李駿寶 陸敏生 張海燕 韓魯佳

(中國農業(yè)大學工學院， 北京 100083)

0 引言

木質纖維類生物質年產量大、分布廣，是制取纖維素乙醇的主要原料[1]。木質纖維類生物質主要由纖維素、半纖維素和木質素組成[2]，纖維素被包裹在共價相連的木質素和半纖維素中，導致用酶水解法制取纖維素乙醇時降解率低，大大影響了乙醇的產率[3]。因此，在酶水解前需對木質纖維類生物質進行預處理，以降低其抗降解特性，提高纖維素的酶可及度，從而提高酶水解效率。

文獻[4]指出，理想的預處理方法能最大限度地脫除木質素、減少多糖的改性，從而保留原始的微纖絲結構。木質素是對木質纖維類生物質酶水解效率影響較大的因素，其主要抑制機制是木質素填充在纖維素和半纖維素的網絡中，在空間上阻礙了纖維素酶和纖維素的接觸，并能與纖維素酶發(fā)生非生產性吸附[5]。木質素解聚后產生的水溶性酚類物質還會與纖維素酶形成沉淀復合物，從而不可逆地抑制纖維素酶的活性[6]。但是，不同原料及其預處理方法和預處理條件的產物往往不同，對木質素解聚產生的酚類物質的影響也不同[7]。

氨纖維膨脹(AFEX)預處理是一種有效的預處理方法，國內外已開展了大量系統(tǒng)的研究工作，研究表明，AFEX預處理能有效地破壞細胞壁的亞顯微結構，切斷木質素與多糖的連接，并使半纖維素和木質素部分解聚，對纖維素產生消晶作用，去除半纖維素側鏈上的乙?；?，從而提高纖維素的酶可及度和酶水解效率[6-8]。此外，AFEX預處理工藝還具有固體加載率高、不需水洗、絕大多數(shù)氨可回收、殘留在物料中的氨能為發(fā)酵過程提供氮源等優(yōu)點[9-10]。文獻[11]指出，雖然AFEX預處理后的木質纖維物料的木質素總量變化不顯著，但木質素的溶解性顯著提高。文獻[12]研究分析了AFEX預處理柳枝稷木質素物化性質的變化及其對酶解的影響，結果表明，AFEX預處理柳枝稷木質素的分子量、聚合度、紫丁香基與愈創(chuàng)木基的比例均有所提高，木質素對纖維素酶的非生產性吸附降低，對酶解過程的抑制作用隨之減小，從而使酶解效率提高。文獻[13]采用超速離心、超濾、固相萃取技術對AFEX預處理上清液中不同分子量的產物進行分離，并分析了它們對纖維素酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)主要的抑制作用系由上清液中的低聚物(3～10 ku或0～3 ku)產生，并且大部分抑制物為疏水結構，其中含有許多酚類物質，推斷酚類物質可能是AFEX預處理上清液產生抑制作用的重要成分。上述研究均未涉及AFEX預處理木質素對酶解的空間阻礙作用以及產生的酚類物質對后續(xù)酶解的影響。

本文以玉米秸稈為原料，進行高低兩個溫度條件的AFEX預處理，基于孔徑分布、表面形貌、細胞壁結構和纖維素、木質素表面積的變化，研究AFEX預處理后木質素對酶解的空間阻礙作用以及產生的酚類物質對后續(xù)酶解的影響。

1 材料與方法

1.1 玉米秸稈及酶制劑

玉米秸稈取自中國農業(yè)大學上莊實驗站(40°2′N, 116°20′E)。采集的玉米秸稈樣品置于空曠通風處自然風干后進行機械粉碎(9ZP-0.4型粉碎機，遼寧鳳城縣東風機械廠)，在40℃恒溫干燥箱中干燥48 h，使用RT-34型錘片式粉碎機(香港榮聰精密科技有限公司)粉碎至秸稈粉末全部通過40目振動篩，得到玉米秸稈制備樣品(CK)，置于自封袋中在干燥通風處室溫(20℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗所用纖維素酶(Celluclast 1.5 L)和β-葡萄糖苷酶 (Novozyme 188)均購自美國Sigma-Aldrich公司。纖維素酶酶活的測定參照美國可再生能源實驗室的濾紙酶活法[14]，β-葡萄糖苷酶的酶活測定參照文獻[15]的方法，測得纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的酶活分別為72.8 U/mL和385.5 U/mL。

