王 猛，馬浩天，關(guān)思宇，于 杰，狄建兵，王 愈，李潤植*，崔紅利*

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷 030801

近年來，子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)發(fā)病率明顯增加。EMs指具有活性的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外的部位[1]。EMs好發(fā)于育齡期婦女，可能與雌激素的過多分泌相關(guān)，其雖為良性病變，但呈局部浸潤生長、好侵襲，婦科癥狀明顯，治療后容易多次復(fù)發(fā)，給女性身心健康帶來極大危害。然而治療EMs的方法卻十分有限，除了外科手術(shù)之外，常用的內(nèi)科治療多為長時間使用孕激素類藥物。隨著治療時間的延長，患者可出現(xiàn)各種副作用，如骨量流失、免疫系統(tǒng)失控和內(nèi)分泌紊亂等[2]。因此，尋找一種新的無副作用的EMs治療藥物是迫在眉睫的。

天然產(chǎn)物具有豐富的生物學(xué)活性以及可作用于不同的生物靶點的優(yōu)勢，因而其開發(fā)利用領(lǐng)域取得了極大的進步。來源于黃花蒿的青蒿素是目前全世界治療瘧疾作為有效的手段，并已被用作免疫調(diào)節(jié)、抗炎和部分癌癥藥物等先導(dǎo)化學(xué)物[3]。紅豆杉提取物也被用于治療乳腺癌和卵巢癌，目前已成為化學(xué)抗腫瘤藥物的研究重點[4]。在眾多天然產(chǎn)物治療疾病的研究中，我們發(fā)現(xiàn)來源于陸生植物及水生植物的其他提取物如兒茶素、白藜蘆醇、蝦青素等海藻提取物，都表現(xiàn)出多種治療效果，如抗炎、抗菌抗腫瘤等[5]。因此，尋找有利于治療子宮內(nèi)膜異位癥的天然大分子化合物，為藥學(xué)庫提供新的理論基礎(chǔ)及藥物資源的思路變得可行。Tang等[6]發(fā)現(xiàn)紫草提取物可以有效治療EMs,并且顯著影響異位內(nèi)膜組織的炎性因子和凋亡基因活性；Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)蠲痛飲可以有效緩解大鼠EMs癥狀；Liu等[8]發(fā)現(xiàn)藏紅花素可通過抑制細(xì)胞增殖和炎性因子來改善EMs。

螺旋藻是開發(fā)較早的微藻產(chǎn)品，具有很高的市場知名度。螺旋藻多糖(polysaccharide fromSpirulina，PSP)是一類來源于原核生物螺旋藻,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等多重功效的天然生物大分子[13]。近年來，PSP因其不同于抗腫瘤活性常用藥物的特點而被廣泛研究。而目前已經(jīng)有較多研究發(fā)現(xiàn)PSP可以通過作用于某些腫瘤信號通路上的分子達(dá)到調(diào)控下游基因表達(dá)的作用，Xu等[9]發(fā)現(xiàn)復(fù)合PSP抑制人類乳腺癌細(xì)胞的增殖。Yu等[10]研究PSP對宮頸癌細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn)，PSP可通過周期性阻滯而抑制Hela細(xì)胞的增殖。Sheng等[11]通過體外、體內(nèi)實驗證明，硫酸酯化的PSP對小鼠S180肉瘤有顯著抑制作用。Chen等[12]研究表明，PSP通過提高免疫細(xì)胞活性來增強機體抗H22細(xì)胞能力。此外，大量的體外研究表明，PSP不僅可直接作用于某些腫瘤細(xì)胞，還可預(yù)防腫瘤患者在化療和放療時對細(xì)胞的損傷。因此我們推測PSP可以介導(dǎo)部分通路來緩解EMs的產(chǎn)生及增殖，但還未有任何天然多糖治療EMs的研究報告，因此本課題擬基于PI3K/Akt/mTOR信號通路，探究PSP對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的治療作用，為開發(fā)新型的EMs治療方案和后續(xù)治療藥物提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

