趙貞堯，張保財，李鋒，宋浩

（1 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072； 2 天津大學(xué)合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心和系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津300072）

引 言

隨著國民經(jīng)濟的飛速發(fā)展，能源短缺和環(huán)境污染已成為我國工業(yè)現(xiàn)代化進程中的兩大難題，開發(fā)綠色環(huán)?？稍偕履茉吹男枨笃仍诿冀蕖Ｒ噪娀钚晕⑸餅楹诵牡纳镫姶呋到y(tǒng)，特別是產(chǎn)電微生物構(gòu)成的微生物燃料電池（microbial fuel cell，MFC）是潛在解決方案。MFC 借助產(chǎn)電微生物抽提、轉(zhuǎn)化蘊藏在有機物中的電子，并與外界環(huán)境中的電子受體（電極、金屬氧化物等）進行電子交換，實現(xiàn)化學(xué)能與電能間的能量轉(zhuǎn)化，在能源環(huán)境等諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1-4]。

產(chǎn)電微生物在生態(tài)系統(tǒng)中分布廣泛，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括細菌、真菌和古菌在內(nèi)的產(chǎn)電微生物有上百種，并且隨著篩菌技術(shù)的發(fā)展，越來越多的產(chǎn)電微生物被發(fā)現(xiàn)[5-6]。當前，希瓦氏菌（Shewanella）和地桿菌（Geobacter）作為模式產(chǎn)電菌，研究最為廣泛[7]。而自然環(huán)境中野生型產(chǎn)電微生物存在可利用底物譜窄、底物攝取代謝強度弱，胞內(nèi)電子池容量小、胞內(nèi)還原力再生效率差，胞外電子傳遞速率慢、電子通量小，且其所構(gòu)成的微生物電催化系統(tǒng)穩(wěn)定性差，難以適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境等問題，這已成為限制其工業(yè)化應(yīng)用的主要瓶頸[8]。

近年來，隨著研究的不斷深入，從基因分子水平理解產(chǎn)電微生物的代謝生理、電生理機制已成為現(xiàn)實。同時伴隨著合成生物學(xué)、基因編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，以及從頭設(shè)計合成、多模塊組合適配等工程化策略的引入，產(chǎn)電微生物的能量轉(zhuǎn)化效率得到大幅提升。本文基于產(chǎn)電微生物介導(dǎo)化學(xué)能到電能的能量轉(zhuǎn)化路徑，以模式產(chǎn)電菌Shewanella 和Geobacter 為主體，總結(jié)闡明了產(chǎn)電微生物的電子胞內(nèi)生成過程與胞外傳遞機制。系統(tǒng)綜述了近五年國內(nèi)外利用合成生物學(xué)增強產(chǎn)電微生物底物攝取利用、強化胞內(nèi)電子生成、加速胞外電子傳遞方面的研究進展（圖1），并對未來設(shè)計構(gòu)建高效產(chǎn)電細胞的研究進行了展望。

1 產(chǎn)電微生物的胞內(nèi)電子生成與胞外電子傳遞機制

1.1 產(chǎn)電微生物的胞內(nèi)電子生成

產(chǎn)電微生物作為微生物燃料電池系統(tǒng)的催化核心，通常以環(huán)境中的有機物（如甲酸、乙酸、乳酸、葡萄糖等）作為電子供體。有機底物經(jīng)過產(chǎn)電微生物的中心碳代謝，將電子傳遞給胞內(nèi)NAD+、FAD 形成胞內(nèi)還原力NADH、FADH2，或存儲在丙酮酸、甲酸等中間代謝物中，這些胞內(nèi)還原力和富含電子的中間代謝物共同構(gòu)成了產(chǎn)電微生物的胞內(nèi)可釋放電子池。隨后，在NADH 脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、甲酸脫氫酶等酶催化下，胞內(nèi)電子載體攜帶的電子匯入位于細胞內(nèi)膜的醌池中，位于醌池中的電子經(jīng)過甲基萘醌脫氫酶釋放，實現(xiàn)電子的胞內(nèi)生成，并最終通過胞外電子傳遞系統(tǒng)傳遞到胞外電子受體[9-11]。

圖1 產(chǎn)電細胞電子生成和傳遞Fig.1 Electron generation and transfer of exoelectrogens

NADH 是產(chǎn)電微生物胞內(nèi)主要的電子存在形式，負載了絕大部分來自底物的電子，在NADH 脫氫酶的催化下，電子實現(xiàn)從NADH 到內(nèi)膜醌池的匯集轉(zhuǎn)化。因此，產(chǎn)電微生物NADH 脫氫酶催化的效率直接影響了產(chǎn)電微生物胞內(nèi)電子的生成效率。目前共發(fā)現(xiàn)三類NADH 脫氫酶[9,12]：①Na+跨膜移位的 NADH 脫 氫 酶（Na+-translocating NADH dehydrogenase,NQR），在NQR 催化的NADH 氧化過程中，伴隨Na+的跨膜運輸，產(chǎn)生膜兩側(cè)的離子梯度勢，從而對酶催化反應(yīng)產(chǎn)生反饋抑制作用[13]。②H+跨膜移位的Ⅰ型NADH 脫氫酶（H+-pumping type ⅠNADH dehydrogenase, NDH Ⅰ），NDH Ⅰ催化的NADH 氧化，伴隨著H+的跨膜運輸，從而產(chǎn)生膜兩側(cè)的質(zhì)子動力勢。一方面，膜兩側(cè)的質(zhì)子動力勢驅(qū)動了ATP合酶加速合成ATP；另一方面，較大的質(zhì)子動力勢又反饋抑制了NDH Ⅰ催化的NADH 氧化反應(yīng)，不利于電子從NADH 到內(nèi)膜醌池的傳遞。③無質(zhì)子跨膜的Ⅱ型NADH 脫氫酶（non-protonpumping type ⅡNADH dehydrogenase, NDH Ⅱ），由于NDH Ⅱ催化過程中不存在H+的跨膜轉(zhuǎn)運，這使得NADH 的氧化反應(yīng)不受高離子梯度勢或質(zhì)子動力勢的反饋抑制，另外NDH Ⅱ僅由一條肽鏈組成，蛋白分子大小僅為上兩類脫氫酶的1/10，極大降低了細胞的生理、代謝負荷。在大多數(shù)產(chǎn)電微生物中，三類NADH 脫氫酶均有分布，共同催化電子從NADH到內(nèi)膜醌池的轉(zhuǎn)化。