1.2 玉米秸稈AFEX預處理

已有相關文獻表明，AFEX預處理酶解的效果隨著處理溫度的上升(從90℃升至140℃)而顯著增加[12,16]。為便于分析，本研究選取文獻中的高、低兩個極端AFEX預處理條件(90℃、5 min和140℃、15 min)進行試驗設計[12,16]，即：預處理在Parr 4523型反應釜(美國Parr Instruments公司)中進行。每1 g CK與0.6 g 水混合，氨的加載量為1 g/g(以單位質量玉米秸稈計)，一組在90℃下恒溫處理5 min(L-AFEX)，另一組在140℃下恒溫處理15 min(H-AFEX)，然后迅速打開泄壓閥排出氨氣，取出樣品置于通風櫥中自然風干后于60℃干燥箱中干燥。干燥的AFEX預處理樣品于自封袋中封存待用。

1.3 酶解試驗

1.3.1AFEX預處理玉米秸稈的酶解試驗

為了考察AFEX預處理對玉米秸稈酶解效果的影響，AFEX預處理玉米秸稈的酶解試驗在pH值4.8的50 mmol/L檸檬酸緩沖液中進行，料液比為0.05 g/mL，纖維素酶加載量為20 U/g，β-葡萄糖苷酶加載量為40 U/g，為避免酶解過程中微生物的干擾，添加四環(huán)素鹽酸鹽至0.08 g/L。酶解72 h后，將樣品取出置于沸水浴中10 min使纖維素酶滅活，利用抽濾進行固液分離，用適量的去離子水沖洗固體殘余物3次，收集、混勻所有濾液(記為酶解液)并記錄其體積。取部分酶解液用CaCO3調節(jié)pH值至5～6保存?zhèn)溆?，用于葡萄糖得率的檢測。酶解試驗設置3組平行。

利用Hitachi L-7200型高效液相色譜儀(日本Hitachi公司)測定酶解液中單糖濃度，色譜柱使用Benson BP-800 Pb++型碳水化合物分析柱 (美國Benson Polymeric公司)，流動相為超純水，流速為0.6 mL/min，柱溫為80℃，進樣體積20 μL，洗脫時間為40 min。單糖得率計算公式為

(1)

式中mE——酶解72 h后產出單糖的質量，mg

mP——不同底物中可轉化成單糖的最大質量，mg

1.3.2酚類物質對酶解的影響

不同分子量的酚類物質都會對酶解產生抑制效果[17]，而這些酚類物質由于結構復雜很難定量[18]，所以直接測定不同分子質量的酚類物質對酶解的抑制效果比較困難。故本文利用活性炭對各上清液中的酚類物質進行脫除，用活性炭吸附前后的預處理上清液稀釋纖維素酶，并用稀釋后的酶水解纖維素濾紙，測定產糖量來表征預處理過程中產生的酚類物質對纖維素酶水解能力的影響。取無磷活性炭(Activated carbon，AC，上海迪柏化學品技術有限公司)，用大量去離子水和異丙醇沖洗[19]，再于通風櫥自然風干后置于105℃干燥箱中干燥至絕干。為了研究AFEX預處理產生的酚類物質對酶解的作用，分別將CK、L-AFEX和H-AFEX預處理玉米秸稈樣品與pH值4.8的檸檬酸緩沖液按料液比0.05 g/mL混合，在50℃水浴中150 r/min振蕩1 h，3 000 r/min離心15 min得上清液，并用0.22 μm的濾膜過濾。各上清液中的葡萄糖、甲酸、乙酸、乙醇、糠醛和羥甲基糠醛濃度的測定參照方法NREL/TP-510-42623[20]。取部分上清液與0.05 g/mL經清洗處理的AC(30℃，200 r/min，16 h)脫除酚類物質[17]。試驗設置2組平行。參照文獻[21]的方法測定脫除酚類物質前后上清液中總酚類物質(Total phenolic component，TPC)的含量，上清液中TPC的脫除率計算公式為

