王 倩 王小欽 陳燕珍 趙光杰 吳宛玲 李念夷△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院血液科，2國(guó)際醫(yī)療中心 上海 200040）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是一組造血干/祖細(xì)胞克隆性疾病，表現(xiàn)為髓系發(fā)育不良，血細(xì)胞減少，并有進(jìn)展為急性髓系白血病的風(fēng)險(xiǎn)［1］。對(duì)MDS發(fā)生的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)至今仍十分有限，阻礙了MDS治療的進(jìn)展［2］。近年來(lái)表觀遺傳學(xué)改變?cè)贛DS發(fā)生中的作用日益受到重視。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一類由RNA聚合酶Ⅱ合成、長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸、沒(méi)有長(zhǎng)閱讀框架的RNA［3］。功能研究表明LncRNA在表觀遺傳學(xué)水平對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［4］。雖然目前已有研究表明 HOXB-AS3［5］、XIST［6］、MEG3［7］等LncRNA與MDS有關(guān)，但相對(duì)LncRNA眾多的基因數(shù)量和在高等真核生物復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要作用，仍有大量可能參與MDS病理過(guò)程的LncRNA未被發(fā)現(xiàn)。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)ABAT基因在MDS患者中具有高甲基化低表達(dá)的特點(diǎn)，ABAT的異常表達(dá)與MDS的不良預(yù)后有關(guān)，且可影響MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞系的增殖和凋亡［8-9］，但對(duì)于調(diào)控ABAT的上游分子仍不明確。近年來(lái)的研究表明，通過(guò)對(duì)多種高通量分析方法得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，相比只對(duì)單一芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析更加有助于揭示腫瘤發(fā)生過(guò)程中復(fù)雜的生物調(diào)控過(guò)程［10-11］。因此，本研究中我們將MDS患者與對(duì)照者骨髓標(biāo)本的 DEGs、DEMs、DELs進(jìn)行整合分析，構(gòu)建具有MDS特征的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從中篩選出調(diào)控ABAT的LncRNA，并對(duì)其在MDS中的功能進(jìn)行初步研究。本研究有助于進(jìn)一步了解LncRNA在MDS發(fā)生過(guò)程中的作用，以期為MDS的治療提供新的策略和靶點(diǎn)。

資料和方法

標(biāo)本來(lái)源LncRNA檢測(cè)選擇2015年1月1日至2016年12月30日復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院血液科收治的23例MDS患者，其中男性15例、女性8例，平均年齡65歲（29～82歲）；作為對(duì)照的7例非造血腫瘤患者（如缺鐵性貧血、免疫性血小板減少癥、脾功能亢進(jìn)癥等）平均年齡38歲（23～78歲），兩組性別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。芯片檢測(cè)病例組為4例MDS患者，其中 2例分型為 RAEB-1（refractory anemia with excess blasts 1），2例為 RAEB-2，男性 3例、女性1例，平均年齡67歲（24～80歲）；另以年齡（±5歲）、性別匹配，選擇同期行骨髓穿刺檢查的4例非造血腫瘤患者作為對(duì)照組。所有患者采集骨髓標(biāo)本時(shí)均為初次診斷、未接受化療、排除MDS/骨髓增殖性疾?。╩yeloproliferative neoplasms，MPN）及MDS轉(zhuǎn)白患者。采集骨髓標(biāo)本2～3 mL后，均使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)GE公司）密度梯度離心法獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）。MDS 診斷及分型均按照2016年版WHO淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)［1］。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2015-269），患者均簽署了臨床研究知情同意書(shū)。

細(xì)胞系人急性白血病細(xì)胞系THP-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院（上海），人MDS轉(zhuǎn)白急性白血病細(xì)胞系SKM-1購(gòu)自日本細(xì)胞庫(kù)（the Japanese Collection of Research Bioresources，LCRB）。作為對(duì)照的 HEK-293T細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院（上海）。所有細(xì)胞系均在RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)GE公司）中培養(yǎng)，添加 10% 胎牛血清（Gibco-BRL，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱，每2天換液1次。