1.2 產(chǎn)電微生物的胞外電子傳遞

通常認為電子從細胞（內(nèi)）膜到胞外電子受體（電極、金屬氧化物等）的傳遞過程為產(chǎn)電細胞的胞外電子傳遞（extracellular electron transfer, EET）[5]。來自醌池的電子通過細胞表面導(dǎo)電元件，跨越絕緣的細胞外結(jié)構(gòu)（細胞膜、細胞壁），通過直接或間接的方式傳遞到胞外電子受體。目前，兩種胞外電子傳遞機制得到廣泛認可。

（1）基于細胞色素蛋白或?qū)щ娂{米線介導(dǎo)的直接電子傳遞：c 型細胞色素蛋白是產(chǎn)電微生物表面的主要導(dǎo)電元件，在絕大部分產(chǎn)電微生物中均有分布。這些色素蛋白中含有多個血紅素，利用鐵原子氧化態(tài)與還原態(tài)之間的可逆反應(yīng)介導(dǎo)電子傳遞。目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種色素蛋白，但對其分子機制的研究主要集中在模式產(chǎn)電菌奧達奈希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）的金屬還原途徑（MtrCAB）和硫還原地桿菌（Geobacter sulfurreducens）的Pcc 途徑[14]。在MtrCAB 途徑中，位于細胞內(nèi)膜的甲萘酚脫氫酶CymA 將匯入醌池的電子傳遞到周質(zhì)色素蛋白FccA、STC 等，隨后通過外膜MtrCAB 色素蛋白多聚體傳遞到胞外[15]。最新研究顯示，外膜MtrCAB 色素蛋白多聚體由周質(zhì)色素蛋白MtrA、跨膜孔蛋白MtrB和外膜色素蛋白MtrC組成。MtrA、MtrC是含有多個血紅素的c 型色素蛋白，MtrB 是細胞外膜上由26 股反向平行的β 鏈組成的疏水性桶狀孔蛋白，連接了外膜兩側(cè)的色素蛋白，將嵌入內(nèi)側(cè)的含有血紅素的MtrA 與外環(huán)境隔離，形成自然絕緣的“分子電線”可有效防止氧氣等外源分子掠奪膜內(nèi)電子[16]。G.sulfurreducens 的Pcc 路徑與MtrCAB 相似，包含了內(nèi)膜色素ImcH 和CbcL、周質(zhì)空間色素PpcA-E 以及外膜色素蛋白OmaB、OmaC、OmcB 及OmcC 等[17-21]。不同的是，Geobacter的色素蛋白更豐富，并含有多個同源物，這使其具有多條“膜電子通道”，因此，G.sulfurreducens相比S.oneidensis具有更大的跨膜電子通量。

除了細胞色素蛋白，產(chǎn)電微生物還可以利用細胞表面長達數(shù)十微米的菌毛，即“導(dǎo)電納米線（e-Pili）”介導(dǎo)電子的遠距離傳導(dǎo)[22-25]。當前，對產(chǎn)電微生物“導(dǎo)電納米線”介導(dǎo)胞外電子傳遞的研究主要集中在G.sulfurreducens 的IV 導(dǎo)電菌毛Pili 上，e-Pili由菌毛蛋白PilA 單體組裝而成，富含芳香氨基酸[26-29]。目前關(guān)于電子在e-Pili 中的傳遞機制仍有爭論。Malvankar 等[30]認為e-Pili 芳香氨基酸殘基的π-π 鍵軌道相互重疊，電子在電子云中自由穿梭，以離域的形式沿著菌毛傳遞；而另一種觀點認為電子并非以自由穿梭的形式沿e-Pili 傳遞，而是借助e-Pili 中的芳香氨基酸或色素蛋白（OmcS 等），以電子跳躍的形式傳遞[31]。

（2）基于可溶性氧化還原活性分子介導(dǎo)的間接電子傳遞：除上述基于細胞色素蛋白或?qū)щ娂{米線介導(dǎo)的直接電子傳遞外，產(chǎn)電微生物還可利用自身分泌的或環(huán)境中存在的可溶性氧化還原活性分子（黃素類[32-33]、吩嗪類[34]、醌類[35-36]）以及細胞代謝中間物（甲酸、氫氣）間接介導(dǎo)電子傳遞。目前，針對可溶性氧化還原活性分子介導(dǎo)產(chǎn)電微生物間接電子傳遞機制的研究，主要集中在黃素類化合物介導(dǎo)S. oneidensis 間接電子傳遞上。最初認為這些氧化還原活性分子，以游離形式穿梭于產(chǎn)電菌和電子受體之間，通過“雙電子氧化還原反應(yīng)”介導(dǎo)產(chǎn)電微生物的電子傳遞[33]。但近期研究發(fā)現(xiàn)，一些小分子化合物（如黃素類物質(zhì)）還可以作為外膜色素蛋白的輔因子，與外膜導(dǎo)電色素蛋白結(jié)合在一起形成半醌等物質(zhì)，以“單電子氧化還原反應(yīng)”方式加快基于導(dǎo)電色素蛋白的單電子傳遞過程，其電子傳遞速率是色素蛋白直接接觸導(dǎo)電速 率 的103～105倍[37-40]。Breuer 等[41-42]進 一 步 研 究了Shewanella 外膜色素蛋白與黃素類化合物的作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)色素蛋白與黃素的結(jié)合是一個可逆過程，色素蛋白中高保守CX8C 模體中的半胱氨酸巰基氧化形成的二硫鍵是調(diào)控黃素分子與色素蛋白綁定結(jié)合的核心部位，這一核心區(qū)域受到外界環(huán)境的直接影響。在厭氧環(huán)境中，二硫鍵處于還原狀態(tài)，加速黃素分子與色素蛋白的結(jié)合，進而形成單電子介導(dǎo)機制；而在有氧條件下，氧化態(tài)的二硫鍵不利于黃素分子與色素蛋白結(jié)合，導(dǎo)致黃素分子-色素蛋白復(fù)合物分離，黃素類分子以雙電子機制介導(dǎo)電子傳遞。此外，部分產(chǎn)電微生物還可通過分泌c-型色素蛋白，并以其作為電子傳遞載體介導(dǎo)間接電子傳遞[41-42]，如Geobacter 可通過分泌色素蛋白pgcA，在缺少導(dǎo)電納米線情況下還原不溶性鐵氧化物，但這些分泌型色素蛋白類電子傳遞載體往往具有電子受體特異性，只能將電子傳遞到金屬氧化物等特定電子受體中[43]。