(2)

式中mi——脫除酚類物質前上清液中TPC質量，mg

mf——脫除酚類物質后上清液中TPC質量，mg

用脫除酚類物質前后的上清液將纖維素酶稀釋70倍(約為10 U/g)，以pH值4.8的檸檬酸緩沖液將纖維素酶稀釋70倍作對照，分別將0.5 mL稀釋的酶液、1.0 mL檸檬酸緩沖液和50 mg Whatman No.1濾紙于15 mL具塞試管中混合并于50℃水浴中恒溫1 h，而后加入3 mL DNS(二硝基水楊酸)顯色液終止反應并于沸水浴中恒溫5 min顯色，用蒸餾水將顯色后的液體稀釋一定倍數(shù)后用UV-2550型分光光度計(日本Shimadzu公司)在540 nm下測定吸光度。上清液對纖維素濾紙水解的抑制率計算公式為

(3)

式中PCBS——檸檬酸緩沖液稀釋的纖維素酶水解濾紙產生的還原糖質量，mg

Ps——上清液稀釋的纖維素酶水解濾紙產生的還原糖質量，mg

由于玉米秸稈的構成比纖維素濾紙復雜得多，且AFEX對玉米秸稈的結構造成了較大改變，故再用分散在檸檬酸緩沖液和AC吸附前后的預處理上清液中的CK、L-AFEX及H-AFEX預處理固體殘余物的酶解葡萄糖得率來表征不同上清液中的酚類物質對酶解相應固體殘余物的抑制作用。

每種提取上清液后的預處理固體殘余物用檸檬酸緩沖液沖洗3遍并分成3組，分別被檸檬酸緩沖液及相應的AC吸附前后的預處理上清液沖洗3遍后再以0.05 g/mL的料液比分散。而后加入20 U/g 的纖維素酶和40 U/g 的纖維二糖酶。用不同上清液與酶的混合物做空白。將樣品和空白置于50℃、150 r/min的恒溫水浴振蕩器中酶解72 h，取出后于沸水浴中恒溫10 min滅酶，而后3 000 r/min離心15 min。收集上清液，用液相測定其中的葡萄糖濃度，抑制率的計算方法與式(3)相似。

1.4 木質纖維成分分析

纖維素、半纖維素、木質素含量的測定參照文獻[22]，測定前樣品于105℃干燥箱中干燥至絕干。木質素含量為酸溶木質素含量和酸不溶木質素含量之和。每個樣品分析設置2個重復。

1.5 微結構分析

1.5.1孔徑分布

利用溶質排斥的方法對樣品的孔徑分布進行分析。以葡萄糖、葡聚糖T2000(Dextran T2000)和一系列的聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)為分子探針，各探針分子的相對分子質量和直徑如表1[23-24]所示，每個探針分子設置2個重復。試驗步驟主要參照文獻[23]，并稍作修改：將CK、L-AFEX和H-AFEX預處理樣品用大量去離子水沖洗至濾液無色中性，將樣品抽濾至固體質量分數(shù)近20%的濕樣，測定濕樣的干質量。稱取1.0 g濕樣于離心管中，加入2 mL質量濃度為0.01 g/mL的探針分子溶液于室溫下混合2.5 h，其間每0.5 h振蕩30 s。將樣品與探針的混合物于3 000 r/min下離心10 min，取上清液過0.45 μm的尼龍膜，每個樣品設置2組平行，并以水與濕樣混合后的上清液作為樣品空白。上清液中分子探針的濃度用裝備有Waters 2414型示差檢測器(美國Waters公司)的Waters e2695型高效液相色譜儀檢測，進樣器和檢測器之間用一個直通接頭代替分析柱，流動相為超純水，流速為0.4 mL/min，進樣體積為10 μL。

表1 探針分子的相對分子質量和直徑Tab.1 Relative molecular masses and diameters of probes

單位干質量濕樣中直徑為i的分子探針不可進入的孔的體積di計算公式為[25]

(4)

