崔長(zhǎng)升，孫麗平，左明錦，汪 瑩，閆凱莉，陳昊媛，齊 濱*，劉 莉*

1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長(zhǎng)春 130000

黃芩(Scutellariae Radix，SR)具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效[1]，其主要活性化學(xué)成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等[2,3]，具有抗菌消炎、抗病毒、抗過敏、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)肝臟、降血脂、抑制中樞神經(jīng)等作用[4]。川貝母(Fritillariae Cirrhosae Bulbus，F(xiàn)CB)藥用歷史非常悠久，始載于秦漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，氣味辛、平，無(wú)毒，主傷寒煩熱[5]。黃芩川貝母相互配伍具有清熱解毒、止咳平喘的功效。在現(xiàn)代臨床應(yīng)用中，多將二者配伍治療肺炎[6]、小兒外感發(fā)熱[7]、肺纖維化[8]等，且效果顯著。在抗擊新型冠狀病毒(coronavirus disease 2019，COVID-19)疫情中，也將二者配伍用來治療被感染的患者[9]。

本課題采用高效液相色譜法對(duì)黃芩配伍川貝母后黃芩中主要化學(xué)成分含量變化進(jìn)行考察，并探索二者配伍前后對(duì)LPS誘導(dǎo)肺炎小鼠的治療作用。以期從化學(xué)成分、藥效兩個(gè)角度探究黃芩川貝母配伍應(yīng)用的合理性及科學(xué)內(nèi)涵，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃芩苷(批號(hào)：DST191012-023)、漢黃芩苷(批號(hào)：DST190709-026)、黃芩素(批號(hào)：DST190518-024)、漢黃芩素(批號(hào)：DST190212-025)，均購(gòu)自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；黃芩、川貝母飲片購(gòu)自長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；醋酸地塞米松(遂成藥業(yè)股份有限公司)；LPS(上海昂一生物科技有限公司)；HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司)；甲醛、二甲苯(北京化工廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠雄性，體重18～22 g，SPF級(jí)，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)-2018-0007。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(島津 LC-2030)；DV215CD電子天平(OHAUS公司)；CP214電子天平(奧豪斯儀器常州有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(ST-40R型，賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)；酶標(biāo)儀(Infinite M200 Pro型)；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(RM2245型，德國(guó)萊卡測(cè)量系統(tǒng)設(shè)備有限公司)；自動(dòng)包埋機(jī)(EG1150H型，德國(guó)萊卡測(cè)量系統(tǒng)設(shè)備有限公司)；烘片機(jī)(HI1220型，德國(guó)萊卡測(cè)量系統(tǒng)設(shè)備有限公司)；鋪片機(jī)(HI1210型，德國(guó)萊卡測(cè)量系統(tǒng)設(shè)備有限公司)；三用恒溫水浴槽(DK-420S，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；體視顯微鏡(尼康SMZ25型，北京瑞科中儀科技有限公司)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱AgiLent ZORBAX EcLipse PLus C18(4.6×250 mm，5 μm)。以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序：0～10 min，22%→25% A；10～15 min，25% A；15～25 min，25%→32% A；25～30 min，32%→40% A；30～35 min，40% A；35～40 min，40%→50% A；40～45 min，50%→95% A；45～50 min，95% A。流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取黃芩、川貝母飲片，粉碎，過80目篩。按黃芩(固定1.5 g)與川貝母不同配比3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、2∶3、1∶3、0∶3分別稱量，加100 mL蒸餾水加熱回流40 min，以3 000 rpm 離心5 min，沉淀物再次加入100 mL蒸餾水加熱回流30 min，以3 000 rpm 離心5 min，合并兩次上清液，定容至250 mL，取1 mL，加70%甲醇定容至5 mL，過膜，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取黃芩苷4.11 mg、漢黃芩苷4.10 mg、黃芩素3.00 mg、漢黃芩素3.11 mg分別定容至10 mL，制成濃度為0.411、0.410、0.300、0.311 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 mL、漢黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL、黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL、漢黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度線，制成含黃芩苷為0.205 50 mg/mL、漢黃芩苷為0.082 00 mg/mL、黃芩素為0.030 00 mg/mL、漢黃芩素0.003 11 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5、4、2.5、1、0.5、0.25 mL至5 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度線。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣體積為20 μL，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，重復(fù)測(cè)定6次。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取3∶0比例的黃芩川貝母6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，室溫下放置，分別于0、3、6、12、18、24 h進(jìn)樣分析。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知3∶0比例的黃芩川貝母6份，每份0.15 g，分別加入黃芩苷14.102 1 mg、漢黃芩苷3.803 1 mg、黃芩素1.630 6 mg、漢黃芩素0.337 2 mg標(biāo)準(zhǔn)品，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

2.4 樣品的測(cè)定

取黃芩、川貝母飲片，粉碎，過80目篩。按黃芩(1.5 g)與川貝母不同配比3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、2∶3、1∶3、0∶3分別稱量，按照2.2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件分進(jìn)樣體積為10 μL，記錄峰面積，計(jì)算黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素含量，平行做三次，取平均值。