芯片分析通過(guò)血液基因組DNA和RNA提取試劑盒（美國(guó)Qiagen公司）對(duì)4例MDS患者和4例對(duì)照患者的骨髓標(biāo)本提取基因組DNA和RNA。采用Infinium Human Methylation 450K Bead Chips甲基化芯片和Agilent human genomewide gene expression 60K Bead Chips表達(dá)譜基因芯片（上海歐易生物科技有限公司）檢測(cè)。60K Bead Chip人類全基因組表達(dá)芯片（Agilent）中共包含27 958個(gè)Entrez Gene RNA和7 419個(gè)LncRNA。芯片掃讀后會(huì)獲得原始信號(hào)值、標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)值以及檢出情況，對(duì)所有樣本進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），考察樣品的分布情況，確定重復(fù)樣品的均一性，之后根據(jù)芯片確認(rèn)單中提供的分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)。分位數(shù)歸一化和隨后的數(shù)據(jù)處理通過(guò)Genespring軟件（版本12.0，美國(guó)Agilent Technologies公司）完成。之后對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，表達(dá)量在兩組間表達(dá)差異超過(guò)2倍，Student"s t檢驗(yàn)P＜0.01被認(rèn)為存在差異表達(dá)。

為了構(gòu)建MDS相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，我們采用一種基于LncRNA-微RNA（microRNA，miRNA）靶向方法來(lái)預(yù)測(cè)LncRNA的潛在靶標(biāo)。首先，對(duì)每種DELs，通過(guò) miRcode數(shù)據(jù)庫(kù)［12］獲得潛在的 miRNA產(chǎn)物。之后在數(shù)據(jù)庫(kù)miRbase v21、mirTarbase、miRanda 2010、miRbase v18、Tarbase5.0、targetscan v6.2中預(yù)測(cè)miRNA的潛在靶標(biāo)，過(guò)濾掉了少于3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的基因。將剩余的基因與芯片篩選出的差異表達(dá)基因組進(jìn)一步比較。然后使用chip Base數(shù)據(jù)庫(kù)分析LncRNA的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)錄因子與差異基因，利用此種方法構(gòu)建了MDS相關(guān)的LncRNA-miRNA-DEGs-轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

基于LncRNA-TFs-DEGs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)篩選ABAT基因的調(diào)控LncRNA 采用Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）評(píng)估來(lái)構(gòu)建ABAT與相關(guān)LncRNA的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)計(jì)算絕對(duì)PCC，取P值≤0.01，PCC倍數(shù)＞0.99作為閾值，建立ABAT基因和DELs的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模型。我們通過(guò)計(jì)算PCC和P值來(lái)評(píng)估LncRNA-信使RNA（messenger RNA，mRNA）的相關(guān)性。用Cytoscape software 3.2.0（美國(guó)The Cytoscape Consortium公司）繪制ABATDELs-DEGs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

qRT-PCR法檢測(cè)LncRNA-SET2-1和ABAT的表達(dá)用 Trizol（Invitrogen，美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）抽提骨髓標(biāo)本及培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，用Takara PrimeScript RT Master Mix試劑盒（日本Takara公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Applied Biosystems?7500 Real-Time PCR system（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μL，冰上加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，每條引物0.4μL（10μmol/L），SYBR?Premix Ex Taq?（日本Takara公司）10μL，ROX Reference DyeⅡ（日本Takara公司）0.4μL，雙蒸水6.8μL。反應(yīng)條件：95℃反應(yīng)30 s預(yù)變性，95℃反應(yīng)5 s，60℃反應(yīng)34 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列如下，LncRNA-SET 2-1，F(xiàn)orward：5"-TCGCCGGAGTCATATTATCG-3"，Reverse：5"-CAGCAGCAGGAAGAGCAGTT-3"；ABAT，F(xiàn)orward：5"-CCGACTACAGCATCCTCTCC-3"，Reverse：5"-GGTTCTCTTTCACAAACTCTTCC-3"；GAPDH，F(xiàn)orward：5"-GACCTGACCTGCCGT-CTA-3"，Reverse：5"-AGGAGTGGGTGTCGCTG-T-3"。 采 用 2-ΔΔCT方法計(jì)算LncRNA-SET 2-1和ABAT表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，每組取3個(gè)復(fù)孔均值，根據(jù)各樣本的平均CT值，以2-ΔΔCT表示目的基因表達(dá)水平，LncRNA-SET 2-1 或 ABAT 相 對(duì) 表 達(dá) 量 =2-ΔΔCT（LncRNA-SET 2-1或ABAT）-2-ΔΔCT（GAPDH）。

