姚彩云 馮 蕾 范震霆

甲狀腺癌占內(nèi)分泌惡性腫瘤的90%，嚴(yán)重危害患者的健康。近年來，雖然手術(shù)已成為治療甲狀腺癌的有效手段，但仍有患者反復(fù)發(fā)作[1]。微小RNA(miRNA)是長度約22 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，其在細(xì)胞增殖、粘附和分化等多種生物過程中起重要作用。據(jù)估計(jì)，miRNAs可靶向超過1/3的人類基因[2]。越來越多的證據(jù)表明，大量miRNAs可能參與了癌癥過程，一些miRNAs的過表達(dá)可能抑制腫瘤基因的表達(dá)，相反另一些miRNAs的下調(diào)則可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)展[3]。例如，miR-146、miR-221和miR-222在甲狀腺腫瘤組織中表達(dá)增加11至19倍，與甲狀腺外侵襲或癌癥的發(fā)生有關(guān)[4]。 miR-218-2及其宿主基因SLIT3的下調(diào)可促進(jìn)甲狀腺癌的侵襲和進(jìn)展[5]。之前的研究報(bào)道m(xù)iR-125b可通過靶向PIK3CD來抑制甲狀腺未分化癌細(xì)胞的遷移和侵襲[6]。然而，miR-125b與順鉑(用于治療對(duì)放射性碘無反應(yīng)的甲狀腺癌)間的相互作用及機(jī)制還尚未完全闡明。本研究旨在探討miR-125b在經(jīng)超聲診斷的甲狀腺癌患者中的表達(dá)及其對(duì)甲狀腺癌順鉑敏感性的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 甲狀腺癌組織采集

選取2017年7月至2019年2月陜西省康復(fù)醫(yī)院病理科采集并保存的甲狀腺乳頭狀癌組織及其配對(duì)的癌旁組織各20例。所有患者均經(jīng)陜西省康復(fù)醫(yī)院影像科二維超聲多切面探查甲狀腺病灶的部位、數(shù)目、大小、邊界、內(nèi)部回聲、鈣化、后方回聲及頸部淋巴結(jié)腫大等情況，彩色多普勒超聲觀察腫瘤內(nèi)部和周圍血管分布。超聲表現(xiàn)疑似甲狀腺乳頭狀癌后，在超聲引導(dǎo)下穿刺活檢，經(jīng)病理確診。外科手術(shù)切除甲狀腺癌組織及鄰近的癌旁組織，送至病理科于-80 ℃儲(chǔ)存至實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系MDA-T32購自美國ATCC公司，將細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)消化后按5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，將細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-125b組，每組各4孔。常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

對(duì)照組不處理，陰性對(duì)照組采用脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染無義序列，miR-125b組采用脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染miR-125b mimics，嚴(yán)格按照說明書操作。miR-125b mimic序列為:上游：5'-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3'，下游：5'-ACAAGUUAGGGUCUCAGGGAUU-3'。miR-125b mimic序列由上海生工公司設(shè)計(jì)及合成，脂質(zhì)體3000購自大連Takara公司。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用RNeasy Mini試劑盒從組織樣本及轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞中提取總RNA，以RNA為模板采用NCode miRNA First-Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系(10 μl)為：1 μl cDNA、1 μl 2.5 μmol上下游引物混合物、5 μl SYBR Green qPCR SuperMix和3 μl雙蒸水。根據(jù)2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。U6為內(nèi)參。

1.5 順鉑敏感性分析

采用MTT法檢測各組細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞重新以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，每孔100 μl。設(shè)只含有培養(yǎng)基的空白對(duì)照。采用0、15、30、60、120 μg/ml 的順鉑干預(yù)48 h，換液，每孔加入30 μl MTT試劑，孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，加入100 μl DMSO，在酶標(biāo)儀上于570 nm處讀取吸光值(A)。細(xì)胞活性(%)= (A測試孔-A空白孔)/ A空白孔×100%。

1.6 Western Blot

采用RIPA試劑從組織樣本及轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞中提取總RNA，蛋白定量用BCA試劑盒。將20 μg的總蛋白加入上樣緩沖液中，用10% SDS-PAGE凝膠分離總蛋白，之后將總蛋白轉(zhuǎn)染至PVDF膜上，用5%胎牛血清封閉45 min，孵育一抗，4 ℃孵育過夜，孵育二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，采用電化學(xué)發(fā)光試劑ECL于暗室發(fā)光。用Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析目的條帶。內(nèi)參為GAPDH。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MiR-125b在甲狀腺癌組織及甲狀腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

與癌旁組織[(0.81±0.13)%]對(duì)比，甲狀腺癌組織中miR-125b mRNA的表達(dá)[(0.35±0.07)%]顯著降低(t=13.722，P<0.05)。與對(duì)照組[(0.65±0.11)%]相比，miR-125b組細(xì)胞中miR-125b mRNA的表達(dá)[(1.49±0.24)%]顯著增加(t=29.557，P<0.05)，陰性對(duì)照組miR-125b mRNA的表達(dá)[(0.68±0.15)%]無顯著變化。

2.2 MiR-125b對(duì)甲狀腺癌中Foxp3的影響

應(yīng)用Targetscan軟件(www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-125b可與Foxp3 3’UTR的519-525位點(diǎn)結(jié)合。如表1所示，與癌旁組織對(duì)比，甲狀腺癌組織中Foxp3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與對(duì)照組相比，miR-125b組細(xì)胞中Foxp3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，陰性對(duì)照組Foxp3蛋白表達(dá)無顯著變化(P>0.05)。

