齊娜，宋偉，劉立明，吳靜

（1 江南大學藥學院，江蘇無錫214122； 2 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

引 言

C—C成鍵反應是有機合成中的關鍵反應，一般是在有機催化劑、金屬或酸堿催化劑的作用下進行[1-2]，但面臨著催化劑難以回收、消耗量大且對環(huán)境有害等難題。生物催化劑因具有高選擇性、反應條件溫和及可再生等優(yōu)點，而廣泛應用于制藥、化學合成和食品等工業(yè)領域。近年來，利用酶催化C—C 成鍵反應而生成精細化學品的研究越來越廣泛（表1），如漆酶催化氧化C—C 偶聯(lián)反應生成咔唑、苯并呋喃等化學品[3-4]，角鯊烯環(huán)化酶催化C—C閉環(huán)反應獲得用于香料生產(chǎn)的霍烯、萜類等化合物[5-6]，依賴Pd 的金屬酶Suzukiase 催化合成多烯烴、苯乙烯和聯(lián)苯的衍生物[7]（應用于天然產(chǎn)物、有機材料的生物合成中），醛縮酶催化Aldol 反應生成多羥基化合物是合成碳水化合物和其他天然產(chǎn)物的基石[8]，依賴ThDP 酶催化的Acyloin condensation 反應合成α-羥基酮，廣泛應用于精細化工和制藥行業(yè)[9]，異胡豆苷合酶（STR）和去甲烏藥堿合酶（NCS）催化Pictet-Spengler 反應生成的生物堿具有多種藥理活性[11]。本文主要介紹了近年來研究最為廣泛的酶催化 Aldol、Acyloin condensation、Stetter、Pictet-Spengler 形成C—C 鍵的反應，以及這些反應在合成精細化學品中的應用前景[12-13]。

表1 生物催化C—C成鍵反應及其在合成精細化學品中的應用Table 1 Biocatalytic C—C bond formation reaction and fine chemicals generated at the C—C bond site

1 不對稱羥醛縮合反應

不對稱羥醛縮合反應（Aldol 反應）是指具有α氫原子的醛或酮在一定條件下形成烯醇負離子，再與另外一分子羰基化合物發(fā)生加成反應，從而形成β-羥基羰基化合物的一類生成C—C 鍵的有機反應[14]。該反應主要由醛縮酶催化，根據(jù)羰基活化的方式不同，機制可分為：I 型醛縮酶通過形成一個希夫堿中間體來激活羰基供體；Ⅱ型醛縮酶含有輔因子Zn2+，通過與供體中的羰基和α 羥基形成螯合物，進而生成Aldol 產(chǎn)物。醛縮酶能接受磷酸二羥丙酮（DHAP）、二羥基丙酮（DHA）、丙酮酸、乙醛以及甘氨酸等作為供體底物[12]。但目前工業(yè)上應用最多的是依賴DHAP、DHA和甘氨酸的醛縮酶，可合成稀有或非天然的單糖[15-16]和β-羥基-α-氨基[17]。

依賴磷酸二羥丙酮的醛縮酶：到目前為止，已鑒定出4 種依賴DHAP 的醛縮酶[15]，分別為果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（FruA，EC 4.1.2.3）、巖藻糖-1-磷酸醛縮酶（FucA，EC 4.1.2.1）、塔格糖-1,6-二磷酸醛縮酶（TagA，EC 4.1.2.40）和鼠李糖-1-磷酸醛縮酶（RhaD，EC 4.1.2.19）。其中應用最廣泛的是從兔肌肉中分離的I 型醛縮酶FruA，Iturrate 等[18]通過基因融合技術成功地將FruA 應用于催化立體選擇性C—C 成鍵，反應速率比游離的酶提高了20 倍。巖藻糖-1-磷酸醛縮酶（FucA）和鼠李糖-1-磷酸醛縮酶（RhaD）屬于Ⅱ型醛縮酶，能接受廣泛醛類作為底物，并應用于制備稀有糖[19]（表2），其中FucA 在二甲基甲酰胺(DMF)/H2O(1∶4，體積比)混合物中，催化效率提高2～3 倍，所產(chǎn)生的N-氨基多醇可以通過還原胺化進一步轉化為亞胺基[20]。但依賴于DHAP 醛縮酶主要缺點是對DHAP 嚴格的底物特異性，Sugiyama 等[21]報道了一個體內選擇系統(tǒng)，用于定向進化L-鼠李糖-1-磷酸醛縮酶（RhaD），以改變其底物特異性，即從DAP 到二羥基丙酮（DHA）。Sanchez-Moreno 等[22]建立了一個由來源于大腸桿菌的巖藻糖-1-磷酸醛縮酶（FucA）、來源Citrobacter freundii 的DHA 激酶、雙羥基丙酮激酶（DHAK）等組成的多酶體系，催化廉價的二羥基丙酮（DHA）和ATP，生成相應的酮糖-1-磷酸。