螺旋藻藻粉購買自福清市新大澤螺旋藻有限公司，并由本實驗室保管，腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor-α，TNF-α)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)試劑盒(南京建成)；基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2，MMP-2)試劑盒購自武漢華美。Trizol試劑(上海生工)；PrimeScript RT試劑盒(Takara);1 TAE電泳buffer(Tris 4.84 g，Na2EDTA·2H2O 0.744 g，CH3COOH 1.142 mL，pH 8.5)、BCA蛋白試劑盒(南京建成)；anti-PI3K、AKt、mTOR rabbit(Abcam)。

1.2 實驗方法

1.2.1 PSP的制備及純度鑒定

PSP的制備參照我們實驗室已經(jīng)發(fā)表的研究進行[13]。提取PSP后，使用Sephacryl S-100 HR為固定相裝填中壓特制玻璃層析柱(1.5 cm×60 cm)進行純化。過柱時流動相為超純水，以0.5 mL/min的流速洗脫。在過濾器濃縮后獲得純化的PSP。隨后進行純度、分子量的檢測。使用苯酚-硫酸法檢測PSP的總糖。按照Chen等[14,15]描述的方法，使用高效液相凝膠滲透色譜法(HPGPC)檢測PSP的分子量。

1.2.2 大鼠EMs模型的制備

清潔級SD大鼠(無生育史)24只購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，8周齡，體重160±15 g。實驗大鼠于標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所動物房的隔離籠中，適應(yīng)性培養(yǎng)兩周后開始實驗。

采用自體異位種植術(shù)[16]構(gòu)建大鼠模型。簡要步驟如下：術(shù)前一天各組大鼠灌胃戊酸雌二醇，禁食不禁水6 h。種植術(shù)在超凈工作臺中進行，大鼠腹腔注射水合氯醛(5%，0.6 g/kg)麻醉，以鑷子刺激足部無反射為麻醉成功標(biāo)準(zhǔn)。腹部剃毛，75%酒精消毒備皮，待干。恥骨水平中線開口，沿腹中線縱向剪開皮膚，鈍性鑷子分離皮膚與腹膜壁；沿腹中線切開3～4 cm(上至劍突)，逐層分離肌肉，打開腹腔。進入腹腔后，檢查腹腔整體情況，找到子宮及卵巢。分別于近卵巢端、近子宮末端使用0.6不可吸收縫線結(jié)扎，切除中段子宮，立刻置于無菌生理鹽水中，眼科鑷子保定，縱向切開，將子宮內(nèi)膜剝離并切成面積約0.3 cm×0.3 cm的方塊，分別于腹壁處、卵巢處進行對角線縫合?？p合完畢后，檢查有無出血情況，使用慶大霉素注射液進行沖洗，連續(xù)縫合關(guān)腹，術(shù)畢，待蘇醒。術(shù)后兩天青霉素皮下注射，防止感染。

造模4周后，開腹檢查，如若發(fā)現(xiàn)移植處囊狀增大，新生血管形成且與周邊組織粘連，即造模成功。

1.2.3 PSP治療大鼠EMs的實驗設(shè)計

本實驗共設(shè)四組處理，分別為空白對照組、模型組及兩個梯度的多糖治療組(50 mg/kg PSP和100 mg/kg PSP)，多糖組濃度的確定依據(jù)參考文獻(xiàn)[13]。空白對照組(control group，CK)、模型組(model group，M)的大鼠灌胃等劑量生理鹽水。兩個治療組(50 mg/kg PSP和100 mg/kg PSP)大鼠首先灌胃等劑量的生理鹽水(50 mg/kg)，并于灌胃生理鹽水1 h后分別灌胃50 mg/kg 和100 mg/kg的PSP溶液(實驗處理設(shè)置見表1)。灌胃操作于每天下午1∶00進行，每天一次，持續(xù)四周后將所有大鼠腹主動脈采血，并使其失血性休克死亡，使用游標(biāo)尺測定病灶大小并采集樣本。

