間接基因調(diào)控主要是通過(guò)活化的GR結(jié)合HDAC等抑制因子而發(fā)生去乙?；?，從而與核因子-κB（nuclear transcription factorkappa B，NF-κB）和激活蛋白-1（activating protein，AP-1）等促炎基因轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，并使之失活，最終減少促炎基因的表達(dá)［6-7］。在哮喘中，GC主要通過(guò)間接基因調(diào)控作用發(fā)揮抗炎效應(yīng)。

近年來(lái)諸多研究致力于探討重度哮喘對(duì)激素敏感性下降的機(jī)制，包括炎性轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)度表達(dá)，組蛋白乙?；惓?，免疫介導(dǎo)的細(xì)胞因子的失調(diào)，GR的結(jié)合活性及核轉(zhuǎn)移降低等［8-10］，從GC/GR及HDAC角度研究的并不多見(jiàn)。本研究以健康對(duì)照者、輕中度哮喘者及重癥哮喘者為對(duì)象，對(duì)比其外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood molecule cells，PBMCs）中GR的表達(dá)量、核轉(zhuǎn)運(yùn)功能、HDAC2活性及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1的激活情況，研究重度哮喘患者對(duì)GC敏感性下降的發(fā)生機(jī)制，為尋求重度哮喘治療新靶點(diǎn)和新方法提供科學(xué)依據(jù)。

資料和方法

研究對(duì)象招募來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科的12名輕中度哮喘患者，10名重度哮喘患者和12名健康對(duì)照者（表1）。根據(jù)全球支氣管哮喘防治創(chuàng)議（Global Initiative for Asthma，GINA）標(biāo)準(zhǔn)，將重度哮喘的定義為需要使用大劑量的藥物以維持良好的癥狀控制或即使在使用高劑量藥物治療下，仍有哮喘的持續(xù)癥狀、急性發(fā)作或氣流阻塞。哮喘的診斷也符合GINA的診斷標(biāo)準(zhǔn)［11］。排除標(biāo)準(zhǔn)包括吸煙史、慢性阻塞性肺病、支氣管擴(kuò)張癥、肺纖維化和遺傳性激素缺乏者。健康對(duì)照均無(wú)過(guò)敏性疾病病史。

所有受試者均告知研究目的及實(shí)驗(yàn)程序，并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：B2014-108）。

表1 研究對(duì)象的基本信息Tab 1 Baseline characteristics of research subjects ［Mean±SD or n（%）］

主要試劑和抗體使用以下試劑：地塞米松（dexamethasone，Dex）和 TNF-α（英國(guó) Sigma公司），HDAC2 Assay Kit（美國(guó)Abnova公司）。使用以下抗體：山羊抗兔抗體、抗GRa抗體（英國(guó)Abcam公司），NF-κB磷酸化抗體、c-Jun磷酸化抗體和c-Fos磷酸化抗體（美國(guó)Cell signaling Technology公司）。

PBMCs的分離與培養(yǎng)上午6～9點(diǎn)間抽取受試者外周靜脈血15 mL（10%EDAT抗凝），用Histopaque 1077試劑（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）按照說(shuō)明書(shū)步驟分離PBMCs。獲取的各組PBMCs在含有10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素100 U/mL，鏈霉素100μg/mL）的1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。

各組PBMCs的刺激與處理（1）按時(shí)間梯度：0.01 ng/mL TNF-α預(yù)處理各組PBMCs，然后分別在1、2、4、6 h用0.1 μmol/L Dex處理，孵育過(guò)夜后收集上清液。（2）按濃度梯度：在各組PBMCs中分別用不同濃度的地塞米松（0.01、0.1、1、10μmol/L）或PBS預(yù)處理（空白對(duì)照組）4 h，然后用0.01 ng/mL TNF-α刺激，孵育24 h后收集上清液。

ELISA檢測(cè)按照ELISA試劑盒（美國(guó)R＆D公司）說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定上清液中IL-8的濃度。

Western blot檢測(cè)將上述處理過(guò)的細(xì)胞在RIPA緩沖液中裂解，并提取總蛋白。然后將樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以脫脂奶粉封閉后滴加第一抗體（兔抗GR、兔抗GRα、Py-NF-κB，Py-c-FOS，Py-c-JUN或GAPDH），在 4 ℃下孵育過(guò)夜（1∶2 000稀釋?zhuān)?。然后將膜與山羊抗兔二抗（1∶10 000稀釋?zhuān)┮黄饻赜?，并使用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，分析總GR/GRα蛋白質(zhì)水平及磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子水平。以GAPDH用作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參，使用Vision Works LS 6.3.3軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)的相對(duì)定量。