式中W——探針溶液體積，mL

q——濕樣中水體積，mL

p——濕樣干質量，g

Ci——探針溶液的初始質量分數(shù)，%

Cf——上清液中探針溶液的質量分數(shù)，%

葡聚糖T2000的粒徑為56 nm，d56nm被認為是總的不可進入的孔的體積，故單位干質量濕樣中粒徑為i的分子探針可進入的孔的體積Ai計算公式為

Ai=d56nm-di

(5)

1.5.2表面形貌

使用Hitachi SU-3500型掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope，SEM；日本Hitachi公司)分析不同樣品的表面形貌。測試前需先將適量樣品固定于粘有黑色導電膠的載物臺上，并作噴Au處理，時間為60 s。測試時加速電壓為15 kV。

1.5.3細胞壁結構

挑選各樣品中包含有厚壁細胞包圍的維管束結構的顆粒，利用Hitachi H-7650B型透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope，TEM)觀察這些顆粒的橫截面，分析AFEX預處理后玉米秸稈細胞壁結構的變化。觀察時，TEM的加速電壓為80 kV。用于TEM觀察的超薄切片樣品的制作過程及超薄切片的乙酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色的操作流程同文獻[26]。

1.5.4纖維素、木質素表面積

同文獻[27]，通過測定剛果紅和天青B與樣品的最大吸附量來估算樣品中纖維素和木質素的表面積。兩種染料與樣品的最大吸附量在Matlab 2014a中用Langmuir等溫線擬合而得。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本文所列數(shù)據(jù)均為統(tǒng)計平均值，誤差由計算數(shù)據(jù)的標準偏差得到，均值的差異顯著性檢驗借助SPSS 20.0，基于Duncan單因素方差檢驗，檢驗水平為99%(P<0.01)。柱狀圖和折線圖的制作均借助Origin 8.5。

2 結果與討論

2.1 AFEX預處理玉米秸稈的酶解效果

如圖1所示，酶解72 h后，CK、L-AFEX和H-AFEX預處理玉米秸稈葡萄糖得率分別為(26.18±0.57)%、(37.57±0.01)%和(74.74±0.07)%，木糖和阿拉伯糖得率分別為(5.59±0.17)%、(26.05±0.23)%和(76.63±0.20)%?？梢钥闯觯珹FEX預處理對玉米秸稈酶解效果的改善隨預處理條件的升高而增強。文獻[16]用與本研究H-AFEX預處理相同的條件處理了玉米秸稈，再用優(yōu)化的混合酶酶解72 h，得到了近80%的葡萄糖得率，結果與本研究相近。從圖1中還可看出，經過AFEX預處理的玉米秸稈在酶解時的葡萄糖得率、木糖和阿拉伯糖得率均得到顯著提高，而相對于葡萄糖得率，預處理條件的增強對酶解時木糖和阿拉伯糖得率的影響更為顯著。這可能是由于半纖維素在AFEX預處理過程中會發(fā)生解聚[9]，且半纖維素為非晶態(tài)，更容易在酶解過程中被降解。

2.2 AFEX預處理前后木質纖維成分的變化及其對酶解的影響

如表2所示，CK中纖維素、半纖維素和木質素質量分數(shù)分別為(35.16±0.10)%、(19.01±0.05)%和(18.82±0.58)%。AFEX預處理后，玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質素含量均無顯著變化(P>0.01)。但是，隨著預處理條件的增強，酸溶木質素含量顯著升高(P<0.01)，酸不溶木質素含量顯著降低(P<0.01)。這與文獻[11]的結果一致，其認為酸不溶木質素的降低可能源于AFEX預處理對木質素的化學改性。根據(jù)文獻[28]，酸溶木質素可能是由木質素降解產物和次生的親水物質(木質素和碳水化合物形成的化合物)組成。這說明AFEX預處理會提高玉米秸稈中部分木質素的親水性，由于疏水相互作用是木質素與纖維素酶之間發(fā)生非生產性吸附的主要作用機制[29]，那么這部分木質素與纖維素之間發(fā)生非生產性吸附的能力也就變弱。此外，在各上清液中均未檢出甲酸、乙醇、糠醛和羥甲基糠醛。AFEX預處理僅產生了少量乙酸(CK：(0.06±0.01) mg/mL；L-AFEX：(0.10±0.01) mg/mL；H-AFEX：(0.22±0.01) mg/mL)。根據(jù)先前的研究，乙酸對酶解幾乎無影響[30]。