2 產(chǎn)電微生物能量轉(zhuǎn)化效率的合成生物學(xué)強化

2.1 產(chǎn)電微生物底物攝取范圍與攝取速率的合成生物學(xué)強化

自然環(huán)境中野生型產(chǎn)電微生物受限于底物轉(zhuǎn)運蛋白和胞內(nèi)相關(guān)代謝酶缺乏，致使底物攝取范圍窄、代謝速率緩慢，嚴重限制了產(chǎn)電微生物的電子生成和傳遞效率[44-45]。近年來，研究人員分別采用自適應(yīng)性進化策略和合成生物學(xué)理性設(shè)計方法，拓寬了產(chǎn)電微生物的底物攝取范圍，提高了底物攝取速率，同時按照“勞力分工”原則構(gòu)建了混合產(chǎn)電微生物菌群，進一步提高了以產(chǎn)電微生物為核心的微生物燃料電池的能量轉(zhuǎn)化效率。

圖2 產(chǎn)電菌的底物攝取范圍拓寬(a)構(gòu)建代謝木糖產(chǎn)電的工程希瓦氏菌[47];(b)構(gòu)建希瓦氏菌-肺炎克雷伯氏菌合成菌群產(chǎn)電[55];(c)構(gòu)建釀酒酵母菌-希瓦氏菌合成菌群產(chǎn)電[56];(d)構(gòu)建藍藻-希瓦氏菌合成菌群產(chǎn)電[57]Fig.2 Extension of substrate scope of electrogenic bacteria(a)construction of S.oneidensis for metabolizing xylose[47];(b)synthetic Klebsiella pneumoniae-Shewanella oneidensis consortium for power generation[55];(c)synthetic S.cerevisiae-S.oneidensis consortium for power generation[56];(d)synthetic S.cyanobacteria-S.oneidensis consortium for power generation[57]

2.1.1 拓寬底物攝取范圍 以模式產(chǎn)電菌Shewanella 為代表的產(chǎn)電微生物可利用底物譜窄，僅可以利用甲酸、乳酸等有機酸作為電子供體產(chǎn)電。為增強產(chǎn)電微生物對葡萄糖、木糖、甘油等廉價、易得、分布廣泛底物的利用效率，Sekar 等[46]采用適應(yīng)性進化和定向篩選策略，激活了Shewanella MR-1 的木糖代謝途徑，使之能夠代謝木糖生長。相比于適應(yīng)性進化，合成生物學(xué)理性設(shè)計在拓寬底物譜的同時提高了底物的攝取速率。Li等[47]將假絲酵母（Candida intermedia）和丙酮丁醇梭桿菌（Clostridium acetobutylicum）的木糖轉(zhuǎn)運蛋白，大腸桿菌（Escherichia coli）的異構(gòu)酶途徑以及裂殖酵母（Schefersomyces stipites）的氧化還原酶途徑在S.oneidensis MR-1 中異源表達，構(gòu)建了木糖攝取代謝路徑，使其可以將木糖作為電子供體放電，進一步提高了產(chǎn)電微生物的底物利用效率[圖2（a）]。

葡萄糖作為最常見的工業(yè)發(fā)酵底物，單摩爾電子含量要遠高于乳酸。通過對Shewanella 的基因序列比對分析發(fā)現(xiàn)，其自身具有代謝葡萄糖的Entner-Doudoroff 途徑，這表明Shewanella 具有利用葡萄糖產(chǎn)電的潛力。針對這一現(xiàn)象，Howard 等[48]在僅含有葡萄糖的最小培養(yǎng)基中篩選了具備代謝葡萄糖能力的Shewanella，這證明Shewanella 的確具有利用葡萄糖為單一碳源的能力。此外，Choi 等[49]將運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）的葡萄糖轉(zhuǎn)運基因（glf）和葡萄糖激酶基因（glk）在S. oneidensis MR-1中進行異源表達，經(jīng)過改造后的S. oneidensis MR-1能夠利用葡萄糖作為單一碳源生長，同時也可以葡萄糖作為電子供體。因此，通過適應(yīng)性進化策略與合成生物學(xué)理性設(shè)計方法可不斷拓寬產(chǎn)電微生物可用底物譜，對擴展產(chǎn)電微生物的應(yīng)用范圍具有重要意義。

2.1.2 強化底物轉(zhuǎn)化速率 在拓寬產(chǎn)電微生物的底物利用譜范圍的同時，提高產(chǎn)電細胞的底物攝取速率可進一步強化產(chǎn)電微生物的代謝速率與代謝通量，從而增強產(chǎn)電微生物電子的胞內(nèi)生成。為此，Johnson 等[50]在S.oneidensis MR-1 中表達了光驅(qū)動質(zhì)子泵視紫紅質(zhì)，光照條件下，質(zhì)子泵視紫紅質(zhì)將質(zhì)子逆濃度梯度跨膜轉(zhuǎn)運，從而在細胞膜兩側(cè)產(chǎn)生更大的質(zhì)子動力勢，提高了底物乳酸的攝取速率，最終增強了S.oneidensi 的電子傳遞速率。除了通過合成生物學(xué)理性改造產(chǎn)電微生物外，通過人工干預(yù)改變產(chǎn)電微生物的電化學(xué)環(huán)境或外源添加化學(xué)物質(zhì)改變細胞膜通透性也可以提高底物轉(zhuǎn)化速率，Matsuda 等[51]證明Shewanella 中TCA 循環(huán)活性受到電化學(xué)的精確門控，這使得改變陽極電位以提速Shewanella 的物質(zhì)代謝速率成為可能。Wang 等[52]發(fā)現(xiàn)向微生物燃料電池中添加乙二胺四乙酸(EDTA)，可顯著提高微生物燃料電池的功率密度，進一步研究發(fā)現(xiàn)，EDTA 不僅能夠改善S. oneidensis MR-1 的外膜通道環(huán)境，還能上調(diào)S.oneidensi 的TCA 循環(huán)相關(guān)基因的表達水平，進一步增強了其TCA 循環(huán)的代謝強度，從而拉動、提升了底物攝取與轉(zhuǎn)化速率。此外，Wen 等[53]用表面活性劑鼠李糖脂處理細胞，發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂能夠顯著加強產(chǎn)電菌自身酶活從而促進菌體生長，同時降低細胞膜的電子傳遞阻力，提升了電子傳遞速率。通過增強細胞邊界膜結(jié)構(gòu)的通透性，可顯著提高底物的攝取、代謝速率，降低電子傳遞的阻力。

