張 力,李敬龍

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院,生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,濟(jì)南 250353

大蠟螟(Galleriamellonella)是一昆蟲綱,鱗翅目,螟蛾科昆蟲,其免疫特點與哺乳動物近似,體內(nèi)蛋白質(zhì)含量極其豐富,利用其生長繁殖周期短等特點,常常被廣泛應(yīng)用在病原菌感染模型當(dāng)中,以此來研究致病的機(jī)制和相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組的分析[1-2]。

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)在國內(nèi)外被用于害蟲的生物防治實驗與研究,且取得很好的對害蟲持續(xù)性的消除控制功效,其被廣大科學(xué)研究者稱為最具開發(fā)潛力的昆蟲病原真菌之一[3-4]。實驗室從大蠟螟上分離得到6個樣品并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的對比分析,共檢測到12 770個共表達(dá)的基因。我們利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了大蠟螟幼蟲,在受白僵菌侵染的免疫應(yīng)答相關(guān)基因,使用 TRIzol 法,利用苯酚等物質(zhì)從感染了 B6 菌株和感染野生菌株的 3 d的大蠟螟幼蟲(200 mg)中分離提取出總 RNA,并對其進(jìn)行定性和定量分析,研究高毒力菌株侵染的大蠟螟幼蟲的轉(zhuǎn)錄組變化情況,為從分子學(xué)水平上應(yīng)用白僵菌防治生物害蟲的研究奠定信息學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和供試?yán)ハx

實驗中使用的球孢白僵菌野生菌株B.bassianaARSEF2860,由實驗室保存。實驗中使用的球孢白僵菌高毒力菌株為實驗室通過ARTP和FACS誘變篩選得到。

1.2 白僵菌侵染

將4齡的大蠟螟幼蟲分別浸泡在濃度為107個/ml的野生型和高毒力菌種B6的分生孢子懸浮液中,以浸泡在0.02%無菌吐溫-80中的大蠟螟幼蟲作為對照組進(jìn)行試驗。浸泡10 s后,立即將大蠟螟幼蟲拿出,并放入干凈的透明塑料盒中,在室溫下培養(yǎng)3 d。每組實驗使用30頭大蠟螟幼蟲,處理組和對照組各取3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3 RNA提取、文庫制備和轉(zhuǎn)錄組測序

使用TRIzol法,利用苯酚等物質(zhì)從感染了B6菌株和感染野生菌株的3 d的大蠟螟幼蟲(200 mg)中分離提取出總RNA,并對其進(jìn)行定性和定量分析。用磁珠對mRNA進(jìn)行純化,分別合成兩條cDNA產(chǎn)物。cDNA片段產(chǎn)物純化驗證后,用phi29擴(kuò)增以制成DNA納米球并在BGISEQ-500平臺上讀取150 bp的單端讀數(shù)。

利用Trimmomatic對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,去掉原始數(shù)據(jù)中帶有接頭的數(shù)據(jù)、含N的比例大于5%的數(shù)據(jù)以及低質(zhì)量數(shù)據(jù),最后獲得純凈數(shù)據(jù)。將純凈數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行對比。為探究大蠟螟幼蟲對高毒力菌株侵染的反應(yīng)變化,將差異倍數(shù)為兩倍以上(|FC|≥4),Q≤0.001的基因定義為顯著差異表達(dá)基因。對差異基因進(jìn)行GO和KEGG的基因功能和生物通路進(jìn)行分類分析和富集分析,Q≤0.05視為顯著富集。

2 結(jié)果與分析

研究對球孢白僵菌高毒力菌株和野生型菌株侵染得到的6個樣品(B6和野生型各三組樣品)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的對比分析,在高毒力和野生型球孢白僵菌菌株感染72 h的大蠟螟4齡幼蟲中,共檢測到12 770個共表達(dá)的基因。用Log2 Fold Change(FC)作為篩選標(biāo)準(zhǔn),得到了|FC|≥4,Q≤0.001的224個上調(diào)基因和227個下調(diào)基因,并定義為顯著差異表達(dá)的差異基因。

2.1 顯著差異基因的GO(Gene ontology)GO分類

Gene Ontology分類分析根據(jù)451個顯著差異基因的功能將其分為分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)和生物過程(biological process)等三大類中的33條GO二級條目中。

注釋在生物過程分類中的差異基因分布于13條GO二級條目,其中,注釋到代謝過程的差異基因數(shù)目是最多的,其次是細(xì)胞過程條目。注釋到細(xì)胞過程的17個差異基因中,有15個是顯著下調(diào)的,注釋到代謝過程的23個差異基因中有14個是顯著下調(diào)的。注釋在細(xì)胞組分分類中的差異基因分布于12條GO二級條目,其中,注釋到膜和膜的一部分條目的差異基因數(shù)目是最多的。注釋到這兩個條目的63個差異基因中,有42個是顯著上調(diào)的。注釋在分子功能分類中的差異基因分布于8條GO二級條目,其中,注釋催化活性條目的差異基因數(shù)目是最多的,其次是結(jié)合。注釋到這兩個條目的差異基因分別是52個和45個,都分別有31個是顯著下調(diào)的,具體分類見表1、表2和表3。

表1 感染高毒力菌株的大蠟螟幼蟲轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因的GO分類(生物過程) 個

表2 感染高毒力菌株的大蠟螟幼蟲轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因的GO分類(細(xì)胞組成) 個

表3 感染高毒力菌株的大蠟螟幼蟲轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因的GO分類(分子功能) 個