表1 基于EMs治療實驗的處理分組表(n=6)

1.2.4 EMs大鼠PI3K、Akt、mTOR基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)分析

開腹采集樣本，使用Trizol試劑盒提取大鼠子宮內(nèi)膜異位組織total RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(觀察是否出現(xiàn)28、18、5 s三條帶)、核酸儀檢測OD260/OD230與OD260/OD280比值質(zhì)檢合格后，按照Takara PrimeScript RT試劑盒說明書步驟進行反轉(zhuǎn)錄實驗，合成cDNA后置于-20 ℃保存。

qPCR引物設(shè)計：在NCBI數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)PI3K、Akt、mTOR基因轉(zhuǎn)錄本序列開放式閱讀框(ORF)設(shè)計PCR擴增引物；在NCBI數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)大鼠管家基因β-actin設(shè)計內(nèi)參引物β-actin-F和β-actin-R，引物序列見下表。

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；退火30 s；72 ℃延伸40 s，循環(huán)數(shù)25。PCR結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。使用SYBR Premix Ex Taq II(Takara)在CFX 96實時PCR檢測系統(tǒng)進行qPCR，使用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。

按照蛋白提取試劑盒說明書提取子宮內(nèi)膜異位組織樣本中的總蛋白后，測定蛋白含量。取20 μg待測樣品與上樣緩沖液混勻后，進行蛋白凝膠電泳(SDS-page)實驗，電泳后轉(zhuǎn)模，分別加入PI3K、Akt、mTOR抗體孵育，選擇合適的二抗，ECL發(fā)光液發(fā)光后顯影，以β-actin作為內(nèi)參。

表2 PCR引物的核酸序列

續(xù)表2(Continued Tab.2)

設(shè)計RT-PCR反應(yīng)體系如下：

表3 RT-PCR反應(yīng)體系

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 PSP的純度及化學(xué)組成

如表4所示，PSP的得率約為1.95%，總糖、總蛋白質(zhì)和灰分的含量分別為89.72%、5.07%和2.11%，PSP的相對分子量為29.6 kDa。

表4 螺旋藻多糖組分及分子量

2.2 各組處理大鼠的一般觀察

造模期間每日觀察大鼠表型，如毛色、精神狀態(tài)、攝食情況、活動能力等。術(shù)后48 h每日皮下注射青霉素，因而各組大鼠體溫正常，未見感染；相比于空白組，前一周手術(shù)組大鼠活動能力減弱，一周后活動能力恢復(fù)；手術(shù)組大鼠均發(fā)生了咬線情況，對縫合處使用75%酒精消毒，未再進行縫合。各組大鼠攝食差異較大，灌胃組攝食量較少，可能與灌胃溶液較多有關(guān)；術(shù)后PSP-H組一只大鼠因體溫過低死亡，灌胃過程中PSP-L組因藥液誤入氣管嗆死2只，模型組(M)意外死亡一只，其余生存良好。本次造模成功率達(dá)到83.3%。實驗四周后測定各組大鼠體重，未發(fā)現(xiàn)明顯差異(圖1)。

圖1 PSP對大鼠體重的影響Fig.1 The effect of PSP on body weight in rats

2.3 PSP對大鼠異位子宮內(nèi)膜生長的影響

通過使用游標(biāo)卡尺對組織塊的高度、表面積進行測量(圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于模型組，不同劑量的PSP灌胃治療均顯著使異位子宮內(nèi)膜組織高度降低、表面積減少，這表明PSP可有效減小異位子宮的病灶，例如高劑量多糖可以使病灶高度降低約42%，表面積減少52.8%，差異顯著(P<0.05)。

圖2 PSP對EMs病灶生長情況的影響Fig.2 The effect of PSP on the growth of EMs注：與模型組相比，*P < 0.05；**P < 0.01。Note:Compared with model,*P < 0.05;**P < 0.01.

