楊春英, 劉良國, 劉飛, 周工健, 李游

湘云金鳙染色體組型分析

楊春英1, 劉良國2, 劉飛3, 周工健4, 李游3

(1. 湖南文理學(xué)院 師范學(xué)院, 湖南 常德, 415000; 2. 湖南文理學(xué)院 教務(wù)處, 湖南 常德, 415000; 3. 動物學(xué)湖南省高校重點實驗室, 湖南 常德, 415000; 4. 湖南湘云生物科技有限公司, 湖南 常德, 415000)

采用PHA和秋水仙素活體注射法, 對洞庭湖區(qū)人工養(yǎng)殖湘云金鳙的染色體組型進行分析。結(jié)果表明: 湘云金鳙的染色體二倍體數(shù)為2N= 48, 核型公式為: 24 m+18 sm+6 st, NF = 90。未發(fā)現(xiàn)端部著絲粒染色體, 也未發(fā)現(xiàn)帶有特殊標(biāo)志性特征如隨體和次縊痕等的染色體。同時, 本文將洞庭湖區(qū)與其他水域鰱亞科魚的核型進行比較, 探討了鰱亞科魚類的染色體遺傳多樣性。

洞庭湖區(qū); 湘云金鳙; 染色體組型

鳙()隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鰱亞科(Hypophthal- michthyinae), 又稱花鰱、胖頭魚[1]。鳙具有生長快, 個體大, 肉質(zhì)鮮美, 營養(yǎng)價值高, 抗病力強等優(yōu)點, 是中國特有淡水魚類資源, 也是我國大水面水體中的主要養(yǎng)殖對象, 在我國淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量中位居第四[2]。國內(nèi)對鳙的研究始于19世紀(jì)50年代, 主要集中在鳙的人工繁養(yǎng)殖[3]、病害防治[4]、年齡生長和食性[5]、生理[6]、遺傳多樣性[7]、深加工及綜合利用[8]等方面。20世紀(jì)70–80年代, 周暾[9]、劉凌云[10]、昝瑞光[11]、余先覺等[12]對鳙魚的染色體組型進行過研究; 2006年, 孔慶亮等[13]開展了對江蘇省銅山地區(qū)的鳙魚的染色體DAPI核型分析。近年來, 由于人工繁殖缺乏科學(xué)監(jiān)管, 鳙的種質(zhì)資源出現(xiàn)退化[5], 生態(tài)環(huán)境的相對惡化又導(dǎo)致鳙魚的天然資源在急劇的減少[15], 以上種種原因均導(dǎo)致鳙的遺傳多樣性水平下降。

湘云金鳙(red var.)是湖南湘云生物科技有限公司從天然發(fā)生基因突變的鳙魚魚種中, 經(jīng)多年人工培育和系統(tǒng)選育, 獲得的具有穩(wěn)定遺傳性狀和優(yōu)良養(yǎng)殖性狀的新品系[16]。該品系由于生長速度較快、抗逆能力較強、味道鮮美、魚體為桔紅色, 深受消費者以及漁業(yè)養(yǎng)殖戶的歡迎[17]。目前有關(guān)湘云金鳙的研究相對較少, 僅見嚴(yán)斌等[18]對湘云金鳙和普通鳙魚進行了RAPD及微衛(wèi)星分析; 孫遠東[17]對湘云金鳙群體的生物學(xué)和遺傳特性進行了研究; 劉飛等[19]對金鳙和黑鳙兩種魚的肌肉營養(yǎng)成分進行分析和營養(yǎng)價值進行評定; 楊福忠等[16, 20]對湘云金鳙的生物學(xué)特征及養(yǎng)殖特性進行了報道。關(guān)于湘云金鳙的染色體組型研究尚未見報道。本實驗采用PHA和秋水仙素活體注射法, 對洞庭湖區(qū)人工養(yǎng)殖的湘云金鳙進行染色體組型分析, 以豐富鳙的遺傳學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 為鳙的遺傳選育提供理論參考, 同時也為鳙在鯉科鰱亞科魚類中的系統(tǒng)演化研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗魚湘云金鳙取自湖南湘云公司養(yǎng)殖基地, 從池塘中隨機選取8尾(3雌5雄)用于染色體組型分析。實驗魚體長424～449 mm, 體重1 355～1 512 g。湘云金鳙運回后立刻放入室內(nèi)水族箱(控溫21～24 ℃)暫養(yǎng)1周后開始實驗(圖1)。