2.1.3 構(gòu)建混菌生態(tài)系統(tǒng) 針對單種產(chǎn)電微生物的底物改造往往會增加產(chǎn)電菌的代謝負荷，難以大幅提高產(chǎn)電菌的電子傳遞速率與能量轉(zhuǎn)化效率。通過構(gòu)建人工混菌系統(tǒng)，調(diào)配多菌間相互作用，實現(xiàn)菌株間代謝耦合適配，增強混菌產(chǎn)電體系利用廉價工業(yè)發(fā)酵底物和復(fù)雜混合物系統(tǒng)的產(chǎn)電能力，從而徹底解除Shewanella、Geobacter 等模式產(chǎn)電菌的底物限制。Li 等[54-55]構(gòu)建了肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）和S. oneidensis MR-1 的兩菌混菌產(chǎn)電體系，K.pneumoniae以葡萄糖、木糖或甘油作為底物高產(chǎn)乳酸供給S.oneidensis 產(chǎn)電，該系統(tǒng)可通過降解玉米秸稈水解液高效產(chǎn)電，實現(xiàn)農(nóng)牧廢物向清潔電能的轉(zhuǎn)化[圖2（b）]；Lin 等[56]以葡萄糖作為底物，將釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和S.oneidensis MR-1 混合培養(yǎng)，通過合成生物學(xué)改造強化了S. cerevisiae 的乳酸生產(chǎn)能力，并增強S.oneidensis MR-1細胞膜通透性、導(dǎo)電性，使得混菌產(chǎn)電系統(tǒng)的功率密度大幅提升[圖2（c）]；Zhu 等[57]構(gòu)建了新型的微生物光伏系統(tǒng)，光合藍細菌（Synechococcus elongatus）在光照下將二氧化碳轉(zhuǎn)化為乳酸供給S.oneidensis MR-1 產(chǎn)電，通過培養(yǎng)過程優(yōu)化使得產(chǎn)電系統(tǒng)可以持續(xù)工作超過40 d[圖2（d）]。因此，建立代謝耦合的人工菌群產(chǎn)電系統(tǒng)能夠顯著強化MFC 的底物攝取范圍以及攝取能力，實現(xiàn)復(fù)雜底物向電能的轉(zhuǎn)化。

2.2 產(chǎn)電微生物胞內(nèi)電子生成的合成生物學(xué)強化

野生型產(chǎn)電微生物往往面臨胞內(nèi)電子池容量小，胞內(nèi)還原力再生速率差以及胞內(nèi)還原力-電子轉(zhuǎn)化效率低等問題，這嚴重限制了產(chǎn)電細胞的電子輸出通量和胞外電子傳遞速率。為此，研究人員利用合成生物學(xué)理性設(shè)計方法和多模塊組合工程策略，強化胞內(nèi)還原力再生，提高了胞內(nèi)NADH/NAD+比例和總量。使得胞內(nèi)可釋放電子池得到拓寬，加快胞內(nèi)還原力到可釋放電子的轉(zhuǎn)化，強化了產(chǎn)電微生物的胞內(nèi)電子生成。

2.2.1 強化胞內(nèi)還原力再生 胞內(nèi)還原力再生水平與可釋放電子池容量(NADH/NAD+比例及總量）直接決定了產(chǎn)電細胞的可釋放電子水平。通過加快中心碳代謝、抑制胞內(nèi)還原力消耗路徑（如乳酸合成代謝）、過表達NAD+合成酶基因等手段可顯著提高產(chǎn)電微生物的胞內(nèi)電子池容量。在厭氧條件下，微生物通過合成富含電子的中間產(chǎn)物（如丙酮酸等）以維持自身胞內(nèi)氧化還原平衡。然而，這使得胞內(nèi)電子發(fā)生流失，為此，Yong 等[58]在E.coli中通過敲除乳酸脫氫酶基因ldhA，在厭氧條件下抑制了丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化，從而提升胞內(nèi)NADH/NAD+的比例和總量，提高了細胞與電極之間的電子傳遞速率[圖3（a）]。在厭氧條件下，微生物中心碳代謝受到多重調(diào)控系統(tǒng)的嚴密調(diào)控，導(dǎo)致TCA 循環(huán)強度下降，源自電子供體的電子大多儲存在乙醇、甲酸、乙酸等中間代謝物中，難以釋放到胞外。針對這一問題，Liu等[59]通過敲除E.coli雙組分調(diào)控系統(tǒng)Arc中的arcA 基因，提高了TCA 循環(huán)的代謝強度，增強了厭氧條件下E.coli 呼吸能力，最終提升其電催化效率和電流輸出能力[圖3（b）]。

圖3 產(chǎn)電菌胞內(nèi)電子生成和傳遞的強化(a)敲除ldhA以擴充大腸桿菌可釋放電子池[58];(b)敲除arcA以擴充大腸桿菌可釋放電子池[59];(c)模塊化強化NADH再生路徑以強化希瓦氏菌胞內(nèi)還原力再生[60];(d)改造希瓦氏菌從頭合成NAD+以強化希瓦氏菌胞內(nèi)還原力再生[61]Fig.3 Generation and transform of intracellular electronics in electrogenic bacteria(a)knockdown ldhA in E.coli for augmenting intracellular electron pool[58];(b)knockdown arcA in E.coli for augmenting intracellular electron pool[59];(c)modular engineering regeneration pathway of NADH in S.oneidensis for intracellular reducing power regeneration[60];(d)engineering de novo biosynthesis of NAD(H/+)in S.oneidensis for intracellular reducing power regeneration[61]

相比于E.coli，Shewanella 作為模式產(chǎn)電微生物更具備電子池擴容潛力。近年來，通過從頭設(shè)計合成、多模塊組合工程策略強化，研究人員拓寬Shewanella 的胞內(nèi)還原力再生與可釋放電子池，顯著提高了微生物燃料電池的輸出功率。Li等[60]利用合成生物學(xué)模塊化策略和代謝工程方法，對S.oneidensis MR-1中心碳代謝中所有氧化還原路徑進行了系統(tǒng)分析。從糖酵解路徑、C1 代謝路徑、丙酮酸發(fā)酵代謝路徑和TCA 循環(huán)四個模塊中挖掘到4個顯著增強NADH 再生的基因并進行模塊化組合表達，將NADH/NAD+比例提高4.3倍，使得代謝流更多地流向NADH 再生方向，強化了胞內(nèi)還原力再生[圖3（c）]。此外，Li 等[61]重構(gòu)了S. oneidensis MR-1 內(nèi)的NAD+的生物合成路徑，通過合成生物學(xué)模塊化手段解耦、組合NAD+從頭合成途徑、補救合成途徑和通用合成路徑，成功將胞內(nèi)NAD（H/+）總量提高2.1倍，并將其胞外電子傳遞速率提升4.4 倍，揭示了產(chǎn)電微生物的胞內(nèi)還原力NAD（H/+）總量是限制其胞外電子傳遞速率的核心瓶頸之一[圖3（d）]。

