吳柯楠，梁艷妮，張東博，任浪浪，李璐含，于金高，張 珍，唐志書，王 征

陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 省部共建秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育) 陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，咸陽 712083

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種發(fā)展緩慢、非特異性炎癥性腸病，主要臨床癥狀為腹痛、腹瀉、黏液血便等，或伴有體重減輕、里急后重感、嘔吐等癥狀[1]。主要是侵及結(jié)腸黏膜，破壞黏膜形成潰瘍，常始自左半結(jié)腸，可由結(jié)腸近端發(fā)展至全結(jié)腸。UC的病因與發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，隨著近年來各學(xué)科的發(fā)展以及各學(xué)科間相互滲透，人們對UC的認(rèn)識也在不斷深入。研究表明UC的發(fā)生與患者腸道炎性因子的失衡和免疫反應(yīng)的異常密切相關(guān)，炎癥信號的激活導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子分泌失衡，活性氧過度積累，進(jìn)一步加速炎癥的發(fā)展。而核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)和信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在介導(dǎo)這一異常的免疫反應(yīng)中起著重要作用，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[2]、白細(xì)胞介素-6(IL-6)[3]、白細(xì)胞介素-8(IL-8)等多種促炎因子的過量分泌以及抗炎因子白細(xì)胞介素-4(IL-4)[4]、白細(xì)胞介素-10(IL-10)[5,6]等的釋放減少導(dǎo)致UC患者腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)，因此臨床治療UC可以從抑制促炎因子的釋放和促進(jìn)抗炎因子的分泌來實(shí)現(xiàn)。

桂皮醛(cinnamaldehyde，CA)又名肉桂醛、苯丙烯醛、桂醛，是從肉桂樹中提取的烯醛類有機(jī)化合物，是其揮發(fā)油中主要成分[7]。國內(nèi)外對CA的大量藥理研究表明，其具有抗炎[8,9]、抗?jié)儭⒔鉄徭?zhèn)痛[10]、抗腫瘤[11]、抗菌、降糖、抗肥胖、降血壓、抗抑郁[12]等多種藥理活性。課題組前期對馬齒莧-肉桂治療UC的作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，兩者聯(lián)用可以顯著改善UC小鼠的健康活動(dòng)狀況，且與腸道微生態(tài)平衡的改善密切相關(guān)[13]。據(jù)報(bào)道，CA可以抑制巨噬細(xì)胞中促炎癥因子的表達(dá)，包括TNF-α、IL-1β和一氧化氮(NO)[14]。也有文獻(xiàn)研究CA可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活以及結(jié)腸和巨噬細(xì)胞中的miR-21和miR-155水平改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[15]，故本課題組對CA治療UC的作用進(jìn)行研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

TS100-F熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；低溫冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)；低溫保存箱(-80 ℃，美國Thermo公司)；TGL-20B低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；CPA225D電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；BIO-RAD電泳槽(042BR16330，美國)；GEL DocXR+伯樂凝膠成像系統(tǒng)(721BR11053，美國)；Thermo熱點(diǎn)Multiskan FC 酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；微量冷凍離心機(jī)Micro 17R(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 試劑

桂皮醛(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq19031207，純度：≥98%)；葡聚糖硫酸鈉(DSS，MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司，批號：160110)；柳氮磺胺吡啶片(上海信誼嘉華藥業(yè)，批號：09170611)；無菌PBS(博士德生物有限公司，批號：0030319)；小鼠 IL-4(批號：M191028-003b)、IL-6(批號：M190322-004a)、IL-8(批號：M190322-104a)、IL-10(批號：M190322-003a)、TNF-α(批號：R200107-102a)ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；NF-κB/P65(#8242S)、IκBα(#4812S)、STAT3(#12460S)和p-STAT3(#9145S)兔抗鼠單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(博士德生物有限公司)；marker蛋白(Thermo Scientifi)；RIPA裂解液(博士德生物有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(博士德生物有限公司)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(博士德生物有限公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京索萊寶生物有限公司)；化學(xué)發(fā)光HRP底物ECL發(fā)光液(默克密理博)。