免疫熒光將各組受試者的PBMCs用1μmol/L的Dex分別處理0、1、2 h后提取細(xì)胞并固定涂片，加入一抗4℃過(guò)夜，次日復(fù)溫后加入二抗孵育2 h，再加入DAPI染液染色后清洗封片，用共聚焦顯微鏡檢測(cè)和觀察GRα的核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)情況。

HDAC2活力檢測(cè)使用細(xì)胞核抽提試劑盒（美國(guó)Epigenteck公司）提取核蛋白，并根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用HDAC2 Assay kit分析每組PBMCs樣品中HDAC2的活力。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示。首先使用單因素方差分析（ANOVA）對(duì)所有組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，然后使用t檢驗(yàn)比較組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

重度哮喘患者PBMCs在TNFα誘導(dǎo)IL-8釋放實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)Dex敏感性下降在時(shí)間依賴(lài)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)用TNF-α對(duì)PBMCs進(jìn)行孵育后，分別于 1、2、4、6 h后加入Dex，結(jié)果顯示Dex能抑制健康對(duì)照組IL-8的釋放，輕中度哮喘組在1 h時(shí)間點(diǎn)IL-8釋放受抑制，而后續(xù)時(shí)間點(diǎn)Dex抑制程度明顯下降。重度哮喘組Dex對(duì)IL-8的釋放抑制作用在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均下降，且Dex加入時(shí)間越晚，抑制效果越弱（圖1A）。在劑量依賴(lài)實(shí)驗(yàn)中，用0.1、1、10μmol/L不同濃度的Dex孵育PBMCs，再加入TNF-α誘導(dǎo)IL-8釋放。隨著Dex濃度的逐漸升高，各組抑制IL-8釋放的作用均逐漸增加，但重度哮喘組IL-8的釋放量較健康對(duì)照組和輕中度哮喘組高（圖1B）。該結(jié)果表明，重度哮喘患者PBMCs在TNFα誘導(dǎo)IL-8釋放實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)Dex敏感性下降。

圖1 TNFα誘導(dǎo)IL-8釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定PBMCs對(duì)Dex的敏感性Fig 1 Dex sensitivity in TNF-α-induced IL-8 production of PBMCs

重度哮喘PBMCs的GR在Dex作用下的產(chǎn)生量及核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)情況為進(jìn)一步研究哮喘患者對(duì)GC不敏感的機(jī)制，用Western blot法測(cè)定健康對(duì)照組、輕中度哮喘組、重度哮喘組的PBMCs中總GR蛋白質(zhì)水平，發(fā)現(xiàn)隨病情嚴(yán)重程度加強(qiáng)，細(xì)胞總GR蛋白質(zhì)水平表現(xiàn)出明顯的代償趨勢(shì)（圖2）。在Dex誘導(dǎo)GRα水平的實(shí)驗(yàn)中，加入不同濃度Dex后，各組GRα水平均有增加。在健康對(duì)照組和輕中度哮喘組，Dex 1μmol/L時(shí)GRα水平明顯增高，且輕中度哮喘組顯示出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，而重度哮喘組在Dex 1μmol/L時(shí)仍未見(jiàn)明顯誘導(dǎo)GRα水平增高（圖3）。為繼續(xù)了解GRα的核定位是否與重癥哮喘患者對(duì)GC不敏感有關(guān)，將3組患者的PBMCs加入Dex處理，于0、1、2 h分別用共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察，測(cè)定核內(nèi)GRα免疫熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示在加入Dex前，GRα主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，加入Dex處理后，健康對(duì)照和輕中度哮喘組核內(nèi)GRα免疫熒光強(qiáng)度隨Dex作用時(shí)間呈遞增趨勢(shì)，尤其在2 h處均較空白對(duì)照明顯增強(qiáng)；而重癥哮喘組核內(nèi)GRα免疫熒光強(qiáng)度隨Dex作用時(shí)間增加未見(jiàn)明顯遞增現(xiàn)象，1 h和2 h處的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比無(wú)明顯上升（圖4）。