2.2.2 提高胞內(nèi)還原力-電子轉(zhuǎn)化效率 儲存在胞內(nèi)NADH 中的電子在NADH 脫氫酶的作用下，匯入醌池，實現(xiàn)胞內(nèi)還原力到電子的轉(zhuǎn)化。針對野生型產(chǎn)電微生物NADH 脫氫酶催化效率低限制胞內(nèi)還原力-電子轉(zhuǎn)化效率這一瓶頸問題，通過設(shè)計優(yōu)化NADH 脫氫酶，可以顯著增強NADH 的電子釋放，增強產(chǎn)電微生物胞內(nèi)還原力-電子的轉(zhuǎn)化效率。Vamshi 等[62]在E.coli 中異源表達來自枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的NAD Ⅱ，工程改造后的E.coli 電流輸出能力提升了9 倍，同時促進了電極表面生物膜的形成，極大降低了其電荷轉(zhuǎn)移阻力。另外，Shewanella loihica PV-4 中的NAD II 具有較強的催化活性，在模式產(chǎn)電菌S.oneidensis MR-1 中異源表達源自Shewanella loihica PV-4 的NAD Ⅱ，極大地強化了S.oneidensis MR-1 的還原力-電子的轉(zhuǎn)化速率[63]。因此，通過優(yōu)化改造NADH 脫氫酶，促進胞內(nèi)還原力到電子的轉(zhuǎn)化，可以加快胞內(nèi)電子匯入內(nèi)膜醌池，從而擴充內(nèi)膜電子通量。

2.3 產(chǎn)電微生物的胞外電子傳遞的合成生物學(xué)強化

產(chǎn)電微生物胞外電子傳遞速率低是限制微生物電催化系統(tǒng)工業(yè)化廣泛應(yīng)用的重要瓶頸[64]，針對這一關(guān)鍵科學(xué)問題，近年來，研究人員基于產(chǎn)電微生物直接電子傳遞和間接電子傳遞機制，將合成生物學(xué)理性設(shè)計與多模塊組合適配工程策略融入設(shè)計中。通過優(yōu)化產(chǎn)電微生物色素蛋白系統(tǒng)、強化導(dǎo)電納米線介導(dǎo)的遠距離電子傳遞、構(gòu)建電活性生物膜以及強化電子傳遞載體的合成傳遞，顯著提高了產(chǎn)電微生物的胞外電子傳遞速率。

2.3.1 優(yōu)化細胞色素蛋白系統(tǒng) 細胞色素蛋白是電子跨越絕緣細胞膜的高速通道，連接了胞內(nèi)電子生成系統(tǒng)與胞外電子傳遞系統(tǒng)，同時也是直接電子傳遞和間接電子傳遞兩種電子傳遞機制的交匯點[14]。設(shè)計、優(yōu)化產(chǎn)電微生物的細胞色素蛋白系統(tǒng)對提高其胞外電子傳遞速率具有重要意義。Ajo-Franklin等[65-68]在非電活性微生物E.coli中從頭設(shè)計構(gòu)建了導(dǎo)電色素蛋白系統(tǒng)，他們將S.oneidensis MR-1 的CymA、MtrCAB 關(guān)鍵導(dǎo)電色素蛋白引入E. coli，在E.coli 建立了一套新的電子傳遞通道，最終顯著提高了E.coli對金屬離子和金屬氧化物的還原速率[圖4（a）]；此外，Sekar等[69]將Geobacter 的外膜色素蛋白OmcS 引入藍藻（Synechococcus elongatus PCC 7942），外膜色素蛋白的引入顯著地提升了S.elongatus 的胞外電子傳遞速率，使得生物光電池的光電子生成能力提升了9倍。

相較于非電活性微生物，電活性微生物本源的色素蛋白系統(tǒng)需要進一步理性設(shè)計和工程改造。通過完善周質(zhì)電子傳遞鏈、消除周質(zhì)空間耗電子反應(yīng)、提升外膜導(dǎo)電蛋白數(shù)量等策略改善基于色素蛋白系統(tǒng)的電子傳遞速率。位于S.oneidensis MR-1細胞內(nèi)膜的CymA 是連接醌池和外膜氧化還原蛋白（MtrA、OmcA 和OmcB）之間的重要電子傳遞通道，Vellingiri 等[70]通過過表達S. oneidensis MR-1 中的cymA 基因強化了微生物燃料電池的產(chǎn)電性能[圖4（b）]；Delgado 等[71]認為S.oneidensis 周質(zhì)空間雜亂的電子傳遞環(huán)境可能導(dǎo)致部分電子無法傳遞到MtrABC復(fù)合物，從而不能最大化胞內(nèi)電子輸出。隨后，他們?yōu)榱讼糠种苜|(zhì)空間電子競爭并提升電子向外傳遞速率，將部分起到電子爭奪作用的基因替換為血紅素合成基因cctA，將S. oneidensis 的cctA表達強度上調(diào)3.7 倍，最終使得檸檬酸鐵的還原率提升了1.7 倍，所輸出電流密度提升了23%。Min等[72]將黃素生物合成基因簇ribD-ribC-ribBA-ribE和胞外氧化還原蛋白mtrC-mtrA-mtrB 在S.oneidensis MR-1 中共同表達，最大電流密度分別增加了約110%和87%，顯著地增強基于兩種電子傳遞機制的電子傳遞速率[圖4（c）]。以上研究結(jié)果證明，采用合成生物學(xué)方法優(yōu)化介導(dǎo)電子傳遞過程的細胞色素蛋白將顯著提高產(chǎn)電微生物的胞外電子傳遞能力。

圖4 強化導(dǎo)電元件提升電活性微生物產(chǎn)電能力(a)異源表達mtrCAB的大腸桿菌用于還原可溶性金屬氧化物[68];(b)過表達cymA加強希瓦氏菌的胞外電子傳遞[70];(c)共表達mtrC-mtrA-mtrB和ribD-ribC-ribBA-ribE 增強希瓦氏菌的胞外電子傳遞[72]Fig.4 Strengthen the conductive components for enhanceing the electricity generation capacity of electroactive microorganisms(a)overexpressing mtrCAB in E.coli for reducing soluble metal oxide[68];(b)overexpressing cymA in S.oneidensis for enhancing extracellular electron transfer[70];(c)coexpression of mtrC-mtrA-mtrB and ribD-ribC-ribBA-ribE in S.oneidensis for enhanceing extracellular electron transfer[72]