依賴二羥基丙酮的醛縮酶：果糖-6-磷酸醛縮酶（FSA，EC 4.1.2.17）依賴DHA 作為供體底物[23]，同時還可接受如羥基丙酮（HA）、羥基丁酮（HB）、乙醇醛（GO）等非磷酸供體底物[24-25]。為了提高野生型FSA 對較強親核結構底物的耐受性，Gueclue 等[26]通過對FSA 活性口袋與底物結合的關鍵位點進行分析和改造，發(fā)現(xiàn)突變體FSA-L107/L163A 能接受線性/支鏈、C3～C7 1-羥基烷-2-酮及幾種DHA 衍生醚作為供體底物。以D6、T26和N28為靶標，建立了一個突變庫，發(fā)現(xiàn)D6殘基是使非羥化親核試劑具有活性的關鍵殘基，其中突變體D6X 和D6X/T26X 對酮和醛有不同的偏好性[17]。突變體FSA-D6H 能接受乙醇、丙酮、丁酮和環(huán)戊酮等脂肪族親核試劑為底物，合成新的Aldol 產(chǎn)品[27]；突變體FSA-D6Q 催化合成3-羥基-2-甲基丙醛產(chǎn)量能達到72 g·L-1，收率88.5%[28]。最近Yang 等[29]通過對FSA 亞基內與亞基間相互作用的綜合調控，發(fā)現(xiàn)突變體I31T/Q59T/I195Q 能以硫、碳、氧相關的雜芳醛作為底物，且活性提高了27～278 倍。進一步通過X 射線晶體學數(shù)據(jù)和分子動力學模擬，發(fā)現(xiàn)該突變體能夠顯著地改變亞基之間界面區(qū)域的靈活性、擴大底物結合口袋和增強質子轉移。此外，F(xiàn)SA 突變體還廣泛應用于制備醛糖衍生物，如Schmidt 等[30]發(fā)現(xiàn)雙突變體（FSA-A129T/S166G 和FSA-A129T/A165G）和一個三突變體（FSA-A129T/A165G/S166G）可制備幾種脫氧和O 取代的D-己糖。突變體FSA-A129S 根據(jù)供體（DHA 或HA）的不同，可催化硝基丁醛等醛類化合物，生成新的硝基環(huán)醇[31]（圖1）。