表2 AFEX預處理前后玉米秸稈的木質纖維成分含量Tab.2 Lignocellulosic composition contents of corn stover before and after AFEX pretreatment

2.3 AFEX預處理產生的酚類物質及其對酶解的影響

AC吸附前后，上清液中TPC的變化如表3所示?？梢钥闯?，AFEX預處理后上清液中TPC含量顯著增加(P<0.01)，且隨AFEX預處理條件的增強，TPC含量也顯著增加(P<0.01)。文獻[31-32]中也得到了類似的結果。AC吸附后CK、L-AFEX和H-AFEX預處理樣品上清液中TPC的脫除率分別為96.14%、98.72%和98.95%。

表3 AC吸附前后上清液中TPC含量Tab.3 TPC contents in different supernatants before and after AC adsorption

圖2為AC吸附前后上清液對纖維素濾紙酶解效果的影響，“CBS”為對照組，為pH值4.8的檸檬酸緩沖液稀釋的酶液，標有“S”的是纖維素酶與不同上清液混合，標有“AC”的是經AC脫除酚類物質的上清液稀釋的酶液。以pH值4.8的檸檬酸緩沖液稀釋的酶液作為對照，經計算得CK、L-AFEX和H-AFEX預處理上清液對纖維素濾紙酶解的抑制率分別為28.04%、4.10%和10.40%，差異極顯著(P<0.01)。但是，上清液脫除酚類物質后，L-AFEX和H-AFEX預處理上清液對水解均未產生顯著的抑制作用(P>0.01)。在不同預處理過程中產生的纖維素酶可溶性抑制物主要有可溶性糖(如葡萄糖、纖維二糖)、發(fā)酵產物(如乙醇)和酚類物質[33]。CK上清液中葡萄糖的質量濃度為(2.51±0.14) mg/mL，L-AFEX和H-AFEX預處理上清液中均未檢出葡萄糖，且各上清液中均未檢出乙醇。CK上清液中TPC含量最低但抑制率最高，可能是因為CK中有相當量的游離葡萄糖，這些葡萄糖作為酶解產物會抑制纖維素酶的水解能力[33]。以上表明，酚類物質是AFEX上清液中抑制纖維素酶水解能力的主要成分。脫除酚類物質后，CK上清液的抑制率降低為17.43%，但依然大于脫除酚類物質前L-AFEX和H-AFEX預處理上清液的抑制效果。

圖3為不同上清液中酚類物質對相應固體殘余物酶解效果的影響，“CBS”為對照組，為分散在pH值4.8的檸檬酸緩沖液中的玉米秸稈，標有“S”的是預處理固體殘余物分散在不同上清液中，標有“AC”的是預處理固體殘余物分散在經AC脫除酚類物質的上清液中。以“CBS”為對照，用與圖2相同的方式計算不同上清液中酚類物質對相應固體殘余物酶解效果的抑制率?？梢钥闯觯珻K和L-AFEX預處理的上清液并未對其對應的固體殘余物的酶解效果產生顯著影響(P>0.01)。H-AFEX預處理上清液對H-AFEX預處理固體殘余物的酶解效果表現(xiàn)出顯著的抑制效果(抑制率8.07%)。AC吸附后，H-AFEX預處理上清液的抑制效果降低為3.01%。這說明在本試驗條件下，H-AFEX預處理產生的酚類物質對酶解的抑制率為5.06%。根據(jù)統(tǒng)計分析的結果，分散在AC吸附后的H-AFEX上清液中的H-AFEX預處理固體殘余物的酶解效果與分散在檸檬酸緩沖液中的無顯著差異(P>0.01)。盡管CK的上清液對酶水解能力有較強的抑制力，當酶解底物換成CK固體殘余物后，抑制作用并沒有體現(xiàn)出來。這大概是由于CK固體殘余物本身具有較強的抗降解特性，上清液的抑制作用被掩蓋了。H-AFEX預處理固體殘余物具有較理想的纖維素可及度，所以酶水解活性受到的影響就在酶解效果中體現(xiàn)了出來。

