王 暢，陳 煒

1成都中醫(yī)藥大學(xué)；2西南交通大學(xué)，成都 610000

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是皮膚深度燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷后致局部組織的異常修復(fù)，是創(chuàng)傷最常見的并發(fā)癥[1]。HS發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，治療方面尚無突破性進(jìn)展[2]。中醫(yī)藥在防治瘢痕方面歷史久遠(yuǎn)，治療以活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)為主，研究發(fā)現(xiàn)中藥川芎、當(dāng)歸治療HS療效較好[3-5]。

阿魏酸鈉(sodium ferulate，SF)是阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)的鈉鹽，易從傳統(tǒng)活血化瘀類中藥——川芎、當(dāng)歸中提取，具有抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抗纖維化等作用，不良反應(yīng)少、安全性高，是我國(guó)完全自主研發(fā)的藥物，臨床上主要用于動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦血管病等心腦血管疾病[6]。瘢痕組織是肉芽組織經(jīng)改建成熟形成的成纖維結(jié)締組織[7]，近年發(fā)現(xiàn)SF對(duì)肝、腎、肺組織具有抗纖維化的作用[8,9]，由于HS的病理生理機(jī)制與纖維化存在相似性，因此兩者的研究往往可以相互借鑒[10]。課題組前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，將含有SF的復(fù)合物外涂于兔耳，能有效抑制家兔瘢痕增生[11]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用體外實(shí)驗(yàn)，探討SF對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及膠原表達(dá)的影響，為SF用于HS提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

阿魏酸鈉(批號(hào)：160201，成都亨達(dá)藥業(yè)有限公司)；胎牛血清(批號(hào)：20150514，杭州四季青生物制品研究所)；0.25%胰蛋白酶(批號(hào)：J150031)、高糖DMEM培養(yǎng)液(批號(hào)：AAK208933，Hyclone公司)；四甲基偶氨咗鹽(批號(hào)：298-93-1，美國(guó)Amresco公司)；二甲基亞砜(批號(hào)：D-5879，Biosharp公司)；Ⅰ型膠原單克隆抗體(批號(hào)：SC59772，美國(guó)SANTA公司)；Ⅲ型膠原多克隆抗體(批號(hào)：SC8780-R，美國(guó)SANTA公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(HSFb)購(gòu)于上海素爾生物科技有限公司，系3～4代傳代細(xì)胞。

1.3 主要儀器

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定

將復(fù)蘇細(xì)胞按規(guī)定進(jìn)行消化傳代，HE、免疫組化細(xì)胞[12]鑒定本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為HSFb。

1.4.2 SF的LC50、實(shí)驗(yàn)分組及最佳有效時(shí)間測(cè)定

MTT法測(cè)定SF在1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/mL濃度下的細(xì)胞抑制率，設(shè)計(jì)量效關(guān)系曲線并計(jì)算SF的LC50。測(cè)定SF在不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響，確定SF的高、中、低濃度及最佳有效時(shí)間。

1.4.3 形態(tài)學(xué)觀察

以2.14×105/mL細(xì)胞密度接種于24孔板，加入高、中、低濃度的SF經(jīng)72 h后置于倒置顯微鏡下、電鏡下行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

1.4.4 MTT法測(cè)定不同濃度的SF對(duì)細(xì)胞增殖的影響

妊娠和分娩對(duì)女性機(jī)體是一個(gè)較大的應(yīng)急事件，妊娠時(shí)的飲食、運(yùn)動(dòng)量、血壓及體質(zhì)管理都關(guān)系到母嬰的結(jié)局，產(chǎn)后生殖器官(乳房外)需恢復(fù)到非孕狀態(tài)，產(chǎn)婦身體虛弱，抵抗力差，同時(shí)又面臨著哺乳、育兒，形體的恢復(fù)等一系列的問題，這個(gè)時(shí)期健康教育指導(dǎo)對(duì)孕產(chǎn)婦是至關(guān)重要的[4]。本研究對(duì)圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦實(shí)施全程個(gè)體化系統(tǒng)管理模式，即從孕前、孕早期、妊娠期、分娩期直至產(chǎn)褥期包括新生兒的護(hù)理，實(shí)施個(gè)體化的系統(tǒng)管理。