依賴甘氨酸的醛縮酶：依賴甘氨酸作為供體底物的醛縮酶包括[32-33]：絲氨酸羥甲基轉移酶（SHMT，EC 2.1.2.1）、L 或D 特異性蘇氨酸醛縮酶（LTA，EC 4.1.2.5 和DTA，EC 4.1.2.42）。來自Arthrobacter sp 的D-蘇氨酸醛縮酶（DTA）[34]和L-蘇氨酸醛縮酶（LTA）[35]除了能接受廣泛醛類作為受體[33]，還可接受甘氨酸以外的氨基酸供體，如丙氨酸、絲氨酸和半胱氨酸，因此其應用范圍也擴大到不對稱合成α,α-二取代的β-羥基-α-氨基酸和β-氨基醇。進一步通過同源序列搜索發(fā)現(xiàn)了5種接受丙氨酸和絲氨酸作為氨基酸供體的新型蘇氨酸醛縮酶[36]，將這5 種酶過量表達于大腸桿菌中，能合成4 種β-羥基-Lα-氨基酸和β-羥基-D-α-氨基酸，且均在α-C 上具有高對映選擇性（ee＞99%）（圖2）。最近Gong 等[37]利用2,4-二硝基苯肼（DNPH）靈敏度高且對底物干擾小的特點，建立了一種快速、可靠測定蘇氨酸醛縮酶對醛和甘氨酸縮合活性的方法，可用于高通量篩選和表征TAs。利用這一方法鑒定出兩個突變體D321C 和N101G，轉化率比野生型菌株分別提高了13.9%和10.4%。來源于Streptococcus thermophilus的依賴于PLP 醛縮酶L-絲氨酸羥甲基轉移酶（SHMTsth）[38]對甘氨酸的羥醛縮合反應具有良好的立體選擇性。在對該酶的結構、催化相關的活性位點殘基以及催化機理研究的基礎上[39]進行定向突變，發(fā)現(xiàn)突變體Y55T 可將D-Ser 加成到各種醛類中，從而高效、高對映和非對映選擇性合成α,α-二取代β-羥基-α-氨基酸[40]（圖2）。

表2 依賴DHAP醛縮酶綠色合成稀有糖及其衍生物Table 2 Green synthesis of rare sugars and their derivatives by DHAP aldolase

2 酮醇縮合反應

圖1 FSA催化C—C鍵形成多羥基化合物Fig.1 FSA catalyzes C—C bonds to form polyhydroxy compounds

酮醇縮合反應（Acyloin condensation）是C—C成鍵的常見反應，由ThDP 依賴的酶如環(huán)己烷-1,2-二酮水解酶（CDH）、苯甲醛裂解酶（BAL）、黃素酶（YerE）、乙酰丙酮合成酶（AAS）和羥基丙酮∶二氯苯酚氧化還原酶（AO∶DCPIP OR）所催化。催化過程中的關鍵步驟是底物與輔因子ThDP 的噻唑環(huán)發(fā)生反應，產(chǎn)生活性的中間體“活化的醛”，進而生成α-羥基酮[41]。

環(huán)己烷-1,2-二酮水解酶（CDH，EC 3.7.1.11）：CDH 催化丙酮酸和一系列芳香受體醛的酮醇縮合反應，從而將苯甲醛衍生物轉化為高度對映體富集的（R）-PAC[42-43]。在2014 年，Loschonsky 等[44]發(fā)現(xiàn)CDH 能轉化羥基苯甲醛、硝基苯醛和萘醛，生成仲-α-羥基酮具有＞99%轉化率和92%～99% ee 值。隨后在半制備規(guī)模上，將4-（叔丁基）苯甲醛和2-萘醛以較高的轉化率轉化為相應的α-羥基酮產(chǎn)品（圖3）。對CDH 進行蛋白質工程改造獲得突變體H28A/N484A 能夠在丙酮酸和環(huán)己烷-2,3-二酮之間形成C—C 鍵，生成環(huán)叔-α-羥基酮（ee 值高達88%），且該突變體除了接受丙酮酸作為底物，還可接受2,3-丁酮為底物，但活性較弱[45]。隨后進一步發(fā)現(xiàn)CDH 可通過3 種途徑：丙酮酸、乙醛或丙酮酸與乙醛的酮醇縮合反應來催化形成（S）-乙酰丙酮，對映選擇性高達95%ee[46]。