1.3 動(dòng)物

SPF級雄性昆明種小鼠60只，4～6周齡，體重20±2 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證許可證號：SCXK(陜)2017-003。

2 方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法

昆明種雄性小鼠60只，隨機(jī)分6組，(每組小鼠體重進(jìn)行方差分析，P>0.05)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。分為空白組、UC模型組、柳氮磺胺吡啶組[16]、CA低、中、高劑量組(150、250、500 mg/kg)?？瞻捉M小鼠飲用純凈水，其他小鼠自飲3%DSS 9天誘導(dǎo)UC模型[17]，自第10天起空白組及模型組小鼠灌胃蒸餾水，其余組灌胃相應(yīng)劑量的藥物，灌胃體積均為10 mL/kg；連續(xù)灌胃7天，最后一天禁食不禁水16 h后，摘眼球取血，小鼠處死后，剪取結(jié)腸組織，4%多聚甲醛固定。造模第一天起記錄小鼠的體重，大便質(zhì)地，潛血或便血特征[13,18,19]，根據(jù)表1進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評分。

DAI=(體重下降評分+大便性狀評分+

大便隱血情況評分)/3

2.1.2 石蠟包埋和H&E染色

將保存在4%多聚甲醛的結(jié)腸組織取出后在流水中沖洗1 h，后置入濃度梯度乙醇中脫水1 h，再用二甲苯透明，然后將透明后的標(biāo)本放置在65 ℃熔解狀態(tài)的石蠟中1 h，浸透取出放置于包埋模具內(nèi)包埋成蠟塊，并放于病理冷凍臺待其冷卻固定于切片機(jī)切成4 μm切片，4 ℃冷藏備用。

表1 DAI評分表

病理HE染色，將切片用二甲苯脫蠟，再移入蘇木精染色5 min，然后用流水洗去蘇木素染液終止染色，待其干后放入1%鹽酸乙醇溶液分化，然后放入伊紅液染色2 min并快速水洗以終止染色，最后將切片放入梯度酒精中脫水5 min后，放入二甲苯透明處理，滴加中性樹膠并蓋玻片封片固定。在微鏡下觀察比較各組大鼠HE染色結(jié)腸組織損傷的病理變化，并給予評分[20,21]比較(HAI=上皮組織破壞分?jǐn)?shù)+炎性浸潤分?jǐn)?shù))(見表2)。

表2 大鼠結(jié)腸組織HAI病理變化評分標(biāo)準(zhǔn)

2.1.3 IL-6、IL-8、IL-4、IL-10、TNF-α含量測定

對各組小鼠進(jìn)行采取血液樣本1.5 mL，4 ℃下以3 000 rpm離心10 min，收集上層血清。按照小鼠ELISA試劑盒說明書測定小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α的含量。

2.1.4 Western blot法檢測結(jié)腸組織中NF-κB/P65、STAT3蛋白表達(dá)

在病變明顯處取結(jié)腸組織放入1.5 mL的EP管中，加裂解液勻漿，離心后吸取上清，4 ℃保存?zhèn)溆?；配制BSA濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液及BCA工作液，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析；將提取的蛋白電泳(90 V，30 min后轉(zhuǎn)120 V)、轉(zhuǎn)膜(100 V，90 min)后，封閉2 h，孵育一抗(4 ℃，過夜)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合(37 ℃，1 h)；將PVDF膜平鋪于保鮮膜上，加入ECL發(fā)光液避光反應(yīng)2 min，采用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行曝光。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 DAI評分結(jié)果