2.5 體內(nèi)抗肺炎活性研究

2.5.1 實(shí)驗(yàn)藥物制備

取黃芩3 g，加入60 mL蒸餾水，加熱回流1 h，以3 000 rpm離心5 min，沉淀物再次加入60 mL蒸餾水加熱回流30 min，以3 000 rpm 離心5 min，合并兩次上清液，濃縮至24 mL；取川貝母3 g，加入60 mL蒸餾水，加熱回流1 h，以3 000 rpm離心5 min，沉淀物再次加入60 mL蒸餾水加熱回流30 min，以3 000 rpm離心5 min，合并兩次上清液，濃縮至24 mL；取黃芩川貝母各3 g，加入60 mL蒸餾水，加熱回流1 h，以3 000 rpm離心5 min，沉淀物再次加入60 mL蒸餾水加熱回流30 min，以3 000 rpm 離心5 min，合并兩次上清液，濃縮至24 mL。

2.5.2 動(dòng)物分組與處理

將36只小鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白組(control group)、LPS組(LPS group)、陽(yáng)性藥組(treatment group)、黃芩組(SR group)、川貝母組(FCB group)、黃芩-川貝母組(SRFCB group)，每組6只；陽(yáng)性藥組、黃芩組、川貝母組、黃芩-川貝母組分別給予地塞米松2 mg/kg、黃芩提取液0.1 mL/10 g(相當(dāng)于黃芩給生藥量1.2 mg/10 g)、川貝母提取液0.1 mL/10 g(相當(dāng)于川貝母給生藥量1.2 mg/10 g)、黃芩川貝母混提取液0.1 mL/10 g(相當(dāng)于給黃芩川貝母生藥量各1.2 mg/10 g)，連續(xù)給藥6天，第7天，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射LPS 10 mg/kg，空白組注射等體積的生理鹽水，LPS造模6 h。

2.5.3 樣本采集

摘取眼球，收集全血0.5～1 mL，靜置20 min，4 ℃，3 000 rpm離心15 min，取血清至-80 ℃保存；取左肺大葉至10%中性甲醛中固定。

2.5.4 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的測(cè)定

采用ELISA法，按試劑盒說明書檢測(cè)小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。

2.5.5 小鼠肺組織病理學(xué)觀察

取固定好的小鼠肺組織，脫水、透明、石蠟包埋，切片厚度為5 μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理學(xué)變化。

2.5.6 統(tǒng)計(jì)方法

使用GraphPad Prism 8 軟件中One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均值以mean±SD表示。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 線性關(guān)系

黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的線性回歸方程分別為Y=4×107X+2.142 0×104(R2=0.999 9)；Y=4×107X-1.975 8×104(R2=0.999 9)；Y=6×107X-1.807 1×104(R2=0.999 8)；Y=6×107X-1.804 3×103(R2=1)；線性范圍分別為20.550～411.000、8.200～164.000、3.000～60.000、0.311～6.220 mg/L。4種成分分別在其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.2 精密度

測(cè)得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD分別為0.2%、0.3%、0.1%、0.2%，表明儀器的精密度良好。

3.1.3 重復(fù)性

測(cè)得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量的RSD分別為0.5%、0.6%、1.3%、0.5%，表明方法的重復(fù)性良好。

3.1.4 穩(wěn)定性

測(cè)得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD分別為0.2%、0.2%、0.1%、0.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.5 加樣回收率

由回歸方程計(jì)算樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均回收率分別為99.94%、102.93%、98.01%、97.68%，RSD分別為1.17%、1.55%、1.32%、1.96%，表明該方法的加樣回收效果較好。

3.2 供試品溶液測(cè)定結(jié)果

混合標(biāo)準(zhǔn)品及不同比例供試品溶液高效液相色譜圖如圖1所示。根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程計(jì)算黃芩川貝母配伍后黃芩中四種主要化學(xué)成分的含量結(jié)果如表2所示。根據(jù)結(jié)果分析得知，黃芩川貝母的配伍比例在3∶1～2∶3之間，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的溶出率變化小于6%，當(dāng)黃芩川貝母的配伍比例達(dá)到1∶3時(shí)，四種化學(xué)成分的總量下降了23.7%。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)及不同比例供試品(B)高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatograms of mixed standards(A) and test solutions of different ratios(B)注：1.黃芩苷；2.漢黃芩苷；3.黃芩素；4.漢黃芩素。S1～S7分別為黃芩∶川貝母=3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、2∶3、1∶3、0∶3。Note:1.Baicalin;2.Wogonoside;3.Baicallein;4.Wogonin.S1-S7 was SR∶FCB=3∶0,3∶1,3∶2,3∶3,2∶3,1∶3,0∶3,respectively.