苯 甲 醛 裂 解 酶（BAL，EC 6.2.1.7）：來 源 于Pseudomonas fluorescens的BAL能將芳香醛轉化為手性α-羥基酮[47-48]。研究發(fā)現(xiàn)當以苯甲醛作為供體，（±）-2-甲基丙醛、（±）-2-甲基丁醛和（±）-2-甲基戊醛作為受體底物，可合成具有良好對映選擇性的仲-α-羥基酮產(chǎn)物，且非對映選擇性隨著受體醛化合物的鏈長增加而增加[49]（圖3）。然而，在級聯(lián)反應中，利用來源于Hansenula sp 的氧化酶和過氧化氫酶將脂肪族醇制備成相應的醛，BAL 可以短鏈脂肪族醇（甲醇到丁醇）作為底物催化合成C—C 鍵，生成光學純的2-羥基丙酚和類似物（ee 值為98%～99%）[50]。

圖2 蘇氨酸醛縮酶催化形成的β-羥基-α-氨基化合物Fig.2 Synthesis of β-hydroxy-α-amino compounds catalyzed by threonine aldolase

圖3 ThDP依賴的酶催化酮醇縮合反應合成仲-α-羥基酮化合物Fig.3 ThDP-dependent enzymes catalyze the ketol condensation reaction to form secondary-α-hydroxyketone

黃素酶（YerE，EC 3.5.99.1）：來源于Pseudomonas protegens的YerE能以環(huán)酮、開環(huán)酮、1,2-二酮、α-酮和β-酮酯作為受體底物合成叔-α-羥基酮[51]（圖4）。隨后利用振動圓二色譜（VCD）對YerE的立體選擇性進行研究[52]，發(fā)現(xiàn)該酶可將（R）-3-甲基環(huán)己酮轉化為（R,R）構型的叔醇，相應的（S）構型轉化為（S,S）結構的產(chǎn)物（圖4）。為了進一步擴寬該酶的底物范圍，Hampel等[53]研究了來源于Pseudomonas protegens分辨率為1.55 ?（1?=0.1 nm）的YerE 晶體結構，并與來源于Yersinia pseudotuberculosis 的YerE進行對比分析，發(fā)現(xiàn)兩種YerE在其活性位點具有相同的氨基酸殘基，并具有非常相似的底物范圍和催化活性，可將苯甲醛及其衍生物和酮轉化為2-羥基酮。根據(jù)獲得的晶體結構，對YerE的三維結構以及活性位點進行分析，發(fā)現(xiàn)一個潛在的反平行底物結合口袋（S口袋）被氨基酸側鏈阻斷，而通過V479A的突變可使產(chǎn)物羥基戊酮和羥庚醇的S對映體分別提高到57%ee和31%ee。

乙酰丙酮合成酶（AAS）/羥基丙酮∶二氯苯酚氧化 還 原 酶（AO∶DCPIP OR）：來 源 于Bacillus stearothermophilus 的AAS 可催化二烷基或烷基芳基-1,2-二酮的縮合反應生成叔-α-羥基酮，產(chǎn)率達到62%，ee 值為91%[54]。研究表明，AAS 是一種誘導酶，需要低濃度糖和高濃度乙酰丙酮才能表達[55]。將AAS 和依賴于NADH 的乙酰丙酮還原酶（AAR）進行級聯(lián)反應，獲得中間產(chǎn)物α-烷基-α-羥基-β-二酮的產(chǎn)率是30%～60%，ee 值為67%～90%，隨后將其還原為ee ＞95%的α-烷基-α-羥基-β-二羥基酮化合物，相應的產(chǎn)率是60%～70%[56]。將這兩種酶結合使用還可以合成手性綠茶香料化合物3-羥基-3-甲 基 壬 烷-2, 4- 二 酮（ee ＞95%）[52]。 2015 年Bernacchia課題組[57]發(fā)現(xiàn)來源于Bacillus licheniformis的AO:DCPIP OR 與AAS 催化的酮醇縮合反應在產(chǎn)物組成和對映體選擇性方面表現(xiàn)出顯著的相似性，這表明它們可能是同一種酶。在E.coli中過量表達AO:DCPIP OR，將甲基乙酰丙酮作為乙酰負離子供體，與一系列酮結合使用，可生成與其他ThDP 依賴酶相反的立體化學所需的叔醇[58]。此外，該酶還能催化芳香反應物和混合芳香或脂肪的苯甲?？s合反應，將4-羥基-4-甲基己烷-3-酮用作活化丙酮的前體，甲基乙酰丙酮作為活化的乙醛供體生成叔醇[59]（圖5）。