2.4 PSP對大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2含量的影響

與空白對照組相比，模型組EMs可顯著增加大鼠血清中TNF-α的水平，TNF-α增加了近27%，差異顯著(P<0.05)；而使用多糖干預(yù)后，大鼠血清TNF-α的含量有所下降，低、高劑量多糖分別使TNF-α減少了約19%和17.6%，效果呈現(xiàn)劑量依賴性；與TNF-α的趨勢相似，EMs均顯著增加了血清VEGF和MMP-2的水平，而PSP可顯著降低以上兩種細(xì)胞因子的含量，治療效果呈現(xiàn)劑量依賴性(圖3)。

圖3 PSP對大鼠TNF-α、VEGF和MMP2含量的影響Fig.3 Effects of PSP on the content of TNF-α,VEGF and MMP2 in rats注：與對照組相比，*P < 0.05；**P < 0.01。Note:Compared with control,*P < 0.05;**P < 0.01.

2.5 PSP對大鼠PI3K、 Akt、mTOR基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響

qPCR分析(圖4)表明，與模型組相比，對照組、PSP-L和PSP-H組中PI3K的表達(dá)下調(diào)，且具有顯著性差異(P<0.05)。在所有治療組中均檢測PI3K、Akt和mTOR的相似表達(dá)模式，即模型組中這些基因的表達(dá)上調(diào)，而空白對照及治療組中的表達(dá)下調(diào)，并且這些結(jié)果均具有顯著性差異，由此可見EMs可顯著提高PI3K/Akt/mTOR的表達(dá)，而PSP均可以顯著抑制該信號通路上關(guān)鍵分子的表達(dá)。

蛋白免疫印跡分析圖4表明，所有實驗組均出現(xiàn)條帶，且不同濃度多糖處理后，PI3K、Akt和mTOR蛋白相對表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，模型組中PI3K、Akt和mTOR蛋白表達(dá)相對較高，而治療組中PSP可抑制蛋白的表達(dá)，特別是高劑量的PSP作用效果更加顯著。

3 討論與結(jié)論

EMs的發(fā)病率逐年增高，但是其治療方法卻十分有限，往往會采用長時間的內(nèi)科藥物干預(yù)，這樣不僅影響病人的治療信心，同時也導(dǎo)致極大的副作用。此外，開發(fā)新型有效的EMs治療藥物是迫在眉睫的，隨著功能食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，具有藥理學(xué)功能的新型天然產(chǎn)物引起了人們廣泛的重視。PSP是一類具有多重功效的天然生物大分子，目前已經(jīng)有較多研究發(fā)現(xiàn)PSP可以通過作用于某些腫瘤信號通路上的分子達(dá)到調(diào)控下游基因表達(dá)的作用，而EMs的形成及發(fā)展與大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的信號通路相似，因此我們推測PSP可以介導(dǎo)部分通路來緩解EMs的產(chǎn)生及增殖。

圖4 qPCR分析PI3K/Akt/mTOR基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白免疫印跡分析Fig.4 The qPCR analysis of PI3K/Akt/mTOR gene transcription level and Western blot analysis注：與模型組相比，*P < 0.05；**P < 0.01。Note:Compared with model,*P < 0.05;**P < 0.01.