1.2 實驗方法

1.2.1 腎細胞染色體標(biāo)本的制備

制作湘云金鳙腎細胞染色體標(biāo)本的方法參照劉良國等[21]的染色體標(biāo)本制備方法并加以改進, 操作步驟如下: 實驗前1 d對腹腔注射植物血球凝集素(PHA), 12 h后再次對腹腔注射PHA, 兩次注射PHA溶液的劑量均為按魚體重10 μg/g, 第2次注射PHA4～5 h后, 按魚體重2 μg/g注射秋水仙素, 1.5～2.0 h后, 剪斷魚鰓或魚尾失血10 min, 取出腎臟(頭腎), 放入培養(yǎng)皿中, 用生理鹽水(0.8% NaCl)清洗干凈, 剔除附著的血塊和脂肪組織; 用眼科剪剪碎腎臟, 吸入10 mL離心管中, 用吸管充分吹打(200次以上); 再吸入少量生理鹽水, 混合均勻后靜置5 min稍待沉淀, 吸取上層細胞懸液至另一離心管; 離心后的細胞沉淀低滲處理, 低滲液為0.075 mol/L KCl液, 卡諾氏液固定, 換液3次, 制成細胞懸液; 用滴管在距離干凈冷凍玻片1 m處滴片, 酒精燈火焰干燥方法制片, Giemsa染液染色2 h后, 對玻片反面用微流水沖洗, 室溫下晾干后, 獲得湘云金鳙的腎細胞染色體玻片標(biāo)本。

圖1 實驗用洞庭湖區(qū)湘云金鳙

1.2.2 染色體數(shù)目統(tǒng)計及組型分析

在光學(xué)顯微鏡下觀察湘云金鳙的腎細胞染色體玻片標(biāo)本, 選擇100個形態(tài)比較清晰、分散較好的染色體中期分裂相, 油鏡下用顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)逐一進行拍照保存, 再利用Photoshop軟件統(tǒng)計拍攝的每個分裂相的染色體數(shù)目, 統(tǒng)計湘云金鳙的染色體眾數(shù)分布數(shù)據(jù)。確定其染色體數(shù)目后, 選取5個數(shù)目完整、分散良好、圖像最清晰、染色體長度適中的中期分裂相, 用Image J軟件測量其全長、短臂長和長臂長, 用Microsoft excel軟件計算其相對長度和臂比, 得到湘云金鳙的核型數(shù)據(jù), 依照Levan等[22]的染色體分組標(biāo)準(zhǔn)對湘云金鳙進行核型分析。

表1 洞庭湖區(qū)湘云金鳙染色體數(shù)目分布

2 實驗結(jié)果

2.1 洞庭湖區(qū)湘云金鳙的染色體數(shù)目

統(tǒng)計8條湘云金鳙共100個數(shù)目完整、圖像清晰的中期分裂相的結(jié)果(表1): 染色體數(shù)目在45及以下、47和49及以上的均為1個細胞, 染色體數(shù)為45的3個細胞, 為46的4個細胞, 為48的40個細胞。染色體數(shù)目為48的細胞占計數(shù)細胞總數(shù)的80%, 眾數(shù)百分率高于75%的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn), 由此確定洞庭湖區(qū)人工養(yǎng)殖湘云金鳙的標(biāo)準(zhǔn)染色體數(shù)2N = 48(圖2)。

2.2 洞庭湖區(qū)湘云金鳙的染色體組型

根據(jù)洞庭湖區(qū)人工養(yǎng)殖湘云金鳙染色體相對長度和臂比值的測量結(jié)果(表2), 將其染色體配成24對, 按Levan命名法, 湘云金鳙的核型由12對中部著絲粒染色體、9對近中部著絲粒染色體、3對近端部著絲粒染色體組成(圖3), 沒有端部著絲粒染色體, 核型公式為2N = 24 m+18 sm+6 st, NF = 90, 在湘云金鳙的雌雄個體之間未發(fā)現(xiàn)與性別有關(guān)的異型性染色體, 也未發(fā)現(xiàn)帶有特殊標(biāo)志性特征如隨體和次縊痕等的染色體。

圖2 洞庭湖區(qū)湘云金鳙的染色體中期分裂相(CN = 48) (×1 000)

