張麗靜 薛惠英 胡 捷

卵巢癌作為女性最常見的惡性腫瘤之一，5年生存率僅40%，尋找有效可靠的生物標(biāo)志物對(duì)該病的病情及預(yù)后進(jìn)行判斷具有重要的臨床價(jià)值[1-2]。B7H3、B7H4蛋白均屬于B7蛋白超家族成員，在免疫系統(tǒng)中可通過抑制T細(xì)胞或巨噬細(xì)胞功能參與抗腫瘤免疫反應(yīng)，影響腫瘤的增殖及免疫調(diào)控過程。在肺癌、乳腺癌等實(shí)體腫瘤中，B7H3、B7H4蛋白已被證明對(duì)腫瘤的病理分期及預(yù)后具有一定的判斷價(jià)值[3-4]。在卵巢癌的免疫治療中，同屬B7超蛋白家族成員的程序性死亡受體-1(Programmed death receptor-1，PD-1)的單克隆抗體已被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于包括卵巢癌在內(nèi)的實(shí)體腫瘤的治療，取得了良好的效果[5]。本研究通過對(duì)卵巢上皮癌組織中B7H3、B7H4蛋白表達(dá)改變進(jìn)行研究，旨在為該病的生物標(biāo)志物發(fā)掘及免疫靶向治療藥物開發(fā)提供有價(jià)值的研究基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇本院婦產(chǎn)科2018年3月至2020年3月收治上皮性卵巢癌患者106例作為研究對(duì)象，納入研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理檢查診斷明確為上皮性卵巢癌，符合《卵巢癌診療規(guī)范(2018年版)》[6]；②同意接受病理檢查；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其它惡性腫瘤者；②合并慢性感染性疾病者；③入院前接受過放化療、靶向治療者；④治療中途轉(zhuǎn)院者。選擇同期醫(yī)院收治的卵巢良性患者50例作為對(duì)照組，收集其卵巢組織，研究組年齡32～75歲，平均年齡(53.18±5.24)歲，絕經(jīng)前34例，絕經(jīng)后72例，對(duì)照組年齡33～71歲，平均(52.29±4.94)歲，絕經(jīng)前29例，絕經(jīng)后43例，兩組患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究納入對(duì)象均簽署對(duì)研究的知情同意書并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 卵巢癌組織B7H3、B7H4檢測

將本院病理科收集的組織蠟塊只做為組織切片，經(jīng)DAB免疫染色、恒溫烘烤、二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水等步驟后，加入一抗進(jìn)行孵育，孵育完成后將倍比稀釋的B7H3及B7H4抗體加入組織切片表面，4 ℃孵育過夜后，采用PBS洗滌，二抗再次孵育完成后加入DAB顯色液進(jìn)行脫水顯色、封片，所用抗體購自北京中杉金橋公司。由兩名病理科醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立盲法結(jié)果判定：根據(jù)切片的陽性細(xì)胞比例及著色深度進(jìn)行計(jì)分，以半定量法統(tǒng)計(jì)結(jié)果，視野下陽性細(xì)胞百分率判定：0分：>5%，1分：5%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：>75%。陽性細(xì)胞著色深度判定：0分：無色或與背景色重疊，1分：淺棕黃色，2分：棕黃色，3分：棕褐色，將細(xì)胞陽性百分率判定得分與著色深度判定得分相乘結(jié)果為免疫組化染色評(píng)分。

1.3 血清中可溶性B7H3、B7H4檢測

患者在入院后抽取其外周靜脈血2 ml，常規(guī)離心分離血清后，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中可溶性B7H3、B7H4蛋白水平，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物有限公司，均按照試劑盒說明書中操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢癌患者病灶組織及血清中B7H3、B7H4蛋白表達(dá)水平比較

上皮性卵巢癌患者病灶組織、血清中B7H3、B7H4水平均高于卵巢良性腫瘤患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同卵巢癌患者病灶組織及血清中B7H3、B7H4蛋白表達(dá)水平比較

2.2 上皮性卵巢癌病灶組織中B7H3、B7H4蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性

上皮性卵巢癌患者病灶組織中B7H3、B7H4表達(dá)水平與FIGO分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與年齡、組織學(xué)類型、腹腔積液無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 上皮性卵巢癌血清中B7H3、B7H4蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性

上皮性卵巢癌患者病灶血清中B7H3、B7H4表達(dá)水平與FIGO分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與年齡、組織學(xué)類型、腹腔積液無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