圖2 Western bolt檢測(cè)PBMCs中GR的表達(dá)量Fig 2 GR expression in PBMCs detected by Western bolt

圖3 Dex誘導(dǎo)PBMCs中GR蛋白質(zhì)水平的升高Fig 3 GR expression was induced by Dex in PBMCs

重度哮喘PBMCs核蛋白HDAC2活力下降分別提取健康對(duì)照者、輕中度哮喘及重度哮喘患者PBMCs的核蛋白，并測(cè)定各組核蛋白中HDAC2的活力。研究發(fā)現(xiàn)，輕中度哮喘較健康對(duì)照HDAC2活力輕度降低，但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而重度哮喘PBMCs核蛋白中HDAC2活力較健康對(duì)照組明顯降低（圖5）。

重度哮喘PBMCs中促炎基因轉(zhuǎn)錄因子激活我們用Western blot法半定量地測(cè)定了磷酸化的NF-κB及AP-1二聚體的亞基c-Fos、c-Jun。結(jié)果表明，py-NF-κB、py-c-Fos、py-c-Jun水平在健康對(duì)照、輕中度哮喘和重度哮喘中依次升高，輕中度哮喘與健康對(duì)照相比有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而重度哮喘 PBMCs中 NF-κB、c-Fos、c-Jun的磷酸化水平明顯增加（圖6）。

討 論

重度哮喘患者占哮喘患者總?cè)藬?shù)的5%～10%，占比雖然小，但因其對(duì)大劑量、全身使用激素的依賴(lài)甚至激素抵抗，57.2%的重度哮喘患者病情未能得到有效控制［4］。重度哮喘導(dǎo)致的慢性小氣道炎癥具有異質(zhì)性，由中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞及多種細(xì)胞因子參與，誘導(dǎo)痰中的嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞高于輕中度患者［10］。白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）是中性粒細(xì)胞的重要趨化因子，主要來(lái)源于人PBMCs和內(nèi)皮細(xì)胞，并在脂多糖和TNF-α等的誘導(dǎo)下合成和釋放［12］。重度哮喘患者PBMCs中出現(xiàn)IL-8的高表達(dá)常預(yù)示哮喘控制不良，而糖皮質(zhì)激素可通過(guò)GC-GR復(fù)合物與GRE的結(jié)合直接抑制IL-8的基因轉(zhuǎn)錄。因此，本研究在體外觀察糖皮質(zhì)激素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的IL-8的動(dòng)態(tài)抑制作用，以評(píng)價(jià)糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)性。我們的研究發(fā)現(xiàn)在重度哮喘患者的PBMCs中，無(wú)論在時(shí)序上還是不同濃度Dex處理下，GC對(duì)IL-8釋放的抑制作用始終低于輕中度患者及健康對(duì)照者，證實(shí)哮喘患者外周血對(duì)GC的敏感性降低，且下降程度與哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，因此我們猜想這種累及全身的效應(yīng)或與GC-GR復(fù)合物的功能狀態(tài)相關(guān)。

圖4 免疫熒光法檢測(cè)地塞米松處理下GRα的動(dòng)態(tài)入核情況Fig 4 Dex-induced GRαtransnuleus activity assessed by immunofluorescent staining

圖5 PBMCs核蛋白中HDAC2活力測(cè)定Fig 5 HDAC2 activity measurement in nucleoprotein of PBMCs

重度哮喘對(duì)GC敏感性降低機(jī)制仍不完全明確，GR的表達(dá)與活性狀態(tài)被認(rèn)為是GC發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵。GR 分為 GRα、GRβ、GRδ、GRγ4種亞型，研究認(rèn)為GC的抗炎效應(yīng)主要由GRα介導(dǎo)，而GRβ是其主要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子［13］。作為皮質(zhì)醇激素抗炎的基礎(chǔ)，大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明GRα表達(dá)和活性下降導(dǎo)致的GC抗炎作用下降是產(chǎn)生GC抵抗的重要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)選擇性沉默重度哮喘患者肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞的GRβ基因可以提高GRα的活性與表達(dá)量，從而改善重度哮喘對(duì)激素的反應(yīng)性［13］。我們的研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血總GR蛋白質(zhì)水平并未較正常受試者降低，反而隨病情嚴(yán)重程度表現(xiàn)出代償性的增加（總GR蛋白質(zhì)水平：重度哮喘組＞輕中度哮喘組＞健康組），進(jìn)而我們考慮哮喘患者的GC不敏感與GRα的量及功能狀態(tài)可能相關(guān)。在Dex誘導(dǎo)GRα表達(dá)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，健康組PBMCs隨著Dex孵育濃度的增高可以使GRα水平逐漸升高，但重度哮喘組即使用較高濃度的Dex孵育，也不能誘導(dǎo)GRα的更高表達(dá)。此外，GRα轉(zhuǎn)移入核是GC發(fā)揮功能的關(guān)鍵，我們通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察健康人與哮喘患者細(xì)胞核內(nèi)GRα熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)健康人和輕中度哮喘者核內(nèi)GRα熒光強(qiáng)度隨Dex的作用時(shí)間遞增明顯；但重度哮喘組并未呈現(xiàn)這種趨勢(shì)。我們的研究表明哮喘患者對(duì)GC不敏感的形成機(jī)制與GRα在激素誘導(dǎo)下的水平及GRα的核內(nèi)轉(zhuǎn)移減弱相關(guān)。

