陳冬燕 王賀 張燦 郭建新 李明新

干眼是由多種因素引起的淚膜和眼表疾病，包括眼表不適癥狀、視力變化和淚膜不穩(wěn)定，并常常伴有潛在的眼表?yè)p傷、淚液滲透壓升高和眼表炎癥[1-2],常見(jiàn)的癥狀有干澀、疲勞、瘙癢感、異物感、灼痛、畏光和對(duì)外界刺激的敏感性增加等。有時(shí)由于缺乏基礎(chǔ)淚液，過(guò)度的眼干燥刺激反射性淚液分泌，導(dǎo)致頻繁流淚，甚至出現(xiàn)眼紅、充血和角質(zhì)化。隨著角膜上皮剝脫和炎癥的發(fā)展，可導(dǎo)致角膜結(jié)膜化、鱗狀上皮化生和新生血管長(zhǎng)入，進(jìn)而影響視力。

在過(guò)去十年中，玻璃體內(nèi)注射藥物成為治療濕性老年性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變合并黃斑水腫等幾種常見(jiàn)眼科疾病的首選方法[3-4]。這些患者往往需要頻繁的玻璃體內(nèi)給藥操作，為減少感染性眼內(nèi)炎的風(fēng)險(xiǎn)，每次注射前都必須對(duì)眼表進(jìn)行無(wú)菌處理，目前國(guó)內(nèi)外幾乎所有的玻璃體內(nèi)注藥操作指南均推薦使用聚維酮碘進(jìn)行手術(shù)區(qū)域的消毒[5-6]。然而我們前期研究表明，聚維酮碘本身會(huì)對(duì)角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生不利影響[7]。Saedon等[8]對(duì)玻璃體內(nèi)注藥后的患者進(jìn)行流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，術(shù)前應(yīng)用聚維酮碘會(huì)導(dǎo)致眼部不適、淚液滲透壓增加及角膜熒光素染色陽(yáng)性，提示出現(xiàn)類似干眼的臨床表現(xiàn)。高頻度的聚維酮碘使用是否會(huì)導(dǎo)致顯著的眼表和淚膜穩(wěn)定性損傷，以及這種損傷的嚴(yán)重程度尚未被深入研究。因此，本研究首次探討了局部滴用10 g·L-1聚維酮碘對(duì)大鼠眼表結(jié)構(gòu)和淚膜穩(wěn)定性的影響，為臨床反復(fù)使用聚維酮碘致患者眼表?yè)p害的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取30只SD雄性大鼠(SPF級(jí)，6～ 8周齡，體質(zhì)量160～180 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。使用裂隙燈顯微鏡檢查大鼠眼前節(jié)無(wú)異常。整個(gè)研究中30只大鼠均置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)[9]：室溫25 ℃±1 ℃，濕度60%±10%，以及交替的12 h明暗周期(早上8點(diǎn)到晚上8點(diǎn))。本研究所涉及的全部研究方法均遵循《赫爾辛基宣言》，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合ARVO關(guān)于動(dòng)物眼科和視覺(jué)研究的相關(guān)規(guī)定，同時(shí)獲得了徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為XYFY201-KL033-07。

1.2 方法30只大鼠左眼作為對(duì)照眼為A組，右眼作為實(shí)驗(yàn)眼為B組。A組使用生理鹽水滴眼，B組使用10 g·L-1聚維酮碘滴眼，均為每天2次。分別在干預(yù)前和干預(yù)后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d 觀察兩組大鼠眼的淚膜破裂時(shí)間(BUT)、淚液分泌量、角膜熒光素染色評(píng)分和炎癥指數(shù)評(píng)分，并于干預(yù)后14 d進(jìn)行角膜共聚焦顯微鏡(HRTⅢ 德國(guó)海德堡公司)檢查，隨后腹腔注射過(guò)量水合氯醛處死大鼠，摘取眼球行組織病理學(xué)檢查。

1.2.1 淚液分泌量檢測(cè)所有大鼠均由同一操作者在相同時(shí)間(晚上9點(diǎn))、相同地點(diǎn)、相同的照明強(qiáng)度和溫度、濕度環(huán)境下測(cè)量大鼠基礎(chǔ)淚液分泌量。固定大鼠頭部后，將下眼瞼輕輕拉下，露出結(jié)膜囊。將酚紅棉線(天津晶明)彎曲5 mm至末端，并置于下瞼中外1/3結(jié)膜囊處。15 s后，取出棉線，并測(cè)量淚液浸潤(rùn)的紅色部分的長(zhǎng)度。每眼重復(fù)測(cè)量3次取平均值。

1.2.2 BUT檢測(cè)5 μL的1 g·L-1熒光素鈉滴至大鼠結(jié)膜囊內(nèi)，使其瞬目，瞬目后熒光素均勻涂布于角膜表面，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察角膜染色區(qū)出現(xiàn)第一個(gè)黑斑(破裂點(diǎn))的時(shí)間，記錄3次取平均值，即為BUT。

1.2.3 角膜熒光素染色評(píng)分參考Pauly等[10]報(bào)道的方法，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察各組大鼠角膜上皮缺損的位置及范圍。角膜熒光素染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：沒(méi)有染色；1分：輕微的點(diǎn)狀著染，少于30個(gè)點(diǎn)；2分：點(diǎn)狀著染≥30個(gè)點(diǎn)，但沒(méi)有成片；3分：嚴(yán)重彌漫性染色，但沒(méi)有斑塊；4分：有熒光素斑塊。

