李 旭,李 康,汪俊卿1,,隋松森,王建彬,郭傳莊, 李丕武1,*

1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物基材料與綠色造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250353 2.山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250353；3.諸城東曉生物科技有限公司,諸城 262200

氨基葡萄糖是一種重要的功能單糖,N-乙酰氨基葡萄糖是氨基葡萄糖乙?；漠a(chǎn)物,兩者在生物體的生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的作用。此外,氨基葡萄糖還是組成黏膜分泌物、結(jié)締組織、皮膚、肌腱、韌帶和軟骨等必不可少的成分[1-2]。如氨基葡萄糖在治療軟骨骨性關(guān)節(jié)炎方面有著良好的作用[3],對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用[4]。由于氨基葡萄糖與N-乙酰氨基葡萄糖存在廣泛的市場(chǎng),進(jìn)一步開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品的研究勢(shì)在必行。

氨基葡萄糖的生產(chǎn)方式一般有3種,即甲殼素水解法、生物酶轉(zhuǎn)化法與微生物發(fā)酵法。甲殼素水解法會(huì)產(chǎn)量大量的環(huán)境污染物,而且其原料會(huì)受到地域和季節(jié)的限制；生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)氨基葡萄糖增加了企業(yè)的生產(chǎn)成本,不適用于工業(yè)化生產(chǎn)[5-6]；微生物發(fā)酵法作為最有潛力的生產(chǎn)方式,基本克服了以上兩種生產(chǎn)方式的缺點(diǎn),具有短發(fā)酵時(shí)間,高生產(chǎn)效率,較小的環(huán)境污染力度的優(yōu)點(diǎn)。用于發(fā)酵的微生物可以根據(jù)生產(chǎn)的需求對(duì)其代謝途徑進(jìn)行改造來(lái)提高氨基葡萄糖的產(chǎn)量[7]。

在微生物中生成氨基葡萄糖與N-乙酰氨基葡萄糖的關(guān)鍵酶主要是氨基葡萄糖合成酶(GlmS)與氨基葡萄糖乙?；?Gna1)?？莶菅挎邨U菌生成GlcN的代謝途徑如圖1所示。首先,胞外的葡萄糖(Glc)在PTS系統(tǒng)或葡萄糖激酶GlcK的作用下生成葡萄糖-6-磷酸(Glc-6P),并在磷酸異構(gòu)酶(Pgi)的催化下進(jìn)一步生成果糖-6-磷酸(Fru-6P)。Fru-6P也可以由果糖激酶(GmuE)催化果糖生成,但是由于果糖的生成成本較高,因此一般以Glc為底物生成Fru-6P,隨后Fru-6P在GlmS與YbcM的催化作用下生成GlcN。GlcNAc則由Gna1繼續(xù)催化GlcN生成。細(xì)胞外的GlcN與GlcNAc可以在NagP(PTS系統(tǒng)中的N-乙酰氨基葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白)的輔助作用下轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)被吸收利用。工業(yè)生產(chǎn)中通常將GlcNAc進(jìn)行弱酸處理脫乙?；笊砂碧恰Ｓ捎谶\(yùn)送到細(xì)胞外的GlcN和GlcNAc可以被細(xì)胞再次吸收利用,為了提高氨糖的產(chǎn)量必須對(duì)細(xì)胞的相關(guān)代謝途徑進(jìn)行改造[6]。

注: Glc:葡萄糖；Fru:果糖；GlcN:氨基葡萄糖;GlcNAc:乙酰氨基葡萄糖；Glc-6P:6-磷酸葡萄糖；Fru-6P:6-磷酸果糖；GlcN-6P:6-磷酸氨基葡萄糖;GlcNAc-6P:6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖；ptsG、ypqE、yyzE、glcK:轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的蛋白；gmuE、ydjE:轉(zhuǎn)運(yùn)果糖的基因；pgi:6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因；nagBB、nagAB:6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶；glms、ybcM:氨基葡萄糖合成酶基因；gna1:乙酰氨基葡萄糖合成酶基因；nagA:6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶；nagP:PTS系統(tǒng)-N-乙酰氨基葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

1 微生物合成氨基葡萄糖的研究進(jìn)展

1.1 大腸桿菌合成GlcN的研究進(jìn)展

Deng等[5]在過(guò)表達(dá)GlmS的基礎(chǔ)上對(duì)原始蛋白進(jìn)行突變,突變后得到了一株消除產(chǎn)物抑制的工程菌株,使GlcN的產(chǎn)量達(dá)到了17 g/L；隨后在前面研究的基礎(chǔ)上將Gna1進(jìn)行過(guò)表達(dá),發(fā)酵72 h后使得GlcNAc的產(chǎn)量達(dá)到了110 g/L。

陳欣[8]首先將來(lái)自大腸桿菌的GlmS基因與來(lái)自于釀酒酵母的Gna1基因在E.coliATCC 25947(DE3)過(guò)表達(dá)后,隨后敲除了乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子編碼基因nagE,甘露糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子編碼基因manX,基因ptsG和丙酮酸激酶編碼因子pykF,最后過(guò)表達(dá)了葡萄糖激酶基因glk與半乳糖苷透性酶基因GalP；采用葡萄糖分階段流加策略與分階段溶氧控制策略使氨基葡萄糖總產(chǎn)量達(dá)到了132.43 g/L。