細(xì)胞接種于96孔板，置入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。加入不同濃度SF，空白對(duì)照組加入等量的DMEM培養(yǎng)液后，置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，再在每孔添加180 μL不含血清的培養(yǎng)液和20 μL/孔的MTT，震蕩10 min。自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定每孔在490 nm處的光密度，即OD值。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.4.5 Western blot法檢測(cè)SF對(duì)HSFb的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞接種于24孔板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，加入不同濃度的SF(空白對(duì)照組加入等量的DMEM培養(yǎng)液)72 h后,離心并收集細(xì)胞。加入細(xì)胞裂解液80 μL，離心收集上清液即總蛋白。測(cè)定蛋白濃度，制作濃縮膠及分離膠，水封靜置30 min，凝膠電泳2 h后，轉(zhuǎn)膜30～50 min，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，分別加入1∶200稀釋的一抗在印跡膜室溫孵育2 h、洗膜后，加入二抗室溫孵育2 h，洗膜發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)中曝光成像并統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定

HE染色后，在光鏡下可見細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或三角形，細(xì)胞核著藍(lán)色，細(xì)胞漿嗜酸性著色，胞漿兩級(jí)突起、長(zhǎng)短不一，部分核仁為雙核仁，細(xì)胞數(shù)量較多，提示分裂旺盛(圖1A)。波形蛋白免疫組化染色后，在鏡下可見細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色(圖1B)，為陽(yáng)性表達(dá)。

圖1 細(xì)胞鑒定Fig.1 Cell identification注：A：細(xì)胞(HE×200)；B：細(xì)胞(IHC×400)Note:A:Cell (HE×200);B:Cell (IHC×400).

2.2 SF的LC50 及實(shí)驗(yàn)分組及最佳有效時(shí)間測(cè)定

MTT法測(cè)定SF在1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/mL濃度下的細(xì)胞抑制率(表1)，在SPSS行“線性回歸分析”計(jì)算SF的LC50=0.307 5 mg/mL，繪制量效關(guān)系曲線(圖2)。SF在1～0.001 mg/mL濃度對(duì)細(xì)胞抑制明顯，結(jié)合藥物L(fēng)C50和參考文獻(xiàn)中SF[13,14]對(duì)細(xì)胞有效濃度的設(shè)定，設(shè)定本實(shí)驗(yàn)的SF高、中、低濃度組分別為：0.3、0.03、0.003 mg/mL。

MTT法測(cè)定不同濃度SF在0～72 h對(duì)HSFb的細(xì)胞增殖的影響(表2，圖3)，結(jié)果顯示SF在0～72 h對(duì)細(xì)胞抑制呈上升趨勢(shì)并在72 h抑制率最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)將72 h設(shè)定為SF最佳有效時(shí)間。

表1 SF對(duì)HSFb 增殖的影響

表2 SF在不同時(shí)間對(duì)HSFb增殖的影響

圖2 SF量效關(guān)系曲線Fig.2 Dose-effect curve of SF

圖3 SF對(duì)HSFb細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of SF on HSFb cell proliferation

2.3 SF對(duì)HSFb細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3.1 倒置顯微鏡觀察

對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，平行排列，多呈長(zhǎng)梭形，走向基本趨于一致。SF各組細(xì)胞變短、細(xì)胞梭狀突起回縮，形態(tài)逐漸變圓、脫壁，與鄰近細(xì)胞接觸減少，細(xì)胞間隙變大，貼壁細(xì)胞減少。隨著SF濃度的增加，細(xì)胞變得更加稀松，棱形更加不明顯，SF-H組已見大量細(xì)胞脫落漂浮于培養(yǎng)液中(圖4)。

圖4 倒置顯微鏡觀察SF對(duì)HSFB細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)Fig.4 Effect of SF on HSFb cells by inverted microscope (×100)注：A：空白組；B：SF低劑量組；C：SF中劑量組；D：SF高劑量組。Note:A:Control;B:SF-L;C:SF-M;D:SF-H.