3.3 抗肺炎活性

3.3.1 一般情況

空白組小鼠表現(xiàn)正常，活潑，反應(yīng)靈敏；模型組小鼠腹腔注射LPS后，反應(yīng)逐漸遲鈍，飲食減少，被毛豎起，呼吸加快，全身顫抖，肺部有濕羅音，腹瀉。各給藥組與LPS組小鼠相比，狀態(tài)稍好。

3.3.2 給藥組對(duì)小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響

各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)量如表2、圖2所示。與空白組相比，模型組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α極顯著升高，說明造模成功；與陽(yáng)性藥組相比，黃芩組、川貝母組、黃芩-川貝母組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α均有極顯著性差異，黃芩-川貝母組與陽(yáng)性藥治療效果最接近，說明黃芩川貝母配伍后藥效更佳；與模型組相比，黃芩組、川貝母組、黃芩-川貝母組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α均有不同程度的下降，且配伍后效果最佳，說明黃芩川貝母可協(xié)同改善小鼠肺部炎癥。

表2 各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平

圖2 各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平Fig.2 IL-1β,IL-6,TNF-α levels in serum of mice in each group

3.3.3 各組小鼠肺組織切片病理形態(tài)變化

各組小鼠肺組織病理切片如圖3所示。由圖中可以看出，LPS組的小鼠肺組織出現(xiàn)了明顯的病理學(xué)損傷，表現(xiàn)為不同程度的炎性滲出、紅細(xì)胞滲出、結(jié)構(gòu)紊亂等，而經(jīng)過治療后，癥狀明顯改善，且黃芩川貝母配伍組效果最佳。

4 討論與結(jié)論

肺炎是指終末氣道、肺泡及肺間質(zhì)的炎癥，由病原微生物感染、理化免疫因素、過敏和藥物導(dǎo)致[10]，病原微生物包括由細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等，最常見的是由細(xì)菌引起的肺炎[11]。肺炎是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因，每年有4.5億病例，有近156 00萬(wàn)兒童感染過肺炎，約有130萬(wàn)兒童及160萬(wàn)60歲以上的成年人死亡[12-14]。

肺部發(fā)生感染或損傷時(shí)，會(huì)發(fā)生復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子過度釋放時(shí)，形成炎性細(xì)胞爆發(fā)，毛細(xì)血管的通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致內(nèi)毒素大量蛋白進(jìn)入肺泡，肺泡表面被破壞，病情急劇惡化[15]。因此及時(shí)抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子過度表達(dá)，在治療肺炎過程中尤為關(guān)鍵。

圖3 各組小鼠肺組織病理切片染色結(jié)果(HE，×40)Fig.3 Staining results of lung tissue pathological sections of each group of mice (HE,×40)注：A：空白組；B：LPS組；C：陽(yáng)性藥組；D：黃芩組；E：川貝母組；F：黃芩-川貝母組。Note:A:Control group;B:LPS group;C:Treatment group;D:SR group;E:FCB group;F:SRFCB group.

目前西醫(yī)在治療肺炎所采用抗生素、糖皮質(zhì)激素及鼻管吸氧等輔助治療，效果顯著，但隨著抗生素的大量使用，導(dǎo)致病原體耐藥性加強(qiáng)，激素也可產(chǎn)生多種副作用，這使肺炎成為臨床治療中比較棘手的疾病[16]。中醫(yī)治療肺炎建立在辨證論治的基礎(chǔ)上，各醫(yī)家采用不同的治法，多以清熱解毒、開肺化痰、止咳平喘為基本治療原則[17]。黃芩川貝母配伍具有清熱解毒、止咳平喘的功效，多用來治療呼吸系統(tǒng)疾病[18,19]。

本文對(duì)3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、2∶3、1∶3、0∶3比例的黃芩川貝母水提液中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者配伍比例在3∶1～2∶3之間時(shí)，四種化學(xué)成分的溶出率變化較小，當(dāng)配伍比例達(dá)到1∶3時(shí)，其總含量下降了23.7%。因此黃芩川貝母在配伍應(yīng)用中，其配伍比例不宜超過2∶3，此結(jié)果與《四圣心源》、《醫(yī)學(xué)摘粹》、《醫(yī)學(xué)探驪集》中記載的應(yīng)用比例范圍相符。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用誘導(dǎo)肺炎、急性肺損傷等炎癥模型[20-22]。通過研究黃芩川貝母配伍前后對(duì)LPS誘導(dǎo)肺炎小鼠模型的抗炎作用發(fā)現(xiàn)，黃芩川貝母配伍可顯著降低小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量、改善肺組織病理形態(tài)，其治療效果優(yōu)于單味藥組，二者在抗LPS誘導(dǎo)的肺炎中具有協(xié)同增效作用。

本研究從化學(xué)成分含量變化、抗肺炎活性兩個(gè)角度探究了黃芩川貝母配伍應(yīng)用的合理性及科學(xué)性，為其臨床應(yīng)用提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)本文對(duì)黃芩川貝母配伍的初步探索，可為后續(xù)深入探究二者配伍比例、量效關(guān)系等研究奠定基礎(chǔ)。