2.3.2 強化導(dǎo)電納米線介導(dǎo)的遠距離電子傳遞 產(chǎn)電微生物細胞表面長達數(shù)十微米的導(dǎo)電納米線由于其超高的電導(dǎo)率，在電子的長距離傳遞中展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。然而，目前僅有G.sulfurreducens 等少數(shù)產(chǎn)電菌具有導(dǎo)電納米線，通過對不具備導(dǎo)電性的菌毛單體蛋白結(jié)構(gòu)進行編碼重構(gòu)，可顯著提高產(chǎn)電細胞菌毛的電導(dǎo)率。Liu等[73]在敲除P.aeruginosa的菌毛單體蛋白pilA*的同時，異源表達來自G.sulfurreducens的菌毛蛋白基因pilA，成功組裝出電導(dǎo)率與G. sulfurreducens 相當?shù)膃-Pili。通過比對多株產(chǎn)電菌菌毛單體蛋白PilA 的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)菌毛單體蛋白PilA 的N 端序列呈現(xiàn)高度保守的α-螺旋。相比于其他菌株，G. sulfurreducens 的菌毛蛋白PilA僅有N 端保守區(qū)的61 個氨基酸。隨后，他們將P.aeruginosa 的PilA*截斷，表達僅含N 端61 個氨基酸的PilA*1～61，發(fā)現(xiàn)敲除pilA*的P.aeruginosa 能夠形成e-Pili，電子傳遞速率顯著提高，由此推測菌毛蛋白PilA 的N 端保守α-螺旋可能是導(dǎo)電Pili 的核心結(jié)構(gòu)。此外，在G. sulfurreducens 的菌毛單體蛋白PilA的C 末端融合功能短肽（組氨標簽等），在保持產(chǎn)電細胞Pili 高電導(dǎo)率的同時使其具有特異性吸附、識別功能，可進一步拓寬產(chǎn)電微生物在生物傳感器、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)電納米導(dǎo)線的電導(dǎo)率與菌毛單體蛋白PilA 中的芳香氨基酸密切相關(guān)。通過將G.sulfurreducens中PilA 蛋白C 端的苯丙氨酸和酪氨酸替換為電子云密度更高的色氨酸，G.sulfurreducens 的pili 直徑縮減至1.5 nm，僅為原來的一半，而所形成的e-Pili 電導(dǎo)率增加了2000 倍[29]。Tan 等[27]在G.sulfurreducens 中異源表達金屬還原地桿菌（G.metallireducens）的菌毛蛋白，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了更多的e-Pili，并且電導(dǎo)率提高5000 倍。相比于G.sulfurreducens，G. metallireducens 的菌毛單體蛋白C端的芳香氨基酸密度更高。因此其導(dǎo)電納米線具有更高的電導(dǎo)率，電子傳遞阻力更小，這為產(chǎn)電微生物設(shè)計合成高電導(dǎo)率的納米導(dǎo)線提供了理論依據(jù)。

圖5 強化導(dǎo)電生物膜提升微生物電活性(a)構(gòu)建近紅外光響應(yīng)性大腸桿菌生物膜系統(tǒng)催化吲哚轉(zhuǎn)化為色氨酸[80];(b)在MFC中構(gòu)建基于近紅外光響應(yīng)的c-di-GMP邏輯門[81]Fig.5 Strengthen the conductive biofilm to improve the electrical activity of microorganisms(a)construction of NIR-light-responsive E.coli biofilm system for catalyzing indole into tryptophan[80];(b)construction of NIR light responsive c-di-GMP logic gate in MFC[81]

2.3.3 構(gòu)建電活性生物膜 產(chǎn)電微生物常以多細胞形式與電極直接接觸導(dǎo)電，微生物及其分泌的蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、DNA 等胞外聚合物共同構(gòu)成導(dǎo)電生物膜。電極生物被膜通過導(dǎo)電納米線、色素蛋白及其復(fù)合物介導(dǎo)胞外電子傳遞，速率遠高于浮游細胞利用氧化還原活性分子介導(dǎo)的電子傳遞。其中，Geobacter 的陽極生物膜厚度可以達到50 μm，同時電子傳遞速率隨其生物膜增厚而提高[74-76]。然而，野生型產(chǎn)電微生物的生物被膜厚度薄、細胞數(shù)量少、內(nèi)部傳質(zhì)效率低、導(dǎo)電性差、難以適應(yīng)復(fù)雜的應(yīng)用環(huán)境。因此，通過合成生物學(xué)手段提升生物膜機械強度、導(dǎo)電性能，構(gòu)建成熟、穩(wěn)定的導(dǎo)電生物膜將進一步提高電活性微生物的胞外電子傳遞速率。

環(huán)二鳥苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）是胞內(nèi)第二信使信號分子，通過調(diào)節(jié)胞外多糖產(chǎn)生、表面黏附素表達、生物膜消散等細胞行為控制細菌的生物膜的形成[77]。在G.sulfurreducens 中存在一類受c-di-GMP 調(diào)控的PilZ 蛋白域，Leang 等[78]敲除含有PilZ 蛋白域的基因GSU1240，發(fā)現(xiàn)工程菌的生物膜厚度比野生型提升了6 倍，電極表面形成更加致密的導(dǎo)電生物膜，并成功將功率密度提升70%。Liu等[79]分別構(gòu)建了IPTG 誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子開啟表達c-di-GMP 生物合成基因ydeH 的S.oneidensis MR-1，經(jīng)過工程改造的S. oneidensis MR-1 最大功率密度可以達到野生型的2.8 倍，強化cdi-GMP 合成的工程菌幾乎完全覆蓋電極表面，極大地強化了S. oneidensis MR-1 的直接電子傳遞過程；Hu 等[80-81]利用光敏色素c-di-GMP 合成基因bphS 和發(fā)光色團合成基因bphO 構(gòu)建了光控合成生物膜的微生物，體系中存在IPTG 時，近紅外光開啟c-di-GMP生產(chǎn)進而強化生物膜形成，促進胞外電子傳遞，強化電流輸出能力和目標產(chǎn)物的合成（圖5）。以上研究結(jié)果表明，c-di-GMP參與產(chǎn)電微生物的電極生物膜形成過程，通過調(diào)控c-di-GMP 的合成將強化產(chǎn)電微生物的電極附著量以及附著面積，顯著提升基于生物膜直接電子傳遞機制介導(dǎo)的胞外電子傳遞速率。