3 討論

據(jù)研究統(tǒng)計(jì)我國每10萬人中有5人患有卵巢癌，每年新發(fā)死亡病例超過15萬例，對(duì)女性健康具有較大的危害性[7]。根據(jù)病理學(xué)分型，卵巢癌可分為上皮性卵巢癌和非上皮性卵巢癌兩種，其中上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌最常見的病理類型，占比超過90%，其組織學(xué)類型又可進(jìn)一步分為漿液性癌、黏液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌及透明細(xì)胞癌型[1,8]。早期卵巢癌5年生存率較高，最高可達(dá)90%，由于卵巢癌在疾病初期癥狀缺乏特異性，待其侵犯至盆腔后，才會(huì)出現(xiàn)明顯的癥狀，因此在發(fā)現(xiàn)疾病時(shí)多已處于晚期階段，即便治療技術(shù)不斷發(fā)展，其5年生存率也沒有明顯的提高[9]。目前臨床中可用于卵巢癌早期診斷的生物標(biāo)志物相對(duì)較少，特異性不足，因此需發(fā)掘可靠的生物標(biāo)志物為患者的早期診治提供依據(jù)。

表2 上皮性卵巢癌病灶組織中B7H3、B7H4蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性

表3 上皮性卵巢癌血清中B7H3、B7H4蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性

以負(fù)性共刺激為代表的免疫療法近年來在各種惡性腫瘤的臨床治療中受到廣泛關(guān)注，在腫瘤組織中負(fù)性共刺激分子可通過抑制腫瘤特異性免疫應(yīng)答而維持免疫耐受功能，最終逃脫T淋巴細(xì)胞的免疫殺傷作用[10-11]。B7家族蛋白中B7H3、B7H4蛋白主要發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，其中B7H3可抑制T淋巴細(xì)胞活化而對(duì)下游輔助型T細(xì)胞1/輔助型T細(xì)胞2及輔助型T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響，而B7H4蛋白可對(duì)T細(xì)胞的增殖產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，過表達(dá)B7H4蛋白可導(dǎo)致腫瘤相關(guān)因子逃逸而造成腫瘤的進(jìn)展。B7H3、B7H4在乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌等疾病中的臨床價(jià)值已有文獻(xiàn)報(bào)道，但在卵巢癌中報(bào)道相對(duì)較少[12-13]。本研究首先通過免疫組化法檢測了上皮性卵巢癌及良性卵巢癌組織中B7H3、B7H4的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌組織中B7H3、B7H4的表達(dá)水平水平明顯增加，因此B7H3、B7H4可能參加了惡性卵巢癌的發(fā)生過程，與國外學(xué)者報(bào)道[14]一致。血清中表達(dá)的B7H3、B7H4是二蛋白的可溶性形式，為該蛋白全長序列的胞外段形式，呂鑫等[15]研究結(jié)果顯示，可溶性B7H3在繼發(fā)性嗜血細(xì)胞型淋巴組織增多癥患者血清中表達(dá)增加，且與疾病進(jìn)展及不良預(yù)后有關(guān)。陳欣然等[16]研究結(jié)果表明，可溶性B7H4濃度隨食管癌癌前病變的程度增加而提高，對(duì)于食管癌癌前病變具有良好的判斷價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，血清中B7H3、B7H4水平明顯高于良性卵巢腫瘤患者，考慮到經(jīng)濟(jì)性的問題，檢測血清中B7H3、B7H4水平對(duì)于判斷良、惡性卵巢腫瘤具有一定價(jià)值。本研究進(jìn)一步探討了上皮性卵巢組織及血清中B7H3、B7H4蛋白水平與臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果表明，在卵巢組織及血清中，B7H3、B7H4蛋白均與FIGO分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明B7H3、B7H4在腫瘤免疫微環(huán)境中可能參與了上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，對(duì)于判斷疾病分期及轉(zhuǎn)移情況具有一定的意義。

動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，利用單克隆抗體技術(shù)阻斷B7H3、B7H4的表達(dá)可有效抑制部分實(shí)體腫瘤的生長進(jìn)程，因此B7H3、B7H4作為上皮性卵巢癌免疫靶向治療的靶點(diǎn)也具有一定的潛力[17]。本研究結(jié)果受限于病例數(shù)較少，且隨訪年限較短，未對(duì)不同B7H3、B7H4蛋白表達(dá)水平上皮性卵巢癌患者預(yù)后做進(jìn)一步的分析，本研究的結(jié)論及后續(xù)的機(jī)制研究有待更多體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步檢驗(yàn)。