構(gòu)建LncRNA-SET2-1過(guò)表達(dá)慢病毒載體和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系按照分子克隆技術(shù)指南［13］構(gòu)建含有LncRNA-SET 2-1過(guò)表達(dá)片段的GV 470慢病毒載體（上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKM-1細(xì)胞和THP-1細(xì)胞，按1×106/mL接種于6孔板，過(guò)夜后將LncRNA-SET 2-1過(guò)表達(dá)的慢病毒載體和對(duì)照空載體分別轉(zhuǎn)染SKM-1細(xì)胞和THP-1細(xì)胞。由于慢病毒載體帶有綠色熒光蛋白序列，轉(zhuǎn)染后72 h通過(guò)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白強(qiáng)度來(lái)評(píng)估細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，陽(yáng)性細(xì)胞比例大于80%。之后，在SKM-1細(xì)胞和THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)基中分別加入1μg/mL、2μg/mL的嘌呤霉素。培養(yǎng)2周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染帶有嘌呤霉素抗性慢病毒載體的細(xì)胞系。繼續(xù)培養(yǎng)4天后，應(yīng)用qRTPCR檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中LncRNA-SET 2-1的表達(dá)水平。

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LncRNA-SET 2-1的SKM-1細(xì)胞、THP-1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照細(xì)胞，按1×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)5天，每3天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)，每孔加入5μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后分光光度計(jì)上測(cè)量各孔450 nm處吸光度值（D），計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LncRNA-SET 2-1的SKM-1細(xì)胞、THP-1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照細(xì)胞按1×106/mL接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS洗2次后加入200μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V-APC和5μL 7-AAD（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）混勻，避光室溫孵育15 min。流式細(xì)胞儀（BD Accuri C6，美國(guó)BD Biosciences公司）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，使用Flowjo 7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 25.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

芯片整合分析MDS患者相對(duì)對(duì)照者的BMMNCs，應(yīng)用表達(dá)譜基因芯片共篩選出1 937個(gè)DEGs，其中853個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1 084個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；篩選出214個(gè)DELs，其中102個(gè)LncRNA表達(dá)上調(diào)，112個(gè)LncRNA表達(dá)下調(diào)。應(yīng)用甲基化基因芯片篩選出515個(gè)DEMs，其中高甲基化基因304個(gè)，低甲基化基因211個(gè)。對(duì)篩選出的DEGs、DELs、DEMs進(jìn)行整合分析，構(gòu)建 MDS的LncRNA-miRNA-DEGs-TFs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖 1）。該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包括：LncRNA-TFs-DEGs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，TFs-miRNA-LncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，miRNA-DEGs-DEMs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。GO（Gene ontology）分析差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過(guò)程，前10位GO富集的生物學(xué)過(guò)程包括：細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)信號(hào)，凋亡調(diào)控，磷酸代謝過(guò)程，免疫反應(yīng)，防御反應(yīng)，細(xì)胞增殖調(diào)控，生物合成過(guò)程正向調(diào)控，磷酸化過(guò)程，通過(guò)RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，生物黏附。

圖1 MDS整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig 1 The integrated regulatory network of MDS