根據(jù)表1小鼠DAI評分表，得出圖1評分結(jié)果，小鼠以3% DSS飲水9天后各實(shí)驗(yàn)組DAI評分均升高，表明小鼠造模成功，第10天灌胃治療開始，給藥組小鼠DAI評分均逐漸下降，且隨給藥濃度的增大，小鼠DAI評分下降趨勢更明顯，表明CA對UC有療效。

圖1 小鼠的DAI評分Fig.1 DAI of mice注：CON：對照組；COLITIS：模型組；POSITIVE CON：柳氮磺胺吡啶組；CA-L：CA低劑量組(150 mg/kg)；CA-M：CA中劑量組(250 mg/kg)；CA-H：CA高劑量組(500 mg/kg)；下同。Note:CON:Control group;COLITIS:Model group;POSITIVE CON:Sulfasalazine group;CA-L:CA low-dose group (150 mg/kg);CA-M:CA middle-dose group (250 mg/kg);CA-H:CA high-dose group (500 mg/kg);the same below.

3.2 炎癥因子的變化

由圖2可知，模型組血清中抑炎因子IL-4、IL-10的含量較空白組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α含量較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。給藥后，CA低、中、高劑量組IL-4、IL-10的含量較模型組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且高于陽性對照組；CA低、高劑量組IL-6、IL-8及TNF-α含量較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且高于陽性對照組；CA中劑量組IL-6、IL-8及TNF-α含量較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，較柳氮磺胺吡啶組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明CA能顯著改變UC小鼠炎癥因子的含量。

圖2 炎癥因子的含量變化Fig.2 Changes in the levels of inflammatory cytokines注：與UC模型組比較，**P <0.01，*P <0.05；與空白組比較，##P<0.01，#P<0.05。Note:Compared with the model group, **P <0.01,*P <0.05.Compared with the control group,##P<0.01,#P<0.05.

3.3 結(jié)腸組織觀察

最后一次給藥后，所有小鼠禁食24 h乙醚麻醉，處死小鼠，從肛門以上5 cm處取出小鼠結(jié)腸段約1 cm，發(fā)現(xiàn)空白對照組小鼠結(jié)腸顏色為淡紅色，腸管有部分成形糞便。DSS模型組小鼠結(jié)腸腸壁充血腫脹，嚴(yán)重者結(jié)腸段為血性腸內(nèi)容物。給藥組小鼠腸管可見基本成型糞便，低劑量組腸壁有輕微充血。空白組鏡下可見結(jié)腸組織完整，包括腸黏膜層、肌層，有明顯的隱窩、杯狀細(xì)胞，腺體排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤(圖3A)；模型組鏡下可見腸黏膜組織細(xì)胞(黑色箭頭)、腺體遭受不同程度破壞(黃色箭頭)，隱窩和杯狀細(xì)胞明顯減少(白色箭頭)，有大量炎癥因子(紅圈)，主要集中在黏膜層及黏膜下層(圖3B)，HAI評分明顯高于空白組，表明UC模型誘導(dǎo)成功(圖3G)；陽性對照組柳氮磺胺吡啶治療后，結(jié)腸結(jié)構(gòu)相對完整，有大量杯狀細(xì)胞和隱窩出現(xiàn)，但黏膜層仍有少量炎癥細(xì)胞(圖3C)，HAI評分顯著降低，表明磺胺吡啶300 mg/kg可改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀，但炎癥細(xì)胞浸潤對結(jié)腸組織的損傷并沒有完全消除；用濃度為150、250、500 mg/kg的CA溶液治療，可見結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，隱窩排布規(guī)范，杯狀細(xì)胞清晰可見，但仍有少量炎癥細(xì)胞浸潤，粘膜結(jié)構(gòu)有不同程度修復(fù)(圖3D、3E、3F)。HAI 評分較模型組顯著降低，高濃度組比陽性藥的療效更好(圖3G)，表明CA可修復(fù)UC結(jié)腸組織，但是不能完全消除炎癥因子對結(jié)腸組織的損傷(P<0.01)。