2.4 木質素、纖維素表面暴露程度的變化及其對酶解的影響

CK、L-AFEX和H-AFEX預處理玉米秸稈樣品中不同粒徑的分子探針可擴散進入的孔體積如表4所示，L-AFEX預處理玉米秸稈中葡萄糖可擴散進入的體積較CK無顯著差異(P>0.01)，在H-AFEX預處理后玉米秸稈中0.8 nm的探針可擴散進入的體積顯著增大(P<0.01)。然而，在AFEX預處理玉米秸稈中，一系列PEG分子探針可擴散進入的體積總體上較CK并無顯著差異(P>0.01)。0.8 nm的探針小到幾乎可以進入所有的孔，這說明H-AFEX預處理增大了玉米秸稈中的孔的總體積，并對其中小孔體積的增加作用更為明顯。

表4 AFEX預處理前后玉米秸稈的孔徑分布Tab.4 Pore size distributions of corn stover before and after AFEX pretreatment

文獻[34]用5.1 nm來代表產自里氏木霉的纖維素酶的粒徑，并發(fā)現(xiàn)5.1 nm粒徑的分子可及的孔體積與酶水解的初始速率呈線性正相關關系。而CK、L-AFEX和H-AFEX預處理玉米秸稈樣品中粒徑為5.0 nm的探針分子可進入的孔體積并無顯著差異(P>0.01)。這說明，AFEX預處理并未使玉米秸稈中纖維素酶可及的孔體積(孔徑小于56 nm)發(fā)生顯著改變。

CK、L-AFEX和H-AFEX預處理玉米秸稈樣品及其酶解72 h樣品的SEM結果如圖4所示。CK(圖4a)的表面十分平整，結構完整緊湊。酶解72 h后(圖4b)，秸稈表面雖有些褶皺，但整體結構并未受到破壞。說明CK中由纖維素、半纖維素和木質素構成的致密完整的網絡結構嚴重阻礙了纖維素酶的水解作用，致使酶解效率較低(酶解糖得率26.18%)。經過L-AFEX預處理后(圖4c)，玉米秸稈表面形貌的變化明顯，完整緊湊的結構被破壞，比表面積升高。酶解72 h后(圖4d)，秸稈表面出現(xiàn)許多直徑幾微米的孔，但是整體結構較酶解前變化不大，這說明L-AFEX預處理雖然對玉米秸稈空間結構的影響作用顯著，但是對酶解效率的提高仍有限(酶解糖得率37.58%)。經過H-AFEX預處理后(圖4e)，玉米秸稈的表面形貌發(fā)生了更大程度的改變，表面的破碎程度較L-AFEX預處理后的玉米秸稈更大，比表面積的升高也就更大。經過72 h酶解后(圖4f)，樣品的結構被徹底破壞，這說明H-AFEX預處理大大提高了酶解效率(酶解糖得率74.73%)。

玉米秸稈中的各類多糖和木質素主要存在于細胞壁中，這些成分發(fā)生了顯著變化一定會改變細胞壁的結構。CK、L-AFEX和H-AFEX預處理玉米秸稈樣品的細胞壁結構表征結果如圖5所示，皆為厚壁細胞。如圖5a所示，CK的細胞壁結構完整清晰，初生壁(Primary cell wall，PCW)、次生壁(Secondary cell wall，SCW)、細胞角隅(Cell corner，CC)及胞間層(Middle lamella，ML)堆積緊密，無明顯孔隙結構。又根據(jù)文獻[35]的研究，在TEM下觀察經過乙酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色后的樣品，木質素會被染液中的重金屬染成深色，纖維素則顏色較淺或呈無色。CK中CC和ML的木質素含量顯著高于PCW和SCW，這與文獻[35]中報道的一致。相同部位的不同位置被重金屬染色的程度都比較均一，說明相同部位中各組分排列均勻。L-AFEX預處理后(圖5b)，玉米秸稈細胞壁各部分的結構變化并不顯著，但相同部位的不同位置被重金屬染色的程度卻不均一，尤其是PCW和SCW處均能看到明顯較亮或較暗的部分。這可能是因為，經過L-AFEX預處理后，玉米秸稈細胞壁上原始的組分分布狀態(tài)已被打破，木質素開始聚集，纖維素開始暴露。雖然從SEM結果看到L-AFEX預處理破壞了玉米秸稈的表面形貌，但從TEM結果來看此時細胞壁各部分的整體結構并未被破壞。H-AFEX預處理后(圖5c)，玉米秸稈細胞壁變得扭曲褶皺，甚至被撕裂，各部位之間出現(xiàn)錯位，但并未產生更多的孔隙。這說明此時細胞壁各部位間的連接變得松散，這樣的結構較CK和L-AFEX預處理玉米秸稈更容易在后續(xù)酶解過程中被進一步破壞，就可能有更多的纖維素暴露出來，被纖維素酶水解。另外，H-AFEX預處理玉米秸稈細胞壁相同部位不同位置的染色程度較L-AFEX預處理樣品顯得更不均一。從圖5c來看，在CC處、不同部位的連接處和細胞壁斷裂處能看到不同程度的木質素的聚集。而在細胞壁中的木質素組分發(fā)生了極為顯著的聚集，形成了輪廓鮮明的黑點，此時木質素的比表面積顯著縮小。