細 胞 外 聚 合 物（extracellular polymeric substances，EPS）是位于細胞外周，由多糖、蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)構(gòu)成的，具有較強的結(jié)構(gòu)內(nèi)聚力和黏附性的復(fù)合物[82]，可以促使產(chǎn)電微生物在電極表面更好地形成生物膜。加快EPS 的合成、減緩EPS 的降解有助于生物膜更好地定植在電極表面，Ding 等[83]認為腐胺可能與EPS 的分解直接相關(guān)，通過構(gòu)建轉(zhuǎn)座子文庫，篩選到腐胺合成缺陷型菌株。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該突變株生物膜中EPS 的含量得到大幅提升，并強化了對鉻的還原能力。通過調(diào)控電活性微生物EPS成分構(gòu)成，使生物膜獲得更強的附著能力，提高電極表面的生物附著量。Kouzuma 等[84]發(fā)現(xiàn)通過敲除S.oneidensis MR-1中與多糖莢膜合成相關(guān)的基因SO3177可以增強其細胞表面的疏水性，強化在石墨電極表面的定植效果，最終使得MFC 的產(chǎn)電提高了50%；Godeke 等[85]認為胞外核酸（extracellular DNA，e-DNA）與生物膜的形成直接相關(guān)，通過敲除細胞外核酶編碼的基因exeM 從而降低e-DNA 的降解能力，顯著提升了生物膜的厚度。上述研究結(jié)果表明，工程改造產(chǎn)電細胞的EPS，對提高生物膜黏附性、增加產(chǎn)電微生物的電極表面生物量、提高微生物與電極表面電子傳遞速率具有重要意義。

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)通過調(diào)控參與黏附的膜外蛋白、引導(dǎo)群體遷徙行為、刺激EPS分泌、促進菌落形態(tài)變化等方式控制生物被膜的形成。在厭氧條件下，P. aeruginosa 中吩嗪類化合物的合成量受到2-庚基-3,4-二羥基喹啉（2-heptyl-3,4-dihydroxyquinoline，PQS）信號分子的抑制，Wang等[86]通過合成生物學(xué)手段降低厭氧條件下P.aeruginosa 中PQS 濃度，使其吩嗪合成能力顯著增強，最終將微生物燃料電池的最大電流密度提升了5 倍。分析伏安特性曲線發(fā)現(xiàn)綠膿菌素參與了電極生物膜的氧化還原反應(yīng)，這表明QS系統(tǒng)通過控制吩嗪等小分子化合物的分泌，從而強化了電極生物膜導(dǎo)電能力。Chen 等[87]研究了群體感應(yīng)信號分子?；呓z氨酸內(nèi)酯（acyl homoserine lactones,AHLs）對產(chǎn)電菌電活性的影響。借助混菌體系分析內(nèi)、外源的AHLs 分子對菌群產(chǎn)電影響，發(fā)現(xiàn)AHLs 使混菌MFC 系統(tǒng)中微生物的電化學(xué)活性、電極生物量、生物膜致密性、活/死細胞比、EPS 成分多樣性以及氧化還原性都得到提升，同時發(fā)現(xiàn)外源添加的AHLs會使Geobacter 的豐度從56%提升至71%～78%；隨后，他們[88]進一步研究了AHLs 對Geobacter soli GSS01的影響，發(fā)現(xiàn)Geobacter soli GSS01本身分泌的內(nèi)源性AHLs 可以促進生物膜的形成并強化電活性，而外源性的AHLs 則會進一步增強這些過程。因此，利用QS系統(tǒng)強化電活性微生物的電極生物膜附著、提高生物膜中的電子傳遞載體濃度對提高微生物燃料電池的產(chǎn)電性能具有積極意義。

2.3.4 強化電子傳遞載體生成 可溶性氧化還原活性分子（黃素類、吩嗪類、醌類等）介導(dǎo)的產(chǎn)電微生物間接電子傳遞是大部分產(chǎn)電微生物主要的胞外電子傳遞方式。然而，野生型產(chǎn)電微生物電子傳遞載體的合成、傳遞能力有限。為此，研究人員通過合成生物學(xué)方法強化電子傳遞載體的合成傳遞，同時按照勞力分工原則，利用人工混菌系統(tǒng)強化微生物電催化體系的電子傳遞載體供給，將產(chǎn)電微生物胞外電子傳遞速率提高數(shù)十倍。針對模式產(chǎn)電菌S. oneidensis 因黃素合成能力不足而限制其胞外電子傳遞速率的問題，Yang 等[89]將B.subtilis 中編碼核黃素合成相關(guān)酶的核心基因簇ribADEHC 在S.oneidensis MR-1 中異源表達，將核黃素產(chǎn)量提高到26.15 μmol/L，S.oneidensis MR-1 雙向電子傳遞速率分別提高13.2 倍（放電）和15.5 倍（噬電）[圖6（a）]；在此基礎(chǔ)上，Lin 等[90]進一步將ribADEHC 基因簇和P. aeruginosa PAO1 孔蛋白基因oprF 在S. oneidensis MR-1 中組合表達，同時強化了核黃素合成和傳遞能力，使核黃素的產(chǎn)量提高至39.7 μmol/L，電子傳遞效率提高12倍[圖6（b）]。這進一步證明強化黃素生產(chǎn)對S.oneidensis MR-1胞外電子傳遞效率的提升具有重大意義。

圖6 強化電子傳遞載體提升電活性微生物產(chǎn)電能力(a)構(gòu)建黃素生物合成途徑以強化希瓦氏菌胞外電子傳遞[89];(b)構(gòu)建核黃素-自組裝三維rGO雜化生物膜以強化MFC的電流輸出能力[90]Fig.6 Strengthen the electron shuttle for enhancing the electrical activity of microorganisms(a)construction of a synthetic flavin biosynthesis pathway in S.oneidensis for enhancing extracellular electron transfer[89];(b)construction of flavins-selfassembled three-dimensional(3D)rGO biohybrid biofilm for enhancing power generation of MFC[90]

除了強化S.oneidensis 單菌黃素產(chǎn)量外，理性設(shè)計、構(gòu)建高產(chǎn)黃素的人工混菌系統(tǒng)也能顯著強化MFC 的產(chǎn)電效率。Liu 等[91]設(shè)計了高產(chǎn)核黃素的B.subtilis 以及S. oneidensis MR-1 混合培養(yǎng)體系，將微生物燃料電池中的核黃素濃度從0.55 μmol/L 提高至5.32 μmol/L，顯著提升了電池體系內(nèi)的電子傳遞速率。Yang 等[92]利用合成生物學(xué)策略改造E. coil，以木糖為底物將核黃素產(chǎn)量從3.3 μmol/L 提升至115.2 μmol/L，并與高度疏水的工程S. oneidensis MR-1 共同培養(yǎng)，成功將產(chǎn)電系統(tǒng)的功率密度提升了6.8倍；Liu等[93]構(gòu)建了以葡萄糖為底物的“E.coil-B. subtilis-S. oneidensis”三菌互作產(chǎn)電系統(tǒng)。其中，E. coil 和B. subtilis 以葡萄糖為底物，分別為S.oneidensis MR-1提供電子供體乳酸和電子傳遞載體核黃素，而S.oneidensis MR-1 代謝生成的乙酸作為底物回補給E. coil 和B. subtilis，這使得放電過程的電子釋放率得到大幅提升，最終該系統(tǒng)的庫侖效率達到了55.7%。