表1 各組Foxp3蛋白表達(dá)的對(duì)比

2.3 MiR-125b過表達(dá)對(duì)甲狀腺癌順鉑敏感性的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，在順鉑濃度為30 μg/ml時(shí)，miR-125b組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。在順鉑濃度為0、15、60、120 μg/ml時(shí)，各組間細(xì)胞活性的對(duì)比無顯著差異。

圖1 各組細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性對(duì)比

2.4 MiR-125b對(duì)甲狀腺癌中自噬的影響

如表2所示，與癌旁組織對(duì)比，甲狀腺癌組織中LC 3I蛋白的表達(dá)無顯著變化，而LC 3II蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與對(duì)照組相比，miR-125b組細(xì)胞中LC 3II蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，陰性對(duì)照組LC 3II蛋白的表達(dá)無顯著變化。各組細(xì)胞中LC 3I蛋白的表達(dá)對(duì)比無顯著差異(P>0.05)。

表2 各組織中LC 3Ⅰ和LC 3Ⅱ蛋白表達(dá)比較

3 討論

miR-125b首次是在急性淋巴細(xì)胞白血病和骨髓增生異常中發(fā)現(xiàn)的，在細(xì)胞分化、增殖和凋亡中起重要作用。Klusmann等發(fā)現(xiàn)miR-125b可以降低MUC1癌蛋白的表達(dá)，促進(jìn)白血病中DNA損傷劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7]，提示miR-125b可能作為腫瘤抑制性miRNA發(fā)揮作用。研究表明，由于miR-125b下調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖，因此其也可作為膽囊癌和結(jié)直腸癌的腫瘤抑制因子[8-9]。僅有少量幾篇關(guān)于miR-125b和甲狀腺癌的報(bào)道，大都是在甲狀腺未分化癌(ATC)中，雖然我們沒有ATC的甲狀腺組織樣本來證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)(一部分原因是因?yàn)锳TC是罕見腫瘤，另一部分原因是因?yàn)锳TC通常不能手術(shù)，因此很少被切除)，但這些報(bào)道均顯示miR-125b在ATC中表達(dá)降低[10]。而本研究在甲狀腺乳頭狀癌組織中也得到了類似的結(jié)果，與癌旁組織對(duì)比，甲狀腺癌組織中miR-125b mRNA的表達(dá)顯著降低，表明miR-125b在甲狀腺乳頭狀癌中可能起腫瘤抑制因子的作用。

越來越多的研究表明Foxp3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的典型生物標(biāo)志物，可在包括甲狀腺癌細(xì)胞等多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[11]。但是誘導(dǎo)癌細(xì)胞中Foxp3表達(dá)的機(jī)制仍然未能徹底闡明。本研究中，我們通過對(duì)比Foxp3蛋白在甲狀腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織對(duì)比，甲狀腺癌組織中Foxp3蛋白的表達(dá)顯著增加，提示Foxp3蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中可能是腫瘤促進(jìn)蛋白，似乎與miR-125b的作用相反。因此我們推測miR-125b可能直接靶向Foxp3基因并調(diào)控其表達(dá)，為了驗(yàn)證這一推測，首先我們采用生物信息學(xué)Targetscan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-125b可與Foxp3 3’UTR的519-525位點(diǎn)結(jié)合。接下來我們將miR-125b mimics轉(zhuǎn)染入人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系中，檢測miR-125b過表達(dá)對(duì)Foxp3蛋白的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-125b組細(xì)胞中Foxp3蛋白的表達(dá)顯著降低，結(jié)合生物信息學(xué)的結(jié)果預(yù)測可證實(shí)我們之前的推測，miR-125b可直接靶向Foxp3 3’UTR的519-525位點(diǎn)結(jié)合，并抑制Foxp3蛋白的表達(dá)。

近期的研究表明Foxp3與膀胱癌的順鉑耐藥有關(guān)[12]。為了確定在甲狀腺癌中miR-125b下調(diào)和Foxp3上調(diào)的治療意義，首先，我們進(jìn)行了miR-125b對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞順鉑敏感性的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在順鉑濃度為30 μg/ml時(shí)，miR-125b組細(xì)胞活性顯著降低。而在順鉑濃度為0、15、60、120 μg/ml時(shí)，各組間細(xì)胞活性的對(duì)比無顯著差異。這些結(jié)果提示miR-125b過表達(dá)可顯著增強(qiáng)化療藥順鉑在甲狀腺癌細(xì)胞中的效力。其次，對(duì)于自噬的研究也顯示，與癌旁組織對(duì)比，甲狀腺癌組織中LC 3II蛋白的表達(dá)顯著增加。與對(duì)照組相比，miR-125b組細(xì)胞中LC 3II蛋白的表達(dá)顯著降低。LC 3II是哺乳動(dòng)物自噬標(biāo)記蛋白，是觀察自噬激活公認(rèn)的生物學(xué)標(biāo)記物[13]。這些結(jié)果表明，在甲狀腺癌組織中細(xì)胞自噬的活性增加，而miR-125b過表達(dá)可抑制甲狀腺癌中自噬的激活。因此miR-125b抑制自噬活性可能是其增強(qiáng)甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的原因之一。自噬不僅參與維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)，還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤耐藥密切相關(guān)[14]。研究表明，miR-9可通過抑制自噬增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[15]。因此miR-125b抑制自噬活性是其增加甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的機(jī)制之一。

總之，本研究揭示了miR-125b在甲狀腺癌中下調(diào)，miR-125b介導(dǎo)的Foxp3下調(diào)可抑制自噬，并增強(qiáng)甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，這表明miR-125b在甲狀腺癌化療中具有治療意義。