圖6 Western blot檢測(cè)PBMCs中促炎基因轉(zhuǎn)錄因子活性水平Fig 6 Transcription factor activity levels of pro-inflammatory genes in PBMCs measured by Western blot

NF-κB是在促炎癥反應(yīng)中起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，它在細(xì)胞質(zhì)中與抑制蛋白IκB結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞接受IL-2、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、TNF-α等刺激后，IκB發(fā)生磷酸化并降解，引導(dǎo)NF-κB從IκB中釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，驅(qū)動(dòng)下游促炎基因的轉(zhuǎn)錄［14-16］。AP-1是由 Fos和 Jun蛋白質(zhì)組成的異二聚體，可通過(guò)結(jié)合糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件而增強(qiáng)炎癥基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1的過(guò)度激活將增加下游促炎基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并可參與糖皮質(zhì)激素敏感性下降的發(fā)生機(jī)制［17］。我們的研究與此觀點(diǎn)相符，重度哮喘炎癥基因轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)明顯高于輕中度哮喘患者和健康對(duì)照者，其過(guò)度激活與GC不敏感的形成相關(guān)。

抗組蛋白乙酰化是GC減少炎癥基因轉(zhuǎn)錄的重要機(jī)制，HDAC2是GC發(fā)揮轉(zhuǎn)阻遏作用的關(guān)鍵蛋白。GC與GR結(jié)合后，可通過(guò)招募HDAC等輔助阻遏物，抑制炎癥基因轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB的活性，從而間接抑制炎癥基因的表達(dá)。有研究表明通過(guò)保護(hù)和恢復(fù)HDAC2的活性可改善體內(nèi)外試驗(yàn)對(duì)象的激素敏感性［18］。然而重度哮喘患者是否存在HDAC2的表達(dá)減少及活力下降，并最終影響GC的抗炎作用，目前各試驗(yàn)結(jié)果仍有爭(zhēng)議［19-22］。本研究比較了重度哮喘組、輕中度哮喘組及健康對(duì)照組PBMCs胞核蛋白的HDAC2活力，發(fā)現(xiàn)哮喘組HDAC2活性整體低于健康組，且重度哮喘組的HDAC2活性明顯低于輕中度哮喘組。說(shuō)明哮喘患者存在HDAC2活力降低，且降低的程度與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。由此考慮重度哮喘對(duì)GC的不敏感或可因HDAC2活力的大幅下降造成，著力于恢復(fù)HDAC2蛋白活性的治療或可有益于改善GC的敏感性。

本研究證實(shí)了在重度哮喘患者的PBMCs中存在激素不敏感，其機(jī)制與GRα產(chǎn)生量及核內(nèi)轉(zhuǎn)移障礙、炎性基因轉(zhuǎn)錄因子激活增加、細(xì)胞核蛋白中HDAC2活性下降相關(guān)。本研究在闡明重度哮喘患者的激素不敏感機(jī)制的同時(shí)，也為將來(lái)開(kāi)發(fā)針對(duì)這一類(lèi)型哮喘的新型靶向治療提供了新的思路。

作者貢獻(xiàn)聲明鄧至，鄒依寧 數(shù)據(jù)采集，統(tǒng)計(jì)分析，論文撰寫(xiě)。畢晶，閔智慧，曾瑜真，毛若琳，姜志龍 數(shù)據(jù)采集。陳智鴻 論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。