2.3.2 透射電鏡觀察

對(duì)照組的細(xì)胞核較大，核膜清晰完整，染色質(zhì)分布較均勻,胞漿中有較豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等細(xì)胞器，結(jié)構(gòu)完整清晰。SF組的細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)丟失，胞漿中可見線粒體輕度腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)擴(kuò)張呈囊泡狀，有較多的空泡、自噬(圖5)。

圖5 SF對(duì)HSFB 細(xì)胞形態(tài)的影響(×20 000，1 μm)Fig.5 Effect of SF on HSFb cells by electron microscope (×20 000,1 μm) 注：A：空白組；B：SF低劑量組；C：SF中劑量組；D：SF高劑量組。細(xì)胞核(N)、線粒體(Mi)、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)。Note:A:Control;B:SF-L;C:SF-M;D:SF-H.Nuclear nucleus (N),itochondria (Mi),rough endoplasmic reticulum (RER).

2.4 SF對(duì)HSFb增殖活力的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果見表3，SF作用于HSFb 72 h后，細(xì)胞增殖活力降低且有一定的濃度依賴性。與空白對(duì)照組比較，均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(**P<0.01)。

表3 SF對(duì)HSFb增殖活力的影響

2.5 SF對(duì)HSFb的I、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果見表4、圖6：與空白對(duì)照組相比，低濃度SF組的I型膠原蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)，中、高濃度SF組的I、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)顯著性降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**P<0.01)。

3 討論

HS是創(chuàng)傷后皮膚結(jié)締組織異常修復(fù)愈合的結(jié)果[7]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療HS尚無突破性進(jìn)展[2]。中醫(yī)藥防治瘢痕歷史久遠(yuǎn)[15],活血化瘀類中藥川芎、當(dāng)歸有較好療效。有文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，在防治病理性瘢痕中，川芎使用9次，當(dāng)歸使用8次[5]。SF作為傳統(tǒng)中藥材——川芎、當(dāng)歸的主要活性成分，取材方面、價(jià)格低廉、藥效穩(wěn)定，目前已廣泛用于治療心血管、腎臟疾病[16]。近年發(fā)現(xiàn)SF還具有抑制肝、肺、腎組織纖維化的作用[8-10]。由于HS的病理生理機(jī)制與纖維化存在相似性，因此兩者的研究往往可以相互借鑒[10]。課題組前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，含有SF的復(fù)合物能有效抑制兔耳瘢痕增生[11]。

表4 HSFb的I、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)

圖6 Western blot 分析SF對(duì)HSFb的I、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Western blot results of collagen I and Ⅲ protein expression of HSFb induced by SF

成纖維細(xì)胞過度增殖是HS形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。SF對(duì)HS中的成纖維細(xì)胞是否有抑制作用，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。MTT法是目前常用的檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法,本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果提示，不同濃度的SF均可明顯地抑制HSFb增殖(P<0.01)。

成纖維細(xì)胞可誘導(dǎo)分泌大量的膠原蛋白[17]，而過量的膠原合成是HS發(fā)生的病理基礎(chǔ)。在HS中，主要膠原成分是Ⅰ型和Ⅲ型膠原，這些膠原在HS形成過程不斷合成并沉積加劇病情。因此，測(cè)定I、Ⅲ型膠原含量是衡量瘢痕增生程度的客觀指標(biāo)，也是研究防治HS的一個(gè)重要方向。本實(shí)驗(yàn)用Western blot法表明，SF可抑制I、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞的微觀形態(tài)正常是分泌、儲(chǔ)存大量膠原蛋白的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)[18]。在倒置顯微鏡下，我們發(fā)現(xiàn)，加入SF后的 HSFb形態(tài)變得不規(guī)則，部分細(xì)胞脫落懸浮在培養(yǎng)液中。透射電鏡則發(fā)現(xiàn)，加入SF后的HSFb微觀形態(tài)出現(xiàn)異常，如出現(xiàn)核固縮，染色質(zhì)丟失，線粒體輕度腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)擴(kuò)張呈囊泡狀，有較多的空泡、自噬等，這些從另一個(gè)方面說明，SF可致HSFb分泌膠原蛋白的功能衰退，甚至出現(xiàn)凋亡的趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)初步說明SF在體外可抑制HSFb增殖和I、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)，其在體內(nèi)是否仍然具有抗瘢痕增生作用，則需要我們進(jìn)一步開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以探討研究。