纖維素和木質素是木質纖維物料中吸附纖維素酶的兩個主要成分[36-37]。通過測定剛果紅和天青B在底物上的最大吸附量，得到CK、L-AFEX和H-AFEX預處理玉米秸稈樣品中纖維素及木質素的表面積，如圖6所示。CK的纖維素和木質素表面積分別為(316.08±7.01)m2/g和(293.13±1.47)m2/g，AFEX預處理后，玉米秸稈中纖維素的表面積顯著增大(L-AFEX：(430.97±2.69)m2/g，H-AFEX：(422.27±6.64)m2/g)、木質素的表面積顯著減小(L-AFEX：(271.25±2.75)m2/g，H-AFEX：(215.23±0.37)m2/g)，而預處理強度對纖維素的暴露影響不顯著(P>0.01)，木質素表面積卻隨著預處理強度的增強而顯著減小(P<0.01)。這可能與細胞壁結構表征結果中在H-AFEX預處理后木質素發(fā)生的形態(tài)和分布變化有關，此時木質素的比表面積減小，同時木質素在秸稈表面的聚集可能會覆蓋部分暴露的纖維素。CK、L-AFEX和H-AFEX預處理玉米秸稈樣品中纖維素與木質素表面積的比值分別為1.08、1.59和1.96，假設纖維素和木質素在玉米秸稈表面的暴露分布均勻，由此推斷，隨著AFEX預處理條件的增強，玉米秸稈單位面積表面上纖維素酶可及的木質素對纖維素的空間阻礙逐漸降低。

因此，AFEX預處理不僅增大了纖維素酶可及的表面積，還增大了纖維素酶可及的表面積中纖維素暴露的比例，從而有效降低了纖維素酶水解時的空間阻礙，提高了酶解效率。

3 結論

(1)從木質纖維組成、酚類物質和纖維素、木質素暴露程度3方面分析了AFEX預處理后玉米秸稈的變化及其對酶解效果的影響。

(2)隨著AFEX預處理溫度的升高和時間延長，玉米秸稈中纖維素和半纖維素含量不變，酸溶木質素增多，木質素親水性增強，減弱了酶解時木質素與纖維素酶間的非生產性吸附，同時產生了更多的酚類物質。

(3)L-AFEX和H-AFEX預處理上清液中的TPC對纖維素酶水解能力的抑制率分別為4.10%和10.40%，TPC對H-AFEX固體殘余物的抑制率為5.06%(P<0.01)。

(4)AFEX預處理顯著增大了纖維素酶可及的表面積，將纖維素表面積從316.08 m2/g(CK)增大至430.97 m2/g(L-AFEX)和422.27 m2/g(H-AFEX)，將木質素表面積從293.13 m2/g(CK)減小至271.25 m2/g(L-AFEX)和215.23 m2/g(H-AFEX)，使纖維素與木質素表面積的比值從1.08(CK)增大至1.59(L-AFEX)和1.96(H-AFEX)，有效降低了木質素對纖維素酶解的空間阻礙，提高了酶解效率。