董瑞真等[6]使葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶/葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶雙功能基因GlmU蛋白中的葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶功能域失活后進(jìn)行發(fā)酵20 h使得氨基葡萄糖的產(chǎn)量提高為1049.6 mg/L,是原始菌株的10倍。 溫朝等[9-10]將GlmS的特定位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變后將GlcN的產(chǎn)量較原始菌株提高到了1.45 g/L。周丁等[11]還對(duì)GglmS核糖開(kāi)關(guān)進(jìn)行研究,進(jìn)一步闡釋了GlcN-6P抑制GlmS的機(jī)理,認(rèn)為產(chǎn)物的積累會(huì)導(dǎo)致GlmS的酶量降低。

1.2 枯草芽孢桿菌中GlcN的生產(chǎn)研究進(jìn)展

隨著人們安全意識(shí)的增強(qiáng),當(dāng)下比較流行的氨基葡萄糖生產(chǎn)菌株是枯草芽孢桿菌。劉延峰[12]以枯草芽孢桿菌168作為出發(fā)菌株,將基因Glms與基因gna1進(jìn)行過(guò)表達(dá),實(shí)現(xiàn)了GlcNAc在枯草芽孢桿菌中的積累,達(dá)到了240 mg/L；在此基礎(chǔ)上敲除了GlcNAc從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)基因nagP,GlcNAc-6-P脫乙酰酶(NagA)和GlcN-6-P脫氨基酶(GamA和NagB)的編碼基因使GlcNAc的產(chǎn)量達(dá)到了1.85 g/L；隨后通過(guò)合成生物學(xué)的理性設(shè)計(jì)將GlmS和Gna1以1:2的比例被DNA介導(dǎo)支架結(jié)構(gòu)固定在空間上相互靠近的位置；并且利用動(dòng)態(tài)代謝組學(xué)方法預(yù)測(cè)在枯草芽孢存在使GlcNAc6P和GlcNAc之間的耗能性無(wú)效循環(huán)途徑[13],隨后敲除GlcNAc-6-P與胞內(nèi)GlcNAc之間無(wú)效循環(huán)的關(guān)鍵基因glcK,最終使得GlcNAc的產(chǎn)量達(dá)到31.65 g/L。

徐小芳[14]在枯草芽孢桿菌內(nèi)過(guò)表達(dá)了不同來(lái)源的GlmS和Gna1,并對(duì)不同來(lái)源的GlmS和Gna1進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)源于枯草芽孢桿菌的GlmS對(duì)雙底物谷氨酰胺Gln與Fru-6P具有較高的催化效率和親和力,來(lái)源于秀麗隱桿線蟲(chóng)的Gna1蛋白對(duì)底物由較高的底物親和力和催化效率。在枯草芽孢桿菌內(nèi)共表達(dá)上述兩種外源基因時(shí)GlcNAc的產(chǎn)量達(dá)到24.23 g/L。

Wu等[15]采用CRISPRi的調(diào)控方法提供了一種簡(jiǎn)單、有效且通用的方式來(lái)促進(jìn)微生物細(xì)胞工廠協(xié)同利用多種碳源,提高了GlcNAc的滴度和生產(chǎn)率。GuYang等[16]為了提高GlcNAc的生產(chǎn)率,針對(duì)枯草芽孢桿菌的中央碳和氧化還原代謝進(jìn)行了重新編程,最終減少了溢出的乙酰輔酶A通量并消除了副產(chǎn)物的形成,從而提高碳和能源利用效率,使得轉(zhuǎn)化率從0.115 g GlcNAc/1g Glc提高到0.468 GlcNAc/1g Glc,產(chǎn)量達(dá)到理論途徑產(chǎn)量的98%。

1.3 其它微生物合成GlcN的研究進(jìn)展

王雅婷[17]使用谷氨酸棒狀桿菌來(lái)進(jìn)行GlmS與Gna1的異源表達(dá),并導(dǎo)致了乙酰氨糖消耗途徑與乳酸的合成途徑,發(fā)酵生產(chǎn)的N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到了2.23 g/L。但是大腸桿菌與枯草芽孢桿菌目前還是生產(chǎn)氨糖的主要模式菌株。

2 展 望

氨基葡萄糖的生產(chǎn)主要依賴于微生物發(fā)酵法,此法相比較于酶法和幾丁質(zhì)法具有很多的優(yōu)勢(shì)。此法的操作理論主要是一方面過(guò)表達(dá)氨基葡萄糖合成酶GlmS和乙酰氨基葡萄糖合成酶Gna1；另一方面阻斷旁支代謝途徑的酶,把GlcN與GlcNAc從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白失活；還有就是針對(duì)GlmS做突變,通過(guò)增加其自身的酶活來(lái)提高氨糖的產(chǎn)量。除此之外,微生物發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵條件的優(yōu)化,比如碳源的添加方式、分階段DO的控制以及發(fā)酵溫度的調(diào)控都會(huì)對(duì)氨糖的積累產(chǎn)生影響[18],這些策略可以降低乙酸的生成量[19-20]。其次,開(kāi)發(fā)微生物動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控元件以及理性設(shè)計(jì)調(diào)控方式對(duì)于氨基葡萄糖等重要功能營(yíng)養(yǎng)品的開(kāi)發(fā)是一種新的思路[21]。

微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖還有很多的思路,比如細(xì)胞中的某些膜蛋白可能會(huì)抑制GlmS與Gna1的表達(dá)活性,敲除這些基因來(lái)進(jìn)一步提高氨糖的產(chǎn)量；此外,還可以針對(duì)Gna1蛋白的關(guān)鍵氨基酸做飽和突變來(lái)提高其與底物的親和力,從而提高GlcNAc的產(chǎn)量?？傊?代謝途徑的理性設(shè)計(jì)、關(guān)鍵蛋白的深入研究以及細(xì)胞自身調(diào)控元件的開(kāi)發(fā)都將使氨糖的產(chǎn)量達(dá)到一個(gè)新的高度。