田建華，張春媛，魏 璐

山西省林業(yè)和草原科學(xué)研究院，太原 030002

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)別名酸刺、醋柳，是一種雌雄異株、生態(tài)適應(yīng)性很廣的胡頹子科灌木或喬木，同時(shí)也是極為珍貴的藥食同源植物[1]，并收錄于《中國(guó)藥典》[2]。沙棘富含多種維生素[3]、脂肪類(lèi)[3]、多酚[4]等多種生物活性物質(zhì)，具有抗炎[5]和抗衰老[6]等作用，被廣泛應(yīng)用于食品和保健品[7]等領(lǐng)域。沙棘黃酮主要存在于沙棘果、葉及果渣中，是重要的生物活性物質(zhì)，具有扼制動(dòng)脈粥樣硬化[8]、降血糖血脂[9]、治療腸道疾病[10]、抗腫瘤[11]等多種功能，同時(shí)沙棘黃酮是優(yōu)良的活性氧清除劑和脂質(zhì)抗氧化劑，能夠清除自由基，延緩機(jī)體衰老[12]，引起越來(lái)越多的關(guān)注和研究。

沙棘黃酮的提取方法主要有水浸提法[13,14]、有機(jī)溶劑提取法等[12]，這些傳統(tǒng)的提取法存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低、溶劑消耗量大以及高溫使黃酮類(lèi)物質(zhì)變性等弊端。近年來(lái)，一些新型高效的提取技術(shù)及方法引起了研究人員的高度關(guān)注。其中，超聲波萃取法[15]具有提取溫度低、時(shí)間短、提取率較高的優(yōu)勢(shì)；酶法[16]提取可以在常溫和非有機(jī)溶劑下進(jìn)行，得到的產(chǎn)物純度、穩(wěn)定性及活性都較高，同時(shí)酶法具有能耗和投資成本較低、性價(jià)比高的優(yōu)勢(shì)。果膠酶能降解植物材料使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松散，甚至能完全水解植物材料，將活性成分釋放。但是利用果膠酶協(xié)同超聲波輔助提取法從沙棘果渣中提取黃酮類(lèi)化合物的研究還鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以沙棘果渣為研究材料，利用果膠酶協(xié)同超聲波法提取沙棘總黃酮，通過(guò)Design-Expert 8.06軟件優(yōu)化試驗(yàn)，確定其最佳提取條件；其次通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除、羥自由基清除和超氧陰離子自由基清除指標(biāo)進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)其抗氧化活性，旨在為沙棘果渣總黃酮的研究及開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘果渣(山西省某沙棘飲料廠)；蘆丁(CAS153-18-4，HPLC ≥ 98%，成都曼斯特生物科技有限公司)；果膠酶、無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、過(guò)氧化氫、濃鹽酸、二丁基羥基甲苯(BHT)、鄰二氮菲、磷酸鹽緩沖液(PBS)、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等試劑皆為市售國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；試?yàn)用水為雙蒸水。

JYL-C020E粉碎機(jī)(九陽(yáng)股份有限公司)；Explorer pro分析天平(奧豪斯儀器有限公司)；BXH-65S精密可程式烘箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)宇儀器制造有限公司)；KQ-200VD型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV3100PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美普達(dá)儀器有限公司)；SC-3610低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理

將沙棘果渣于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h，粉碎，過(guò)80目篩，備用。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加4%NaOH溶液10 mL，加30%乙醇至刻度，搖勻，靜置15 min。于510 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 沙棘果渣總黃酮提取及含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取沙棘果渣干粉1.000 g，置于100 mL錐形瓶中，按一定比例的酶添加量、液料比、一定乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、一定功率超聲提取總黃酮，提取液在室溫下離心，取上清液于100 mL容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液，每個(gè)樣品重復(fù)三次。分別量取各供試品溶液3 mL，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的同樣方法，測(cè)定樣品溶液的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮的質(zhì)量濃度，再按以下公式計(jì)算沙棘果渣總黃酮提取率：

總黃酮提取率(mg/g)=

1.2.4 單因素試驗(yàn)

以酶添加量、液料比、乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲提取溫度、超聲功率6個(gè)因素進(jìn)行單因素設(shè)計(jì)，設(shè)定酶添加量1%、2%、3%、4%、5%、6%(占沙棘果渣干重)；液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1；乙醇濃度30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；超聲提取時(shí)間30、40、50、60、70、80、90、100 min；提取溫度40、50、60、70、80 ℃；超聲功率50%、60%、70%、80%、90%(總功率500 W)，分析各單因素對(duì)沙棘果渣黃酮提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定酶添加量(A)、液料比(B)、超聲提取時(shí)間(C)3個(gè)因素為響應(yīng)變量，總黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。采用Design Expert 8.06軟件，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)方案，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)方案，以二次多元回歸方程擬合各因素和總黃酮提取率之間的函數(shù)關(guān)系。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