酶催化酮醇縮合反應在C—C 鍵形成位點生成的α-羥基酮是一種普遍存在的結構，廣泛應用于抗真菌藥（醋酸地塞米松）、抗腫瘤抗生素（Olivomycin A）或法尼基轉移酶抑制劑（治療丁型肝炎）或淀粉-β-蛋白（治療阿爾茨海默氏病）。α-羥基酮的高效合成一直都是醫(yī)藥工業(yè)的重要研究熱點。

圖4 YerE催化C—C鍵的形成用于制備叔-α-羥基酮Fig.4 YerE catalyzes the formation of C—C bonds for the preparation of tertiary-α-hydroxy ketones

圖5 AO:DCPIP使用2,3-丁二酮作為乙酰陰離子供體催化生成叔醇Fig.5 AO:DCPIP uses 2,3-butanedione as an acetyl anion donor to catalyze the formation of tertiary alcohols

3 Stetter 反 應 催 化C—C 成 鍵 形 成1，4-二羰基化合物

Stetter 反應是指能被ThDP 依賴性酶催化α,β-不飽和酮進行的1,4-加成反應并產(chǎn)生相應的1,4-二羰基化合物[13]，該反應是氰基負離子或噻唑負離子對羰基進行加成，使親電性的羰基碳轉化為親核性，隨后進攻α,β-不飽和酮得到1,4-二酮、γ-酮酸等化合物[60]。能催化Stetter 反應的酶主要有：PigD酶和MenD酶。

碳連接酶（PigD，EC 2.2.1.5）：來源于Serratia marcescens 的PigD 酶是第一個被發(fā)現(xiàn)可進行1,4-加成反應的酶[61]，能以酮為底物代替1,2-加成反應中的受體醛，通過降低羰基活性，得到1,4-加成反應的產(chǎn)物[62]。隨后，基于PigD 酶的氨基酸序列進行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)來源于Saccharopolyspora erythraea 的SeAAS和Hahella chejuensis的HapD 也可進行1,4-加成反應，且具有較高的對映體選擇性，但缺點是這兩個酶的可溶性表達有待進一步提高[63]。隨后Kasparyan 等[64]在大腸桿菌中對這兩種酶進行了異源表達，在基因GroEL/ES 的共同表達下可提高可溶性蛋白量。

圖6 ThDP依賴的酶催化α,β-不飽和酮生成1,4-二羰基化合物Fig.6 ThDP-dependent enzymes catalyze α,β-unsaturated ketones to produce 1,4-dicarbonyl compounds

2-琥珀?；?5-烯醇丙酮基-6-羥基-3-環(huán)己烯-1-羧酸合酶（MenD）：來自大腸桿菌的MenD 能在其天然底物異硬脂酸酯中進行酯型α-酮戊二酸酯（α-KG）的加成反應[65]，這是首次觀察到利用β-取代的α,β-不飽和酸的1,4-加成反應，然而這個反應僅限于底物為（2S,3R）-2,3-二羥基-2,3-二氫苯甲酸酯及其羧甲基醚衍生物。隨后利用MenD 酶催化各種芳族醛的1,2-加成反應，從而獲得了δ-羥基-γ-酮酸。此研究表明MenD 對α-酮戊二酸底物具有較高的特異性，但是在1,2-加成反應中醛受體底物的范圍則較廣泛[10]。在對MenD 酶的底物譜分析表明，該酶確實可催化Stetter-型反應，能將α-KG、丙烯酸酯和丙烯腈轉化為γ-酮酸，且具有較高的轉化率（71%～99%）[63]（圖6）。而在醛縮酶和依賴于ThDP 的酶結合使用的級聯(lián)反應中發(fā)現(xiàn)丙酮酸依賴的醛縮酶（2-氧-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖苷酶EDA）生成的（S）-HOG 可以作為MenD 的底物，可與2,3-反式CHD、1,2-芳香醛和脂肪醛發(fā)生Stetter 加成反應，這為生成1,4-二羰基的化合物提供了一種新的方法[66]。