表2 洞庭湖區(qū)湘云金鳙的染色體核型分析

圖3 洞庭湖區(qū)湘云金鳙的染色體中期分裂相及組型(標(biāo)尺=5 μm)

根據(jù)已報道的鳙的染色體組型(表3)可知, 湖北、云南、北京、江蘇、湖南等地的鳙的染色體數(shù)目是一致的, 但在染色體組型上存在一定差異; 且湖南洞庭湖區(qū)的鳙與湖北武漢的鳙染色體組型差異較小, 而與北京和江蘇的鳙染色體組型差異較大。

表3 不同水域鳙、鰱魚的核型比較

注: 部分文獻臂數(shù)算法跟本文采用的不一致, 現(xiàn)已全部換成余先覺所用的方法得出。

3 分析與討論

染色體是遺傳物質(zhì)的主要載體, 魚類染色體核型分析對研究魚類的分類、系統(tǒng)演化、遺傳變異、性別決定、雜交育種等具有重要意義。根據(jù)前人報道(表3)可知: 不同區(qū)域鳙的染色體二倍體數(shù)目相同, 而在染色體組型上存在差異, 表現(xiàn)出一定的多態(tài)性。究其原因, 有可能是由于鳙魚群體所處水域不同, 環(huán)境差別大, 由于長期人工繁殖, 各個地區(qū)的鳙魚無法與其他地區(qū)的鳙魚進行基因的交流, 致使它們?yōu)檫m應(yīng)不同的環(huán)境, 在染色體組型方面產(chǎn)生差異。有研究表明, 鳙、鰱不同種群間形態(tài)特征差異的大小與其地理距離成正相關(guān)[26]。據(jù)表3中不同區(qū)域鳙的染色體組型來分析, 北京和云南鳙的核型差異較大, NF值差別最大。湖南與湖北鳙的核型差異較小, NF值差別最小。該結(jié)果表明不同區(qū)域鳙染色體組型差異的大小與其地理距離成正相關(guān), 這與它們在形態(tài)特征上的差異是一致的。

周暾[9]的研究顯示湖北武漢東湖鳙的2N = 48, 核型公式為: 6 m+36 sm+6 st, NF = 90; 余先覺等[12]的研究認為湖北武漢鳙的2N = 48, 核型公式為: 18 m+22 sm+8 st, NF = 88; 周暾和余先覺兩位學(xué)者在相近時間取相同地區(qū)的鳙魚得出的核型也不完全相同; 兩者相比, 余先覺所得鳙魚的m染色體明顯比周暾的多, sm染色體少, st染色體相差不大, 其原因有可能是取材不同, 細胞分裂時期不同, 導(dǎo)致觀察到染色體的效果也不相同, 也有可能是人工誤差, 在肉眼判斷著絲粒位置或手工測量臂長時出現(xiàn)一些誤差。有關(guān)湘云金鳙細胞遺傳學(xué)背景的研究表明[18], 湘云金鳙群體遺傳多樣性明顯強于普通鳙魚群體; 本文正是基于湘云金鳙與普通鳙魚存在DNA分子水平上的差異, 才開展了對湘云金鳙的染色體組型分析。當(dāng)然, 分子水平的差異不一定反映到染色體水平差異上來, 但本次得出洞庭湖區(qū)人工養(yǎng)殖湘云金鳙的2N = 48, 核型公式為: 24 m+18 sm+6 st, NF = 90, 與劉良國等[23]的研究相比, 總體特征基本相同, 說明鳙在遺傳上具有保守性; 具體數(shù)據(jù)上又存在著些許差異, 表現(xiàn)出一定的多態(tài)性。這種差異如果不是測量誤差所致, 可能正好反映出湘云金鳙與普通鳙魚在分子水平上的差異。據(jù)此, 初步推測湘云金鳙染色體組型形成的原因, 可能是由于普通鳙魚染色體發(fā)生易位、臂間倒位或異染色質(zhì)增減等較大的染色體重排等變化造成。

鰱亞科的基本染色體二倍數(shù)為48, 余先覺等[12]在中國淡水魚類染色體一書中認為鰱亞科魚是通過羅伯遜易位由2N = 50的原始類群進化而來, 并指出在2N數(shù)相同的分類群體間, 染色體臂數(shù)變化從進化上低位類群到高位類群表現(xiàn)逐漸升高的趨勢。本文報道的金鳙核型與昝瑞光[11]、劉凌云[24]、蘇澤古[25]和余先覺[12]報道的鰱的核型相對比, 發(fā)現(xiàn)鰱的中部著絲粒染色體較少, 近端部著絲粒染色體較多, NF值相對較低, 故在鰱亞科中, 鰱應(yīng)處于低位類群, 而鳙屬于較高位類群。