圖3 小鼠結(jié)腸組織HE染色圖(×400，橫切)及結(jié)腸組織病理切片HAI評分Fig.3 HE staining of mouse colon tissue(×400,crosscutting) and HAI in pathological sections of the colon注：A：對照組；B：模型組；C：柳氮磺胺吡啶組；D：CA低劑量組；E：CA中劑量組；F：CA高劑量組；G：HAI評分；黑色箭頭：腸黏膜組織；黃色箭頭：腺體破壞；白色箭頭：隱窩及杯狀細(xì)胞；紅圈：炎癥因子；與UC模型組比較，**P <0.01，*P <0.05；與空白組比較，##P<0.01，#P<0.05。Note:A:Control group;B:Model group;C:Sulfasalazine group;D:CA-L;E:CA-M;F:CA-H;G:HAI score;Black arrow:Intestinal mucosal tissue;Yellow arrow:Gland destruction;White arrow:Crypt and goblet cells;Red circle:Inflammatory factor;Compared with the model group, **P <0.01,*P <0.05;Compared with the control group,##P<0.01,#P<0.05.

3.4 結(jié)腸組織中NF-κB/P65、STAT3蛋白表達(dá)情況

從“3.1”、“3.2”、“3.3”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，藥物改善不呈劑量依賴性，所以我們從藥物的三個(gè)劑量對潰瘍性結(jié)腸炎的效果綜合分析，選擇中劑量作為檢測結(jié)腸組織中NF-κB/P65、STAT3蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)劑量。

在炎癥反應(yīng)中，NF-κB的活化是一個(gè)中心環(huán)節(jié)，靜息狀態(tài)下，NF-κB(p50/p65)與其抑制性蛋白IκB(IκBα)結(jié)合形成三聚體穩(wěn)定存在于胞質(zhì)中，抑制NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。一旦胞外信號傳遞進(jìn)胞內(nèi)，IκB在其激酶IKK和ELKs的作用下被磷酸化或泛素化降解，NF-κB以活化的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合。

由圖4可知，與空白組相比，模型組NF-κB和IκBα在細(xì)胞質(zhì)中的蛋白表達(dá)明顯降低，表明NF-κB被激活進(jìn)入細(xì)胞核；與模型組相比，陽性對照組和CA組NF-κB和IκBα在細(xì)胞質(zhì)中的蛋白水平顯著升高，另外，CA組的蛋白表達(dá)水平高于陽性對照組。總之，這些結(jié)果表明CA是通過抑制IκBα的降解從而抑制NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核來改善潰瘍性結(jié)腸炎。

圖4 小鼠結(jié)腸組織中NF-κB/p65和IκBα(細(xì)胞質(zhì))的蛋白表達(dá)Fig.4 Protein expression of NF-κB/p65 and IκBα in mice colon (in cytoplasm)注：與UC模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。Note:Compared with the model group,**P<0.01,*P<0.05.

IL-6通過“反式傳導(dǎo)信號” 誘導(dǎo)STAT3磷酸化，STAT3可誘導(dǎo)抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL，抗凋亡因子阻止炎性細(xì)胞凋亡，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖、刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生。IL-6/STAT3信號通路也可激活造血干細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌、增殖，誘發(fā)UC發(fā)生并加重發(fā)展[22]。

由圖5可得，與空白組比較，模型組p-STAT3/STAT3的蛋白表達(dá)比值明顯升高(P<0.01)。給藥后，與模型組比較，陽性對照組和CA組的p-STAT3/STAT3表達(dá)比值明顯降低(P<0.01)。這些結(jié)果表明，CA可抑制STAT3的磷酸化來阻止STAT3在細(xì)胞核中的調(diào)控作用[22]。

圖5 小鼠結(jié)腸組織中p-STAT3/ STAT3的蛋白表達(dá)Fig.5 Protein expression of p-STAT3/ STAT3 in mice colon注：與UC模型組比較，**P <0.01，*P<0.05。Note:Compared with the model group, **P<0.01,*P<0.05.