1.2.6 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照Sun等[17]的方法，取質(zhì)量濃度不同的沙棘果渣黃酮提取液1.0 mL，加入0.004%的DPPH溶液4 mL，充分混勻，黑暗條件下靜置30 min，以無(wú)水乙醇作空白對(duì)照，相應(yīng)濃度的BHT作陽(yáng)性對(duì)照，于517 nm處測(cè)定其吸光值。每一樣品平行測(cè)3次，取其平均值。清除率公式可表示為:

DPPH自由基清除率=(A2-A1)/A2×100%

式中：A1為樣品或陽(yáng)性對(duì)照的吸光度值；A2為空白對(duì)照的吸光度值。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.2.7 羥自由基的清除能力測(cè)定

參照Hou等[18]的方法改進(jìn)，于若干比色管中分別加入7.5 mmol/mL硫酸亞鐵溶液1 mL，7.5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，不同濃度待測(cè)總黃酮提取液1 mL(空白對(duì)照以蒸餾水代替總黃酮提取液)，最后加8.8 mol/L過(guò)氧化氫溶液1 mL，35 ℃水浴35 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，測(cè)其本底值時(shí)用蒸餾水代替過(guò)氧化氫，同時(shí)以相應(yīng)濃度的BHT作陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)以下公式計(jì)算其清除率：

羥自由基清除率=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×

100%

式中：A0是空白對(duì)照吸光度；Ax是加入樣品溶液或BHT后的吸光度；Ax0是本底吸光度。

1.2.8 超氧陰離子的清除能力測(cè)定

參照Wang等[19]的方法改進(jìn)，于若干比色管中分別加入0.05 mol/L的Tris-HCl溶液(pH 8.2)4.5 mL并于25 ℃下水浴保溫20 min，加入0.1 mL不同濃度總黃酮提取液，加入0.3 mL的3 mmol/L的鄰苯三酚(用10 mmol/L的HCl配置)，混勻后20 ℃水浴6 min，隨即加入2滴8 mol/L HCl終止反應(yīng)，320 nm處測(cè)定吸光度?？瞻讓?duì)照以蒸餾水取代總黃酮提取液，其余步驟相同。本底測(cè)試時(shí)以0.3 mL蒸餾水取代鄰苯三酚，其余步驟相同。同時(shí)以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。按照以下公式計(jì)算其超氧陰離子自由基清除率：

超氧陰離子自由基清除率=[A0-(A1-A2)]/

A0×100%

式中：A0為空白對(duì)照吸光度；A1為樣品或陽(yáng)性對(duì)照的吸光度；A2為本底吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及回歸方程的建立

從圖1可知，其吸光度在510 nm處與蘆丁濃度相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)R2=0.999。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶添加量對(duì)沙棘黃酮提取率的影響

由圖2可知，總黃酮提取量隨著果膠酶添加量的提高不斷增加。當(dāng)果膠酶添加量達(dá)到5%時(shí)，黃酮提取量達(dá)到最高；繼續(xù)增加酶添加量，黃酮提取量反而下降；這主要是因?yàn)楣z酶添加量少時(shí)，酶解不完全，果膠酶添加量為5%時(shí)，酶解濃度達(dá)到最大飽和，繼續(xù)添加果膠酶為6%時(shí)，底物濃度不能對(duì)酶達(dá)到飽和；因此最佳果膠酶添加量為5%。

圖2 果膠酶添加量對(duì)沙棘果渣黃酮含量的影響Fig.2 Effect of pectinase concentration on yield of total flavonoids

2.2.2 液料比對(duì)沙棘黃酮提取率的影響

由圖3可知，不論超聲輔助提取、酶法輔助提取還是超聲酶法雙輔助提取，液料比均在40∶1時(shí)，黃酮提取量最佳；這主要因?yàn)橐毫媳鹊蜁r(shí)，溶出一部分黃酮就達(dá)到了飽和，不能使黃酮全部溶出，液料比為50∶1和60∶1時(shí)，溶出的黃酮類(lèi)物質(zhì)被稀釋?zhuān)沟锰崛÷氏陆怠?/p>

圖3 液料比對(duì)沙棘果渣黃酮含量的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on yield of total flavonoids