鯉科隸屬于鯉形目, 是世界現(xiàn)生魚類中最大的一個科, 擁有約220屬2 420種[27], 也是我國淡水魚類中最大的一個科, 占全國淡水魚類總數(shù)的一半以上。關(guān)于鯉科科以下類群的劃分及其系統(tǒng)關(guān)系, 陳宜瑜[28]將鯉科魚類劃分為鲃系(分化為野鯪亞科、鯉亞科和鲃亞科)和雅羅魚系(分化為雅羅魚亞科、鰱亞科、鲴亞科、鲌亞科、鮈亞科、鳑鲏亞科、魚丹亞科)。何舜平等[29]的研究表明鰱亞科與雅羅魚亞科的親緣關(guān)系最近, 而朱藍菲等[30]利用同工酶表型對20種鯉科魚類進行分析時發(fā)現(xiàn)鰱亞科與鲌亞科的關(guān)系較近, 凌去非等[31]用線粒體COII基因序列分析25種鯉科魚類時也驗證了朱藍菲的觀點。

表4中列出了雅羅魚系中雅羅魚亞科、鲌亞科和鲴亞科中幾種魚的染色體組型, 這幾種魚與鰱亞科魚類染色體二倍體數(shù)相同、核型特征相似, 均取自洞庭湖水域, 且均由同一學(xué)者采用同一方法獲得, 排除了由于實驗方法或?qū)嶒灄l件的不同而帶來的可能的誤差, 具有較高的參考價值。

表4 洞庭湖區(qū)雅羅魚亞科、鲌亞科、鲴亞科和鰱亞科魚類的核型比較

續(xù)表4

通過表4中4個亞科魚類的染色體組型比較可知, 鰱亞科與鲌亞科的NF值和染色體組型最接近, 故本文支持朱藍菲和凌去非的觀點, 鰱亞科與鲌亞科的關(guān)系更近。鲴亞科中的銀鲴與雅羅魚亞科中的赤眼鱒端部和近端部著絲粒染色體較少, 中部與近中部著絲粒染色體較多, NF值相對較高。根據(jù)余先覺等[12]的研究, 在洞庭湖水域的這4個亞科中, 似乎鲴亞科與雅羅魚亞科應(yīng)處于較高位類群, 而鰱亞科與鲌亞科屬于低位類群。當(dāng)然, 表4中鲴亞科和雅羅魚亞科每科均只列出了一種魚的核型, 還需進一步對洞庭湖水域更多的魚類進行染色體組型分析, 為確定雅羅魚系各亞科的親緣關(guān)系和系統(tǒng)演化提供依據(jù)。

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Karyotype analysis ofred var.

Yang Chunying1, Liu Liangguo2, Liu Fei3, Zhou Gongjian4, Li You3

(1. Normal College, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China; 2. Teaching Affairs Department, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China; 3. Key Laboratory of Zoology in Hunan Higher Education, Changde 415000, China; 4. Hunan Xiangyun Biology Science and Technology Limited Company, Changde 415000, China)

The chromosomes number and karyotype of artificial feedingred var. in Dongting lake region are analyzed by using phytohemagglutinin (PHA) and colchicine injection method in vivo to make renal cell chromosome specimens. The results show that the diploid number of metaphase chromosomes of the feedingred var. in Dongting lake region is 2N = 48, and the karyotype formula is 24 m+18 sm+6 st, NF = 90. The telocentric chromosome, the satellite chromosome or secondary constrictions are not found in the artificial feedingred var. in Dongting lake region. At the same time, the genetic diversity are explored by comparing with the karyotypes of the Hypophthalmichthyinae.

Dongting lake region;red var.; karyotype

10.3969/j.issn.1672–6146.2021.01.010

Q959.481

A

1672–6146(2021)01–0046–05

楊春英, 1124292768@qq.com; 劉良國, liuliangguo@ foxmail.com。

2020–03–18

湖南省教育廳基金項目(19C1270); 國家自然科學(xué)基金項目(31572619)。

(責(zé)任編校: 郭冬生)