2.2 顯著差異基因的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集

將顯著性差異的基因進(jìn)行KEGG富集,451個差異基因注釋在了231條代謝通路上。其中有18條條目的Q≤0.05,被視為了顯著富集。在顯著富集的18條途徑當(dāng)中,注釋在蛋白質(zhì)消化和吸收途徑,胰液分泌,腎素血管緊張素系統(tǒng)和溶酶體途徑中的上調(diào)基因是多于下調(diào)基因的。其余的代謝途徑中下調(diào)基因數(shù)目多于上調(diào)基因。其中,注釋在脂肪酸合成途徑的13個差異基因中有9個是顯著下調(diào)的。注釋在脂肪酸代謝途徑的22個差異基因中有17個是顯著下調(diào)的。注釋到RNA聚合酶途徑的16個基因中有11個是顯著下調(diào)的。注釋在AMPK途徑的15個基因中有11個是顯著下調(diào)的見表4。

表4 感染高毒力菌株的大蠟螟幼蟲轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因的KEGG富集

續(xù)表

2.3 顯著差異基因分析

為了進(jìn)一步研究高毒力菌株侵染的大蠟螟幼蟲的轉(zhuǎn)錄組變化情況,我們把所有差異基因按照差異倍數(shù),即Log2 Fold Change進(jìn)行排序,分別統(tǒng)計了上調(diào)和下調(diào)程度最高的20個差異基因進(jìn)行分析。

結(jié)果顯示,前20個上調(diào)基因的FC范圍在11.29～8.02。其中,2個與麥芽糖酶表達(dá)相關(guān)的基因,2個與胰蛋白酶表達(dá)相關(guān)的基因和3個與氨肽酶表達(dá)相關(guān)的基因是顯著上調(diào)的。這與KEGG富集分析蛋白質(zhì)消化吸收途徑的上調(diào)是一致的。前20個下調(diào)基因的FC范圍在-12.55～-7.47。值得注意的是,其中有4個與脂肪酸合成相關(guān)的酶和一個與脂肪酶相關(guān)的酶是顯著下調(diào)的。這與富集分析中脂肪酸合成和代謝途徑的下調(diào)結(jié)果是一致的,見表5和表6。

表5 B6對WT感染的大蠟螟DEGs的前20個上調(diào)基因

表6 B6對WT感染的大蠟螟DEGs的前20個下調(diào)基因列表

3 討 論

當(dāng)球孢白僵菌侵染寄主時,首先會將分生孢子附著在昆蟲角質(zhì)層上并萌發(fā)菌絲體,在此過程中分泌蛋白酶和幾丁質(zhì)酶等會破壞角質(zhì)層[5]。菌絲體穿透角質(zhì)層到達(dá)宿主血腔后,會破壞血細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),分泌次生代謝物以逃避宿主免疫[6]。分生孢子轉(zhuǎn)換成芽生孢子以便快速增殖并消耗宿主營養(yǎng)[7-8]。此外,球孢白僵菌還會產(chǎn)生白僵素、卵孢霉素有毒代謝物加速昆蟲的死亡[9-10]。

在昆蟲病原性真菌的研究中,對宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析可以對宿主的病原體的相互作用進(jìn)行整體性研究[11-12]。本研究對球孢白僵菌高毒力菌株B6和wt感染3 d的大蠟螟4齡幼蟲轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了G0分類注釋和KEGG富集分析。分析表明,在B6感染3 d后的大蠟螟幼蟲中檢測到622個上調(diào)基因和869個下調(diào)基因。用Log2 Fold Change(FC)作為篩選標(biāo)準(zhǔn),得到了|FC|≥4,Q≤0.001的224個上調(diào)基因和 227個下調(diào)基因。

轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明,高毒力菌株侵染3 d后,大蠟螟體內(nèi)脂肪酸合成,AMPK信號通路,糖原異生等代謝過程以及催化活性,RNA聚合等活性受到了高度抑制。其中,脂肪酸合成途徑中,14個編碼脂肪酸合成酶(FAS)的酰基載體蛋白的基因被下調(diào),從而抑制了脂肪酸的合成。值得注意的是,下調(diào)的14個編碼FAS酰基載體蛋白的基因與AMPK信號通路高度相關(guān)。AMPK信號通路是生物體中保持和調(diào)節(jié)細(xì)胞能量動態(tài)平衡的重要信號通路[13-14]。

除此之外,大蠟螟幼蟲中的蛋白質(zhì)的消化和吸收進(jìn)程,腎素血管緊張素系統(tǒng)以及免疫反應(yīng)被高度激活。在蛋白質(zhì)的消化吸收途徑中,21個分別編碼胰蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶N的基因被顯著上調(diào)。在大蠟螟免疫反應(yīng)相關(guān)的基因中,與吞噬體,溶酶體和生物刺激反應(yīng)相關(guān)的12個基因被上調(diào)。除此之外,9個與抗菌肽合成有關(guān)的基因也被顯著上調(diào)。使用印楝素處理的Bactroceradorsalis幼蟲在組織蛋白酶高度表達(dá)時,幼蟲的生長和發(fā)育受到了顯著抑制[15]。家蠶和血吸蟲通過上調(diào)C-溶菌酶的表達(dá)來抵抗病毒和細(xì)菌的侵襲[16-17]。

研究對侵染高毒力菌株的大蠟螟幼蟲轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,從轉(zhuǎn)錄組層面對宿主和高毒力病原體的相互作用進(jìn)行了進(jìn)一步研究。為篩選高毒力病原體提供了潛在靶點。