2.2.3 乙醇濃度對(duì)沙棘黃酮提取率的影響

由圖4可知，不論超聲輔助提取、酶法輔助提取還是超聲酶法雙輔助提取，乙醇濃度為40%時(shí)，黃酮提取量達(dá)到最大值，乙醇濃度為30%或高于40%時(shí)黃酮提取量均降低；這主要是因?yàn)辄S酮與提取液乙醇的極性越相似，黃酮溶出就越多，當(dāng)乙醇濃度40%時(shí)，與黃酮極性最相似。

圖4 乙醇濃度對(duì)沙棘果渣黃酮含量的影響Fig.4 Effect of ethanol percentage on yield of total flavonoids

2.2.4 超聲提取時(shí)間對(duì)沙棘黃酮提取率的影響

由圖5可知，超聲提取時(shí)間為80 min時(shí)，黃酮提取量最佳，超聲提取時(shí)間低于80 min或高于80 min時(shí)，黃酮提取量均下降；這主要是因?yàn)槌曁崛r(shí)間太短時(shí)，黃酮只能溶出一部分，不能完全溶解于乙醇溶液中，超聲提取時(shí)間太長(zhǎng)，容易使黃酮與溶液中其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，使得黃酮提取率降低。

圖5 超聲提取時(shí)間對(duì)沙棘黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on yield of total flavonoids

2.2.5 提取溫度對(duì)沙棘黃酮提取率的影響

由圖6可知，在50 ℃時(shí)黃酮提取量最佳，這主要是因?yàn)闇囟忍蜁r(shí)，黃酮不能完全溶出；而溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，容易使黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，提取量降低。因此最佳提取溫度為50 ℃。

圖6 提取溫度對(duì)沙棘黃酮含量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic extraction temperature on yield of total flavonoids

2.2.6 超聲功率對(duì)沙棘黃酮提取率的影響

由圖7可知，超聲功率為80%時(shí)(總功率500 W)，黃酮提取量達(dá)到最大值，這主要因?yàn)殡S著超聲功率的增大，超聲的空化作用使沙棘果渣分子發(fā)生振蕩，加速黃酮的溶出；而超聲功率太大時(shí)，使一些雜質(zhì)溶出增多，阻礙了黃酮的溶出，提取量下降。

圖7 超聲功率對(duì)沙棘黃酮含量的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on yield of total flavonoids

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Design Expert 8.06軟件，對(duì)沙棘果渣總黃酮的提取進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert 8.06統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，獲得黃酮提取量對(duì)果膠酶添加量(A)、液料比(B)、超聲提取時(shí)間(C)的二次多元回歸模型為：

黃酮提取量=8.45+0.30A+0.085B+0.29C-0.31AB+0.59AC+0.22BC-1.40A2-0.69B2-1.74C2。

對(duì)該二次多元回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析表

由表3可知，F(xiàn)回歸值=17.49>F0.05=6.94，P<0.05，說(shuō)明該回歸模型顯著，即各因素果膠酶添加量、液料比、提取時(shí)間與黃酮提取量之間的線性關(guān)系顯著，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪强煽康?，能夠用?lái)分析和預(yù)測(cè)沙棘總黃酮的提取率；F失擬值=3.070.05，表明失擬不顯著，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)有良好的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)誤差較小，該模型對(duì)試驗(yàn)擬合較好[20]。由P值可知，二次型A2、B2和C2均對(duì)測(cè)定黃酮提取量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯著；交互項(xiàng)AB和BC顯著，而AC不顯著；由單因素F值可知單因素對(duì)黃酮提取量的影響順序依次為：A>C>B，即果膠酶添加量>超聲提取時(shí)間>液料比。

2.3.3 兩因素間的交互影響

果膠酶添加量與液料比、果膠酶添加量與超聲提取時(shí)間、液料比與超聲提取時(shí)間之間交互作用的三維空間響應(yīng)面圖，如圖8。

圖8 兩因素相互作用對(duì)沙棘果渣黃酮提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of operating parameters on the extraction yield of total flavonoids

由圖8可知，果膠酶添加量、超聲提取時(shí)間相對(duì)于液料比的曲線較陡峭，說(shuō)明果膠酶添加量、超聲提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響比液料比顯著，而果膠酶添加量與超聲提取時(shí)間的曲線都比較陡峭，說(shuō)明果膠酶添加量與提取時(shí)間的相互作用不明顯。等高線圖為響應(yīng)面圖在底面的投影，其形狀反應(yīng)兩交互作用的顯著性。果膠酶添加量與液料比、液料比與超聲提取時(shí)間等高線圖的形狀是橢圓形，說(shuō)明果膠酶添加量與液料比、液料比與超聲提取時(shí)間之間交互作用顯著，而果膠酶添加量與超聲提取時(shí)間等高線圖的形狀是圓形，說(shuō)明果膠酶添加量與液料比交互作用不顯著[21]。

