王秋紅 鄭冬麗 司艷娟

經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkinlymphoma，CHL)在霍奇金淋巴瘤中約占95%，以中青年人居多，好發(fā)于男性患者[1-2]。該病的形態(tài)學特征主要是特征性Hodgkin/Reed.Sternberg(HRS)細胞，細胞數(shù)量稀少，不到總細胞數(shù)的1%；還有大量的炎癥細胞背景，包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞、組織細胞、嗜酸細胞和中性粒細胞等構成腫瘤細胞生存的微環(huán)境[3-4]。近年來隨著治療的規(guī)范化，CHL治愈率逐步提高，目前有80%～90%的患者可被治愈，5年生存率可達70%～80%，但仍有5%～10%的患者會出現(xiàn)原發(fā)耐藥，40%的患者出現(xiàn)緩解后復發(fā)，從而表現(xiàn)為復發(fā)難治[5-6]。因此，尋找新的生物指標來提示預后、指導治療是有待解決的一大問題。有研究顯示，HRS細胞周圍的微環(huán)境在CHL的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并且與CHL的預后密切相關[7-9]。有文獻報道，微環(huán)境中腫瘤相關的巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAM)及細胞毒T細胞(cytotoxic T cells，CTL)相關的標志物與CHL的預后密切相關[9-11]。本研究旨在研究叉頭轉錄因子3(forkhead box protein 3，F(xiàn)OXP3)、集落刺激因子1受體(colony stimulating factor 1 receptor，CSF-1R)在CHL中的表達，并結合患者臨床特征和隨訪資料進行相關分析，探討其評估CHL預后的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2015年2月至2017年8月我院收治的45例CHL患者，其中男性27例，女性18例，中位年齡24歲(7～72歲)。所有患者均經(jīng)手術或針吸穿刺活檢獲得病理組織，經(jīng)病理及免疫組化確診為CHL，其診斷標準參照2008版世界衛(wèi)生組織(WHO)淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類標準。研究方案經(jīng)我院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2 標本處理及免疫組織化學檢測

所有標本均經(jīng)4%中性甲醛緩沖液固定，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，制作3～4 mm切片。將組織標本置于65 ℃烤箱放置90 min，二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，pH 7.4檸檬酸鹽緩沖液高壓修復3 min，冷卻至室溫，3%H2O2，浸泡20 min以去除過氧化物酶活性。CSF-1R抗體(Abcam，英國)，F(xiàn)OXP3抗體(Abcam，英國)4 ℃孵育過夜；室溫孵育30 min，辣根過氧化物酶標記的通用二抗37 ℃孵箱孵育20 min；DAB顯色，蘇木精復染。實驗均設陽性對照及陰性空白對照：陽性對照為已證實FOXP3及CSF-1R陽性的相應組織(扁桃體組織以及皮膚鱗狀細胞癌)；陰性對照為以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗工作液。每張切片選取5個高倍視野(×400)，計數(shù)陽性細胞數(shù)所占百分比，CSF-1R以陽性細胞數(shù)所占百分比<30%記為陰性(-)，≥30%記為陽性(+)；FOXP3以陽性細胞數(shù)所占百分比<25%記為低表達，>25%記為高表達。

1.3 EB病毒(EBV)編碼的小mRNA(EBER)檢測

嚴格按照EBER原位雜交試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)說明書進行操作。

1.4 治療

45例患者中21例(46.7%)接受單純化療，24例(53.3%)接受放、化療聯(lián)合的綜合治療；其中40例(88.9%)患者接受以ABVD(阿霉素、博來霉素、長春花堿、達卡巴嗪)為主方案化療，5例(11.1%)高腫瘤負荷的年輕患者以BEACOPP方案(博來霉素、依托泊苷、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、丙卡巴肼、潑尼松)化療?；颊呋煰煶虜?shù)為4～8個周期(中位療程數(shù)為6個周期)。放療方式包括：擴大野放療(extended-field radiation therapy，EFRT)和受累野放療(involved-field radiationtherapy，IFRT)，18例患者接受EFRT，6例患者接受IFRT。中位放療劑量36 Gy(20～50 Gy)。4例患者序貫行自體干細胞移植(autologous stem cell transplant，ASCT)。

1.5 隨訪

隨訪時間指從確診為CHL至死亡或隨訪截止的時間，隨訪截止時間為2020年9月30日，45例患者均采用電話隨訪?？偵?OS)時間從疾病確診計算至任何原因引起的死亡、失訪或隨訪結束。無進展生存(PFS)時間定義為從初診時間至第一次進展、復發(fā)或任何原因引起死亡的時間。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；以Kaplan Meier及Log-rank檢驗進行生存時間相關分析，壽命表法計算生存率；對Cox回歸模型進行多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CHL患者臨床病理特征