通過上述兩種酶催化Stetter 反應形成的1,4-二酮、γ-酮酸化合物在天然產(chǎn)物、藥物和新型材料合成中發(fā)揮著關鍵作用，但由于該酶的底物范圍狹窄、穩(wěn)定性差，使得利用Stetter反應的可持續(xù)生產(chǎn)路線的開發(fā)成為了制藥和精細化工行業(yè)的重大挑戰(zhàn)。

4 Pictet-Spengler反應

Pictet-Spengler 反應是獲得重要藥物骨架β-咔啉和四氫異喹啉的重要途徑，包括兩個步驟：第一步是在酸催化的條件下形成亞胺中間體；第二步是發(fā)生Mannich 型親電芳香族取代反應，進而生成β-咔啉和四氫異喹啉產(chǎn)物[67-68]。β-咔啉骨架具有很強生物活性的吲哚生物堿，是苯二氮卓類藥物受體眾多激動劑和反激動劑的組成部分，廣泛應用于治療抑郁癥和焦慮癥[69]；四氫異喹啉是治療哮喘的β2-腎上腺素受體激動劑，同時還具有抗血小板和抗血栓形成的活性[70]。催化Pictet-Spengler 反應的酶主要有異胡豆苷合酶（STR）、McbB 酶和去甲烏藥堿合酶（NCS）。

異胡豆苷合酶（STR，EC 4.3.3.2）：最早鑒定出催化Pictet-Spengler 反應的酶是來源于Rauvolfia serpentina 的異胡豆苷合酶（STR）[71]，該酶催化天然底物色胺和醛類化合物縮合形成（S）-異胡豆苷[圖7(a)]。該酶除了以段馬錢子苷衍生物作為醛底物，還可以各種取代的色氨酸衍生物為底物。然而，最近發(fā)現(xiàn)來自Ophiorrhiza pumila 的STR 可以接受非手性短鏈的醛作為底物，產(chǎn)生與天然底物段馬錢子苷相反的（R）-構型的產(chǎn)物，但活性較低[圖7(b)][72]。其反向結合導致立體化學偏好性轉換的根源在于底物位置的轉換，同一酶對一種底物可具有兩種不同結合模式，最終導致產(chǎn)物相反的絕對構型[73]。而在2016 年Fischereder 等[74]利用來源于Arthrobacter sp和Silibacter pomeroyi 的ω-轉氨酶同時進行酮的胺化和色氨酸與斷馬錢子苷的縮合反應，在四氫-β-咔啉中心C3 處形成具有另外一個立體異構中心的（R）-異胡豆苷衍生物（產(chǎn)率高達98%，ee 值為98%。）。隨后通過建立六葉螺旋槳蛋白環(huán)狀排列的突變體庫，對來源于Rauvolfia serpentina STR 活性位點的兩個區(qū)域氨基酸殘基進行分析和改造，發(fā)現(xiàn)該酶在不損失其整體結構的情況下，產(chǎn)生的幾個活性突變體（H307A、D273A 和E309G）對天然底物具有較高活性[75]。

圖7 異胡豆苷合酶催化的Pictet-Spengler反應Fig.7 Pictet-Spengler reaction catalyzed by strictosidine synthase

McbB酶：來源于Marinactinospora thermotolerans的McbB 酶能催化L-色氨酸和草酰乙醛的Pictet-Spengler反應[76]，再經(jīng)過氧化和脫羧得到β-咔啉結構。同時研究發(fā)現(xiàn)該酶還能以5-甲基-D/L-色氨酸、7-甲基-D/L-色氨酸及其短鏈的脂肪醛作為底物。