吩嗪及其衍生物是一種以二氮雜蒽為碳骨架的化合物，當前已從自然界分離出包括吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）、吩嗪-1-酰胺（phenazine-1-carboxamide，PCN）、綠 膿 菌 素（pyocyanin，PYO）在內(nèi)的近百種吩嗪化合物。吩嗪類化合物作為電子載體參與細胞生理代謝已被廣泛研究[34,94-96]。Newman 等[97]研究發(fā)現(xiàn)，添加吩嗪類物質(zhì)可以加快包括Geobacter 和Shewanella 在內(nèi)的大多數(shù)電活性微生物的呼吸強度和胞外電子傳遞能力，Pham 等[34]通過添加實驗證實PCA、PCN 等吩嗪類物質(zhì)可將微生物燃料電池的產(chǎn)電能力提升1.5倍。針對產(chǎn)電污泥的菌落分析證實，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)可 以 利 用P. aeruginosa 產(chǎn) 出的吩嗪與電極形成新的呼吸鏈[98]。因此，提高MFC中吩嗪的濃度將顯著增強微生物的電化學(xué)活性從而提升MFC 的功率輸出能力。在模式產(chǎn)電菌P.aeruginosa PAO1中，磷酸烯醇丙酮酸經(jīng)過phzA-G 等7 個基因合成PCA，之后經(jīng)過phzS 和phzM 轉(zhuǎn)化為PYO，Schmitz 等[99]將來自P.aeruginosa PAO1 的吩嗪合成核心基因簇phzA-G 以及phzM 和phzS 在惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)中異源表達，使惡臭假單胞菌的PYO 產(chǎn)量達到45 mg/L，同時發(fā)現(xiàn)不具備產(chǎn)電能力的惡臭假單胞菌能夠檢測到電流輸出，實現(xiàn)了非電活性微生物向電活性微生物的轉(zhuǎn)化；Yong等[100]通過在P.aeruginosa 中過表達PYO 合成路徑中的phzM基因，將PYO的產(chǎn)量提高了1.6倍，顯著增強電池的產(chǎn)電能力。

除了針對吩嗪合成基因簇進行直接改造外，調(diào)節(jié)與吩嗪合成和分泌相關(guān)的調(diào)控因子也影響著吩嗪的產(chǎn)量。常見的吩嗪調(diào)控方式有群體感應(yīng)系統(tǒng)、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)以及后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，通過設(shè)計改造微生物吩嗪的調(diào)控方式對其產(chǎn)量進行人工干預(yù)是提升MFC 功率密度的重要手段。Venkataraman 等[101]對P. aeruginosa 中與GacS/GacA 雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)相關(guān)的retS 突變型進行研究發(fā)現(xiàn)，突變菌株的吩嗪產(chǎn)量提升了39 倍，這使得電流水平提升了48 倍；Yong等[102]在P. aeruginosa 中過表達群體感應(yīng)系統(tǒng)rhl 相關(guān)基因，使得MFC 的最大電流輸出提高了1.6 倍，分析發(fā)現(xiàn)相比野生型，工程菌合成了更多的吩嗪類化合物（0.4 g/ml PYO 和4 g/ml PCA），這說明QS 系統(tǒng)可以通過調(diào)節(jié)吩嗪的產(chǎn)量從而控制電流的輸出。

3 應(yīng)用展望

電活性微生物驅(qū)動的微生物燃料電池在廢水處理、海洋能源開發(fā)、環(huán)境智能監(jiān)測與修復(fù)、生物冶金以及生物計算等多方面展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。隨著電子傳遞機制研究的不斷深入，產(chǎn)電微生物的胞外電子傳遞速率和能量轉(zhuǎn)化效率有望逐漸實現(xiàn)量級突破，這將大大加快以產(chǎn)電微生物為核心的生物智能合成和生物電催化領(lǐng)域工業(yè)化進展，為綠色可持續(xù)性生產(chǎn)新能源或大宗精細化學(xué)品的生產(chǎn)提供新思路。

有機物被產(chǎn)電微生物攝取直至傳遞到電極，僅有約10%的電子能來到電極表面。在胞內(nèi)反應(yīng)過程中電子除了以電流的形式流出細胞，胞內(nèi)反應(yīng)還會消耗大量電子以參與還原態(tài)物質(zhì)的合成、胞內(nèi)能量代謝調(diào)控等過程；在周質(zhì)電子傳遞過程中，復(fù)雜的周質(zhì)氧化還原環(huán)境會分流胞內(nèi)的部分電子，形成周質(zhì)空間“電子逃逸”過程；隨著電子傳遞到細胞外周環(huán)境，電子在不穩(wěn)態(tài)環(huán)境中極容易被環(huán)境中存在的氧氣等氧化態(tài)物質(zhì)消耗造成電子流失。

為此，未來微生物產(chǎn)電系統(tǒng)設(shè)計還可以聚焦于以下方面：（1）依靠代謝工程分析產(chǎn)電細胞的胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)，系統(tǒng)地測繪產(chǎn)電細胞胞內(nèi)氧化還原過程，設(shè)計化學(xué)級聯(lián)效應(yīng)更強的反應(yīng)路徑以提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量；（2）對周質(zhì)空間氧化還原酶進行系統(tǒng)分析，按照對微生物生長的影響和化學(xué)反應(yīng)親和勢判斷周質(zhì)酶對電子的掠奪程度并通過合成生物學(xué)手段對周質(zhì)空間進行清理，使得電子流更多流向與電極相關(guān)聯(lián)的色素蛋白；（3）尋找化工產(chǎn)品代替或修飾電極材料，通過改善產(chǎn)電微生物外周的電化學(xué)性能改變電子在外部環(huán)境的傳遞速率，同時擴充細胞與電極之間的電子通量，大大提升微生物燃料電池的功率輸出；（4）根據(jù)微生物電化學(xué)系統(tǒng)的動量、質(zhì)量傳遞過程設(shè)計電化學(xué)反應(yīng)器，通過反應(yīng)器優(yōu)化縮減反應(yīng)過程中產(chǎn)生的熱力學(xué)、動力學(xué)損失，通過反應(yīng)器結(jié)構(gòu)優(yōu)化加強微生物發(fā)酵過程與產(chǎn)電過程的耦合，保證能量的高密度輸出。