本研究首先對PSP進行了提取和純化，本次多糖的提取率可以達(dá)到1.95%，經(jīng)柱層析法測定后純度較高(89%)，可以用作活性鑒定實驗；我們采用SD大鼠進行EMs造模，因大鼠器官組織較大，便于剝離、種植等操作。EMs造?？梢苑譃樽泽w移植和異體移植等，在此我們?yōu)榱吮苊猱a(chǎn)生免疫排斥，選擇自體移植術(shù)進行造模，造模成功率可以達(dá)到80%以上。PSP干預(yù)后，對大鼠進行了長期動態(tài)的觀察，發(fā)現(xiàn)大鼠的體重并無顯著變化，這意味PSP對正常大鼠及EMs大鼠的生長不存在負(fù)面影響。通過對腹腔移植物的高度、面積進行測量，發(fā)現(xiàn)PSP的干預(yù)顯著減緩了EMs的發(fā)展，即PSP或許可以用于EMs治療。

我們猜測PSP可能是通過調(diào)控與EMs形成發(fā)展相關(guān)的細(xì)胞因子而產(chǎn)生治療效果。由細(xì)胞因子所調(diào)控的細(xì)胞黏附、血管生成等是EMs發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，例如MMP-2可調(diào)節(jié)細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的信息交流，也有研究證明MMP2可以增強細(xì)胞的黏附作用，進而使得子宮內(nèi)膜細(xì)胞更容易在異位定植，本研究中EMs大鼠的MMP2水平較高，這與Yuan等[17]的發(fā)現(xiàn)一致；而PSP可以降低MMP2的活性，這意味著MMP2可能是PSP的作用靶點。在細(xì)胞增殖、侵襲的過程中，TNF-α扮演了重要的角色，TNF-α具有促進細(xì)胞增殖和分化、影響血管功能等眾多特點[18]。本研究中，PSP可顯著降低EMs大鼠血清中的TNF-α水平，并且進一步降低了TNF-α下游調(diào)控的VEGF的合成，進而抑制了EMs細(xì)胞的增殖及病變組織的血管形成，血管形成是EMs局部病灶易于轉(zhuǎn)移和免疫逃逸的重要原因。VEGF的水平還受PI3K/Akt通路調(diào)控[19]。PI3K/ Akt/ mTOR通路整合一系列的細(xì)胞外信號，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能。該通路通過整合黏附素/細(xì)胞間黏附因子-1介導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附作用(此為子宮內(nèi)膜異位的必要病理生理學(xué)條件)[20]；間接調(diào)控金屬蛋白酶(MMP)和金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)來介導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移；調(diào)控VEGF形成新生血管，此為形成EMs的重要步驟[21]；此外，PI3K/Akt/mTOR信號通路還可調(diào)控細(xì)胞凋亡及雌激素分泌，二者也是EMs形成和發(fā)展不可缺少的因素。我們發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR在模型組小鼠中均顯著表達(dá)增強，該通路的激活意味著細(xì)胞的生長、增殖以及血管形成，這無疑加劇了EMs的發(fā)展。本研究中我們發(fā)現(xiàn)PSP可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，這可能是TNF-α、VEGF等細(xì)胞因子合成減少的重要原因。然而迄今為止還很少有論文報道PSP對該通路的調(diào)控作用，PSP通過何種途徑實現(xiàn)對PI3K/Akt的調(diào)控？這將是我們下一步的研究重點。

本研究在PSP制備及純化的基礎(chǔ)上，完成了對PSP的成分，并基于自體異位種植術(shù)制備了符合要求的大鼠EMs模型，基于模型探究了PSP對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的改善作用，具體表現(xiàn)為可有效降低血清TNF-α、VEGF、MMP-2等細(xì)胞因子的含量，達(dá)到抑制EMs發(fā)展的作用；進一步基于PI3K/Akt/mTOR信號通路探究PSP對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的治療機制，結(jié)果表明：與模型組相比，治療組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織PI3K、AKT、mTOR的基因表達(dá)量明顯下降，蛋白表達(dá)檢測證實PSP可抑制AKT的磷酸化進而抑制PI3K、mTOR蛋白表達(dá)，這表明PSP可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路改善大鼠EMs癥狀。本文為發(fā)現(xiàn)PSP的新型藥理功能及闡述相關(guān)機理提供了參考，為下一步研究開發(fā)提供了科學(xué)基礎(chǔ)。