去甲烏藥堿合酶（NCS，EC 4.2.1.78）：NCS 通過建立新C—C 鍵催化生成芐基四氫異喹啉生物堿中間體[77-78]，2010 年，Bonamore 等[79]以廉價的酪氨酸和多巴胺作為底物，在一鍋兩步的反應中，獲得高產(chǎn)率和高純度的對映異構體（S）-去甲氯氨酸。隨后通過NCS 與轉氨酶結合，采用級聯(lián)反應的方式獲得了高純度的（S）-芐基異喹啉生物堿[80]。對酶底物譜進行研究，發(fā)現(xiàn)來源于Thalictrum flavum（TfNCS）和Coptis japonica（CjNCS2）的NCS 能轉化苯乙醛衍生物，其中CjNCS2 能以線性脂肪族醛以及α-取代的烷基為底物，TfNCS 則能以萘-1-基乙醛等為底物[81]。盡管NCS 對各種醛類底物具有廣泛的耐受性，但最新研究表明，未活化的酮也可作為NCS 的底物，如Lichman 等[82]發(fā)現(xiàn)TfNCS 能以4-羥基苯丙酮為底物合成1,1′- THIQ，而通過對NCS 的作用機理以及與天然醛底物的對接研究，發(fā)現(xiàn)突變體M97F/L/V通過擴大酶與底物的結合口袋，接受苯丙酮、環(huán)己酮和4-甲基取代的環(huán)己酮作為底物。而突變體L76A/V、A79F/I 則通過增加體積較大的疏水底物（4-叔丁基和4-苯基取代的環(huán)己酮）與酶的親和力，進而合成相應的產(chǎn)物，其中突變體A79F/I 對酮底物親和性最大，相應的產(chǎn)物1,1′-雙取代的THIQ 產(chǎn)率能達到74%～99%（圖8）。

總而言之，Pictete-Spenglerases 是有價值的生物催化劑，可以在溫和的反應條件下以立體選擇性和區(qū)域選擇性的方式進行C—C 成鍵反應。但目前只有上述兩種酶STR 和NCS 被廣泛地應用于合成β-咔啉和四氫異喹啉等生物堿，McbB 酶因分離方法困難和酶穩(wěn)定性差而限制了實際應用。因此，擴大Pictete-Spenglerases 的范圍以及提高酶的穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)中的熱點問題。

5 總結與展望

圖8 NCS-Tf突變體催化合成1,1′-雙取代的THIQFig.8 NCS-Tf mutant catalyzed synthesis of 1,1′-disubstituted THIQ

近年來，生物催化C—C 成鍵反應在有機合成中取得了巨大的進步[83]，除了本綜述介紹的研究最為廣泛的醛縮酶催化的不對稱羥醛縮合反應、CDH和YerE 等催化的酮醇縮合反應、PigD 和Mend 催化的Stetter 反應以及STR 和NCS 催化的Pictet-Spengler 反應的研究外，一些具有潛在應用價值的酶也逐漸被發(fā)現(xiàn)，如漆酶催化的氧化C—C 偶聯(lián)反應、角鯊烯環(huán)化酶催化的C—C 閉環(huán)反應和金屬酶Suzukiase 催化的Suzuki-Miyaura 反應，這些反應會在C—C 鍵位點形成咔唑、苯并呋喃、霍烯、苯乙烯和聯(lián)苯的衍生物等精細化學品。但是，目前大多數(shù)催化C—C 成鍵反應的研究僅限于擴大酶的底物范圍以及提高酶的立體選擇性，還無法實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。因此，為了擴大其作為工業(yè)產(chǎn)品的潛力，今后的研究應該集中在提高酶的催化效率、反應的設計和工藝優(yōu)化等方面，為此，需要從酶結構、酶活性位點以及催化機理入手，通過蛋白質工程設計或定向進化來提高酶的催化效率、立體選擇性以及對催化環(huán)境的耐受性。此外，還可從分子水平來提高酶的利用率減少催化劑的用量，如優(yōu)化拷貝數(shù)、載體以及核糖體結合位點（RBS）。采用一種綠色、經(jīng)濟以及實用的反應路線是實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)必不可少的一步，可以采用級聯(lián)反應避免試劑昂貴、多步制備路線等缺點，通過對生物轉化的設計，從工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)更多的精細化學品。