2.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化的驗(yàn)證

擬合曲面有最大值，對(duì)回歸方程求偏導(dǎo)進(jìn)行分析，得到其沙棘果渣黃酮提取量理論最佳值為8.99 mg/g，其所對(duì)應(yīng)的最佳提取條件為：果膠酶添加量5.12%，液料比40.51∶1，超聲提取時(shí)間為81.07 min?？紤]到實(shí)驗(yàn)操作的可行性，將最佳條件調(diào)整為：果膠酶添加量5.1%，液料比41∶1，超聲提取時(shí)間為81 min，在此條件下進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得沙棘果渣黃酮提取量為8.78、8.89、9.05 mg/g，平均值為8.91 mg/g，與理論值相差0.08 mg/g，說(shuō)明該模型優(yōu)化所得的提取工藝參數(shù)是可靠的。

2.4 抗氧化活性試驗(yàn)

2.4.1 DPPH自由基清除能力

圖9 沙棘果渣總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.9 DPPH free radical scavenging capacity of flavonoids from sea buckthorn pomace

由圖9可知，沙棘果渣總黃酮提取液和BHT都有清除DPPH自由基的作用，對(duì)沙棘果渣來(lái)說(shuō)，總黃酮提取液濃度在0.02 mg/mL至0.08 mg/mL時(shí)，清除DPPH自由基的能力增長(zhǎng)很快，清除率由28.89%迅速增長(zhǎng)至83.17%，隨后總黃酮提取液濃度增加，但清除能力增長(zhǎng)緩慢，總黃酮提取液濃度由0.12 mg/mL增長(zhǎng)至0.14 mg/mL時(shí)，清除率僅增加1%，達(dá)到94.42%。整體來(lái)看，沙棘果渣總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力要大于BHT。

2.4.2 羥自由基清除能力

圖10 沙棘果渣總黃酮對(duì)羥自由基的清除能力Fig.10 Hydroxyl free radical scavenging capacity of flavonoids from sea buckthorn pomace

由圖10可知，沙棘果渣總黃酮提取液和BHT都有清除羥自由基的作用，沙棘果渣總黃酮提取液對(duì)羥自由基的清除率呈現(xiàn)一條增長(zhǎng)曲線，當(dāng)提取液濃度由0.2 mg/mL增長(zhǎng)至1.2 mg/mL時(shí)，清除率由42.34%增加至83.10%。和BHT相比，總黃酮提取液在低濃度時(shí)對(duì)羥自由基的清除率明顯低于BHT；但在高濃度時(shí)對(duì)羥自由基的清除率又高于BHT。

2.4.3 超氧陰離子自由基清除能力

圖11 沙棘果渣總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig.11 Superoxide anion free radical scavenging capacity of flavonoids from sea buckthorn pomace

由圖11可知，沙棘果渣總黃酮提取液和BHT都有清除超氧陰離子自由基的作用。當(dāng)總黃酮提取液質(zhì)量濃度小于0.4 mg/mL時(shí)清除能力大于BHT；當(dāng)提取液濃度為0.4 mg/mL時(shí)，總黃酮提取液和BHT清除能力相差不大，均為20%左右；當(dāng)總黃酮提取液濃度大于0.4 mg/mL時(shí)，清除能力明顯低于BHT。整體來(lái)看，沙棘果渣總黃酮提取液隨濃度的增加而增加，但清除效果不顯著，僅在提取液濃度達(dá)到1.2 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到43.41%。

3 結(jié)論

本研究對(duì)沙棘果渣總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其抗性氧化活性進(jìn)行研究。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，建立了果膠酶添加量、液料比和超聲提取時(shí)間三因素三水平的回歸模型擬合方程，根據(jù)模型，對(duì)果膠酶添加量、液料比和超聲提取時(shí)間對(duì)沙棘果渣黃酮提取量影響的交互作用進(jìn)行探討，得出沙棘果渣總黃酮最佳提取工藝條件為：果膠酶添加量5.1%，液料比41∶1，超聲提取時(shí)間為81 min，在此條件下，沙棘果渣總黃酮提取量達(dá)到8.91 mg/g，高于前人報(bào)道的沙棘果皮渣中黃酮含量[22]，并且縮短了提取時(shí)間[23]。提取液DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力的試驗(yàn)，證實(shí)其比BHT有更高的抗氧化活性，可以作為抗氧化劑，為沙棘黃酮在抗氧化方面的應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。