基于LncRNA-TFs-DEGs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)篩選ABAT基因的調(diào)控LncRNA 在前期的研究中，我們篩選出6個(gè)高甲基化低表達(dá)的基因（ABAT，DAPPI，F(xiàn)ADD，LRRFIPI，PLBDI，SMPD3）并建立了 MDS的CpG島甲基化表型，可能成為MDS診斷的潛在分子生物學(xué)標(biāo)志［8］。本研究對(duì)以上6個(gè)基因進(jìn)行了深入的信號(hào)通路整合分析，僅4個(gè)基因（ABAT，DAPP1，F(xiàn)ADD和SMPD3）有功能信號(hào)通路。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，ABAT基因異常低表達(dá)與MDS的不良預(yù)后有關(guān)，下調(diào)其表達(dá)水平可促進(jìn)髓系腫瘤細(xì)胞系的增殖能力、抑制細(xì)胞凋亡，提示ABAT可能參與MDS的發(fā)生過(guò)程［9］。因此，我們?cè)跇?gòu)建的MDS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，對(duì)ABAT參與的LncRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析。通過(guò)建立ABATDELs-DEGs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)了6個(gè)與ABAT共表達(dá)且相關(guān)性最強(qiáng)的DELs。根據(jù)PCC對(duì)這6個(gè)LncRNA進(jìn)行排序發(fā)現(xiàn)，LncRNA-SET 2-1與ABAT變化趨勢(shì)的PCC最高（表1）。利用UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//genome.ucsc.edu）檢索發(fā)現(xiàn)，LncRNASET 2-1位于人類基因組6號(hào)染色體，為反義RNA，包括3個(gè)外顯子，長(zhǎng)度約385bp。對(duì)其進(jìn)行PhyloCSF評(píng)分，確定其為非編碼RNA。經(jīng)DELs-DEGs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA-SET 2-1與ABAT、NCF2、SPTLC2、QPRT基因共表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)LncRNA-miRNA-DEGs-TFs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析和數(shù)據(jù)庫(kù)信息的匹配，預(yù)測(cè)到LncRNA-SET 2-1可能為miRNA 96的前體，而ABAT可能為miRNA 96的靶分子。根據(jù)以上生物信息學(xué)分析，LncRNA-SET 2-1可能對(duì)ABAT具有調(diào)控作用，且參與了MDS發(fā)展過(guò)程。因此，我們進(jìn)一步研究LncRNA-SET 2-1在MDS患者及細(xì)胞系中的表達(dá)情況，及對(duì)MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞功能的影響。

表1 通過(guò)ABAT-DELs-DEGs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)的6個(gè)與ABAT基因共表達(dá)且相關(guān)性最強(qiáng)的DELsTab 1 Six DELs that are correlated with the ABAT gene based on the ABAT-DELs-DEGsco-expression network

LncRNA-SET2-1在MDS患者和MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞系中的表達(dá)情況MDS患者骨髓細(xì)胞中LncRNA-SET 2-1的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（1.63±0.96vs.5.55±1.69，P＜0.000 1），同時(shí)檢測(cè)ABAT基因在MDS患者骨髓細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量也顯著低于對(duì)照組（0.33±0.12vs.0.93±0.25，P＜0.000 1）。在MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞系SKM-1和急性白血病細(xì)胞系THP-1中，LncRNA-SET 2-1的表達(dá)量顯著低于對(duì)照細(xì)胞HEK-293T（0.42±0.12vs.4.12±0.60，0.62±0.23vs.4.12±0.60，P＜0.000 1）（圖 2）。

圖2 LncRNA-SET2-1和ABAT在MDS患者和MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞系中的表達(dá)水平Fig 2 Expression levels of LncRNA-SET2-1 and ABAT in MDSpatients and cell lines

MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞系中LncRNA-SET2-1過(guò)表達(dá)對(duì)ABAT基因表達(dá)的影響穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LncRNA-SET 2-1過(guò)表達(dá)慢病毒載體的SKM-1細(xì)胞系和THP-1細(xì)胞系中，LncRNA-SET 2-1的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照空載體組（9.65±1.24 vs.0.44±0.34，10.10±0.89 vs.0.38±0.21，P＜0.000 1）。穩(wěn)定過(guò)表達(dá) LncRNASET 2-1的SKM-1細(xì)胞和THP-1細(xì)胞中ABAT基因的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)2倍（1.86±0.13 vs.0.91±0.02，1.79±0.21 vs.0.89±0.03，P＜0.01）。但我們對(duì)前期研究中構(gòu)建的ABAT敲減SKM-1和THP-1細(xì)胞系［9］中 LncRNA-SET 2-1的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，與對(duì)照組相比未發(fā)生顯著改變（0.35±0.01 vs.0.39±0.01，0.47±0.03 vs.0.40±0.01，P＞0.05）（圖 3）。

圖3 LncRNA-SET2-1過(guò)表達(dá)對(duì)ABAT基因表達(dá)的影響Fig 3 Effect of LncRNA-SET2-1 overexpression on ABAT gene

MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞系中LncRNA-SET2-1過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LncRNASET 2-1的SKM-1細(xì)胞和THP-1細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖活力在72 h（D值分別為1.10±0.03 vs.1.47±0.02，0.75±0.02 vs.1.42±0.08，P＜0.001）、96 h（D 值分別為 1.61±0.09 vs.2.23±0.13，P＜0.001；1.25±0.08 vs.2.18±0.23，P＜0.05）均顯著下降（圖4）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)LncRNA-SET 2-1的SKM-1細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組（73.39%±2.78%vs.57.77%±2.36%，P=0.02），同樣，過(guò)表達(dá) LncRNA-SET 2-1的 THP-1細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例也顯著高于對(duì)照組（74.59%±3.07%vs.54.48%±2.19%，P=0.001）（圖 5）。說(shuō)明LncRNA-SET 2-1過(guò)表達(dá)對(duì)MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞的增殖活力具有抑制作用，并促進(jìn)MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞凋亡。

討 論

圖4 LncRNA-SET2-1過(guò)表達(dá)抑制MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞增殖活力Fig 4 LncRNA-SET2-1 overexpression reduced the viability of MDStransformed leukemia cell

圖5 LncRNA-SET2-1過(guò)表達(dá)促進(jìn)MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞凋亡Fig 5 LncRNA-SET2-1 overexpression induced MDStransformed leukemia cell apoptosis

LncRNA作為人類細(xì)胞中大量存在的非編碼RNA，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞周期、個(gè)體發(fā)育等重要生命活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，涉及到表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面的復(fù)雜調(diào)控［14］。目前，在多種類型腫瘤中都已發(fā)現(xiàn)存在LncRNA的失調(diào)，說(shuō)明其與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)［15］。LncRNA在調(diào)控造血發(fā)育中也起到重要作用，其異常調(diào)控參與了造血腫瘤的發(fā)展，如AML，MPN，ALL等［16-17］。雖然目前已有 LncRNA與MDS發(fā)展有關(guān)的報(bào)道，但相比AML，對(duì)參與MDS病理過(guò)程的LncRNA認(rèn)識(shí)仍十分有限。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，ABAT基因在MDS中具有診斷和預(yù)后價(jià)值，并可影響MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞的增殖活力和凋亡。本研究中，我們基于基因芯片整合分析構(gòu)建ABAT-DELs-DEGs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，篩選出ABAT基因可能的調(diào)控LncRNA，并對(duì)該LncRNA在MDS患者和MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞中的表達(dá)情況及功能進(jìn)行了初步研究。