45例CHL患者中男性27例，6例患者年齡≥45歲。依據(jù)WHO 2008版淋巴瘤分類標準進行分類：23例(51.1%)為結節(jié)硬化型(NSHL)，19例(42.2%)為混合細胞型(MCHL)，2例(4.4%)為淋巴細胞消減型(LDHL)，1例(2.2%)為富于淋巴細胞型(LRCHL)。AnnArbor分期Ⅰ～Ⅱ期者27例(60.0%)，Ⅲ～Ⅳ期者18例(40.0%)。國際預后指數(shù)(IPI)評分1～2分者42例(93.3%)，3～5分者3例(6.7%)。根據(jù)B癥狀(發(fā)熱、盜汗、6個月內(nèi)體重減輕>10%)診斷標準，有B癥狀的患者共11例(24.4%)。血清乳酸脫氫酶(LDH)超過正常值高限(240 U/l)者15例(33.3%)，血清B2微球蛋白(B2-MG)超過正常值高限(2.60 mg/l)者5例(11.1%)。全部患者標本均進行了EBER原位雜交檢測，檢測結果顯示EBV陽性率為37.8%(17/45)。

2.2 FOXP3、CSF-1R表達及其與臨床特征的相關性

FOXP3高表達者23例(51.1%)；CSF-1R陽性者18例(40.0%)。將患者的臨床特征分別與FOXP3、CSF-1R表達進行相關性分析，結果僅顯示FOXP3表達與EBER相關(P=0.033)(表1)。

表1 CHL患者FOXP3、CSF-1R表達與臨床特征的相關性分析(例，%)

2.3 療效評價及預后分析

全組45例CHL患者中，截止到隨訪結束有18例患者死亡(40.0%)，18例患者均死于疾病復發(fā)進展。有27例(60.0%)患者存活?；颊咧形簧鏁r間為69個月(14～119個月)，5年PFS率為55.6%(25/45)，5年OS率為77.8%(35/45)。對45例CHL患者的年齡、性別、分期等因素進行5年生存分析。結果顯示，IPI評分(P=0.022)、FOXP3蛋白(P<0.001)及EBER(P=0.001)是影響患者5年PFS預后獨立影響因素，見表2。

表2 CHL患者5年總生存和無進展生存的多因素分析

3 討論

3.1 CHL患者FOXP3、CSF-1R表達及與常見臨床特征的相關性分析

患者的FOXP3、CSF-1R蛋白表達與患者年齡、Ann-Arbor分期、有無B癥狀、LDH、組織學亞型等臨床病理特征的相關性仍存在爭議。Koh等分析112例CHL患者臨床資料發(fā)現(xiàn)，CSF-1R蛋白表達僅與患者年齡(≥45歲)相關[12-15]。另外，他們還發(fā)現(xiàn)微環(huán)境中非腫瘤細胞CSF-1R蛋白高表達者，無事件生存(event.free survival，EFS)、OS均較差，并且CSF-1R蛋白的表達與CD163的表達密切相關，這與CSF-1蛋白誘導TAM向M2亞型極化、促進腫瘤進展有關[16-17]。CSF-1/CSF-1R信號通路在多種腫瘤中起促瘤作用。在卵巢癌中，CSF-1與其受體CSF-1R共表達，是預后不良的標志，并且可以作為腫瘤分級的診斷指標。

3.2 CHL患者5年無進展生存和總生存單因素以及多因素分析

本研究發(fā)現(xiàn)微環(huán)境中CSF-1R蛋白的表達與CHL患者的5年OS密切相關。目前CSF-1R抑制劑PLX3397在CHL群組中進行二期臨床試驗，且顯示出一定的治療療效。另外一種CSF-1R的抑制劑JNJ_40346527，在復發(fā)難治的CHL中也顯示良好的耐受性。關于FOXP3蛋白表達與CHL患者EBV感染之間的相關性，Baumforth等研究發(fā)現(xiàn)FOXP3蛋白的表達與EBV感染相關，與本研究結果一致[18-19]。EBV感染CHL患者后，通過編碼EBV核抗原1(EBVnuclear antigen 1，EBNAl)蛋白誘導趨化因子CCL20表達上調(diào)。CCL20表達的上調(diào)，促使微環(huán)境腫瘤細胞周圍調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)數(shù)量增多，進而促使EBV感染的腫瘤細胞(HRS細胞)發(fā)生病毒特異性免疫反應逃逸。在卵巢癌、非小細胞肺癌等實體瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3蛋白高表達提示患者預后不良。與實體瘤相反，Krausz等發(fā)現(xiàn)在霍奇金淋巴瘤(HL)中腫瘤浸潤的Treg數(shù)目與患者的預后呈正相關，其原因可能與HL炎性微環(huán)境有關。在濾泡性淋巴瘤的研究中也得出一致結論[20-22]。Greaves等認為在CHL中FOXP3蛋白高表達者OS較好，且FOXP3蛋白的表達與CD68蛋白的表達相關[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3蛋白的表達與患者的5年PFS密切相關，是影響該組CHL患者5年PFS的獨立預后因素。另外，本研究發(fā)現(xiàn)EBV感染是影響該組CHL患者5年PFS、OS的獨立預后因素，但樣本量偏少，難以避免統(tǒng)計結果的偏倚，準確結論有待進一步增加病例數(shù)及開展多中心研究予以證實。

綜上所述，微環(huán)境相關的預后因子FOXP3、CSF-1R均與CHL患者的預后相關，對CHL患者的預后起一定判斷作用，同時也為CHL的靶向治療提供了新的線索及理論依據(jù)。