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)常見于經(jīng)濟(jì)生活水平較好的歐美發(fā)達(dá)國家，發(fā)病率遠(yuǎn)高于亞洲國家。但近年隨著亞洲國家經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展和生活水平的提高，UC的發(fā)病率在我國逐年上升。UC的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，已知腸道內(nèi)菌群失衡、內(nèi)環(huán)境紊亂將對腸黏膜免疫系統(tǒng)進(jìn)行刺激，改變黏膜通透性，進(jìn)而誘發(fā)免疫反應(yīng)，促使UC發(fā)生。

桂皮醛(CA)是一種有效的抗炎抗菌的藥物，能對腸道菌群進(jìn)行調(diào)整并促使其穩(wěn)定，有助于改善腸道屏障功能。本課題組在對馬齒莧-肉桂的前期研究發(fā)現(xiàn)，兩者聯(lián)用對小鼠UC有顯著效果。為了進(jìn)一步明確肉桂在潰瘍性結(jié)腸炎中發(fā)揮作用的主要成分，本研究通過建立DSS誘導(dǎo)UC小鼠模型，給予CA治療，評估CA的治療效果。DAI評分結(jié)果顯示CA可改善小鼠體重下降、腹瀉、血便等癥狀；病理評分結(jié)果顯示CA能夠保護(hù)腸粘膜，減少隱窩細(xì)胞的損傷以及炎癥細(xì)胞浸潤，腺體紊亂和消失減輕，改善炎癥。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生很大程度與炎性因子的失衡和免疫反應(yīng)的異常密切相關(guān)[23]，UC患者結(jié)腸中促炎細(xì)胞因子水平升高，抗炎細(xì)胞因子水平降低，從而產(chǎn)生免疫功能紊亂，導(dǎo)致UC的發(fā)展。本研究中，CA顯著降低了結(jié)腸組織中促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α含量(P<0.01)，這可能與抑制STAT3信號通路的表達(dá)有關(guān)，同時(shí)CA還使小鼠結(jié)腸組織中抑炎因子IL-4、IL-10含量顯著升高(P<0.01)。炎癥因子的表達(dá)變化影響因素較多，由于動(dòng)物的個(gè)體差異等因素影響，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有呈現(xiàn)出劑量依賴性，而病理評分卻呈劑量依賴性，這是由于炎性因子是微量指標(biāo)，病理評分顯示的是腸道整體情況，所以應(yīng)該主要依據(jù)動(dòng)物疾病活動(dòng)指數(shù)及病理評分來判斷藥物的作用效果。

促炎細(xì)胞因子都是由細(xì)胞內(nèi)信號分子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控,核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)和信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在介導(dǎo)這一異常的免疫反應(yīng)中起著重要作用。NF-κB有明顯的促炎特性，通過Western blot技術(shù)顯示NF-κB蛋白的表達(dá)條帶，可以看到CA組NF-κB蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)較模型組顯著升高，且有顯著性差異(P< 0.01)；從p-STAT3及STAT3蛋白的條帶表達(dá)和灰度值得出，CA組較模型組p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)明顯降低，且有顯著性差異(P< 0.01)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明CA對DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的保護(hù)作用與炎癥關(guān)鍵蛋白NF-κB和STAT3的激活密切相關(guān)。

綜上所述，CA可以顯著改善腸炎引發(fā)的體重減輕、腸炎疾病評分降低，和結(jié)腸組織炎性改變，減少促炎因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌，促進(jìn)抗炎因子IL-4、IL-10的表達(dá)，其減輕炎癥的作用可能與抑制NF-κB及STAT3的免疫炎癥信號通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)僅研究了其在動(dòng)物水平的療效，今后將研究其在細(xì)胞、分子和基因水平的治療機(jī)制，為我國治療UC提供更多選擇。