高通量基因芯片是幫助發(fā)現(xiàn)MDS發(fā)生過(guò)程中新的調(diào)控分子的重要工具，但是，僅依靠單一的LncRNA芯片或者mRNA芯片，難以從海量的數(shù)據(jù)中篩選出有價(jià)值的信息。利用多種不同芯片進(jìn)行生物信息學(xué)整合分析、構(gòu)建分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有助于揭示復(fù)雜的生物調(diào)控過(guò)程、篩選發(fā)現(xiàn)生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子［18］。本研究中，我們對(duì)MDS患者和對(duì)照者骨髓標(biāo)本中的DEGs、DELs和DEMs進(jìn)行整合分析，通過(guò)對(duì)DELs靶分子與結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)，與表達(dá)芯片篩出的DEGs進(jìn)行對(duì)比分析，構(gòu)建了MDS相關(guān)的LncRNA-miRNA-DEGs-TFs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在該網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，我們尋找到可能作為L(zhǎng)ncRNA-SET 2-1剪切產(chǎn)物的miRNA 96，推測(cè)miRNA 96可能作為ABAT的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)ABAT基因進(jìn)行調(diào)控，提示可能存在LncRNA-SET 2-1-miRNA 96-ABAT調(diào)控軸。

我們首次在MDS患者骨髓標(biāo)本和MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞系中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LncRNA-SET 2-1表達(dá)顯著下調(diào)，與同時(shí)檢測(cè)的ABAT基因表達(dá)變化趨勢(shì)一致。過(guò)表達(dá)LncRNA-SET 2-1后，ABAT基因表達(dá)上調(diào)，而下調(diào)ABAT表達(dá)，LncRNA-SET 2-1表達(dá)不受影響，提示LncRNA-SET 2-1可能為ABAT上游調(diào)控分子，且對(duì)ABAT具有正向調(diào)控作用。功能研究表明，LncRNA-SET 2-1過(guò)表達(dá)會(huì)抑制MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明在MDS中，LncRNASET 2-1異常下調(diào)可能對(duì)造血細(xì)胞腫瘤化具有一定作用。由于在MDS患者和MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞系中，LncRNA-SET 2-1與ABAT基因表達(dá)變化一致，對(duì)細(xì)胞表型影響一致，且LncRNA-SET 2-1可能為ABAT上游調(diào)控分子，結(jié)合芯片整合分析可能存在LncRNA-SET 2-1-miRNA 96-ABAT調(diào)控軸的結(jié)果，我們推測(cè)LncRNA-SET 2-1和ABAT可能存在競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）的關(guān)系。ceRNA是LncRNA發(fā)揮生物學(xué)功能的9種主要方式之一，代表了一種全新的基因表達(dá)調(diào)控模式，相比miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，涉及更多的RNA分子，更為精細(xì)和復(fù)雜，是目前腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)［19-21］。對(duì) LncRNA-SET 2-1-miRNA 96-ABAT調(diào)控軸的研究可為我們從轉(zhuǎn)錄組水平深入探索MDS的發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)新的視角。

本研究首次基于MDS患者骨髓標(biāo)本不同基因芯片的整合分析，發(fā)現(xiàn)可能存在LncRNA-SET 2-1-miRNA 96-ABAT調(diào)控軸，并初步驗(yàn)證了LncRNASET 2-1對(duì)ABAT基因具有正向調(diào)控作用，且LncRNA-SET 2-1表達(dá)失調(diào)可能參與了MDS的病理過(guò)程。由于本文僅對(duì)LncRNA-SET 2-1在MDS中的功能進(jìn)行了初步探索，因此具有一定局限性，關(guān)于LncRNA-SET 2-1與ABAT之間具體調(diào)控方式和是否存在ceRNA的實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。本研究為從轉(zhuǎn)錄組水平深入探索MDS發(fā)生的分子機(jī)制提供了新的生物信息學(xué)分析方法，并提出了可能參與MDS發(fā)生的新的LncRNA及其作用方式，對(duì)LncRNA-SET 2-1-ABAT調(diào)控軸的深入研究將為認(rèn)識(shí)MDS的病理機(jī)制提供新的方向。

作者貢獻(xiàn)聲明王倩 論文構(gòu)思，數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，論文撰寫(xiě)和修訂。王小欽 數(shù)據(jù)審核，論文修訂。陳燕珍 臨床樣本分析。趙光杰細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。吳宛玲 細(xì)胞活性和凋亡實(shí)驗(yàn)。李念夷 生物信息學(xué)分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。