1.2.4 炎癥指數(shù)評(píng)分干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)裂隙燈觀察各組大鼠眼部炎癥反應(yīng)，并評(píng)估炎癥指數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)如下：睫狀充血(0分：不存在；1分：小于1 mm；2分：1～2 mm；3分：大于2 mm)；中央角膜水腫(0分：不存在；1分：存在可見(jiàn)的虹膜細(xì)節(jié)；2分：存在而沒(méi)有可見(jiàn)的虹膜細(xì)節(jié)；3分：存在而無(wú)法窺見(jiàn)瞳孔)；周圍角膜水腫(0分：不存在；1分：可見(jiàn)虹膜細(xì)節(jié)；2分：虹膜細(xì)節(jié)不可見(jiàn)；3分：無(wú)法窺見(jiàn)虹膜)，以上參數(shù)的得分之和除以9分即為炎癥指數(shù)。

1.2.5 角膜共聚焦顯微鏡檢查所有檢查均由同一操作者進(jìn)行。大鼠使用100 g·L-1水合氯醛按照2 mL·kg-1體質(zhì)量腹腔注射麻醉。水浸式物鏡表面加 2 g·L-1卡波姆眼用凝膠(美國(guó)BAUSCH &LOMB公司)，一名操作者持大鼠頭部使其固定于顯微鏡前,分開(kāi)眼瞼使角膜正對(duì)物鏡中央，另一名操作者移動(dòng)物鏡使其與角膜中央接近,選擇半自動(dòng)掃描，待見(jiàn)至內(nèi)皮層時(shí)按下記錄鍵,則角膜各層的掃描圖像被自動(dòng)記錄下來(lái)并存盤(pán)。使用軟件自帶的細(xì)胞計(jì)數(shù)模塊手動(dòng)對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度進(jìn)行分析。

1.2.6 組織病理學(xué)檢查于干預(yù)14 d后腹腔注射過(guò)量水合氯醛處死所有大鼠，摘除雙眼眼球，40 g·L-1多聚甲醛固定過(guò)夜，常規(guī)石蠟包埋、切片行組織病理學(xué)檢查：所有結(jié)膜均行PAS染色觀察杯狀細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)；隨機(jī)選取兩組各4只角膜行HE染色觀察各層組織結(jié)構(gòu)，兩組剩余角膜均行PMN/ED1雙重免疫組織化學(xué)染色觀察中性粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在組織層間的浸潤(rùn)情況。PMN/ED1雙重免疫組織化學(xué)染色參照文獻(xiàn)[11] 進(jìn)行，角膜組織切片常規(guī)脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)10%血清封閉1 h，隨后與PMN一抗(14000，F(xiàn)itzgerald公司，英國(guó))、ED1一抗(1200，AbD Serotec公司，英國(guó))一起孵育，使用不含任何一抗的PBS作為陰性對(duì)照。4 ℃濕房中過(guò)夜。將樣品置于常溫下復(fù)溫20 min后，傾去一抗，PBS浸洗3次，隨后加入堿性磷酸酶免疫復(fù)合物二抗(1500，F(xiàn)itzgerald公司，英國(guó))孵育2 h，傾去二抗，PBS浸洗3次，每次5 min。加AP-Fast Red工作液，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)明顯的紅色顯色反應(yīng)時(shí)，PBS沖洗終止顯色反應(yīng)，隨后加入過(guò)氧化物酶免疫復(fù)合物二抗(1500，F(xiàn)itzgerald公司，英國(guó))孵育2 h，傾去二抗，PBS浸洗3次，每次5 min。加DAB工作液，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)明顯的棕色反應(yīng)時(shí)，PBS沖洗終止顯色反應(yīng)。使用封片液(甘油與PBS等容積混合)封片，顯微照相系統(tǒng)下觀察，并拍照儲(chǔ)存。

2 結(jié)果

2.1 裂隙燈檢查及角膜熒光素染色結(jié)果裂隙燈檢查結(jié)果顯示，A組使用生理鹽水滴眼14 d后，角膜透明、上皮完整，熒光素染色陰性；B組使用10 g·L-1聚維酮碘滴眼14 d后，角膜欠透明、上皮粗糙，熒光素染色陽(yáng)性，呈點(diǎn)片狀著染(圖1)。

圖1 兩組大鼠裂隙燈檢查及角膜熒光素染色結(jié)果

2.2 各評(píng)價(jià)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 BUT干預(yù)前，A組與B組間BUT相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后2 d，B組即可觀察到BUT縮短，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，B組BUT降低趨勢(shì)更加明顯。干預(yù)后6 d、8 d、10 d、12 d、14 d，A、B兩組間BUT相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見(jiàn)圖2A)。

2.2.2 淚液分泌量A組與B組干預(yù)前和干預(yù)后2 d、4 d淚液分泌量相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05),B組干預(yù)后淚液分泌量較干預(yù)前明顯減少。干預(yù)后6 d、8 d、10 d、12 d、14 d，A、B兩組間淚液分泌量相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見(jiàn)圖2B)。

2.2.3 角膜熒光素染色評(píng)分A組干預(yù)前及干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)角膜熒光素染色均為陰性。B組干預(yù)前角膜熒光素染色陰性，但干預(yù)后2 d即可觀察到角膜點(diǎn)狀著染，隨時(shí)間延長(zhǎng)，B組角膜熒光素著染區(qū)域逐漸增加，并融合成片，提示較為嚴(yán)重的角膜上皮損傷。干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)A、B兩組間角膜熒光素染色評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05) (見(jiàn)圖2C)。

2.2.4 炎癥指數(shù)與A組相比，B組在干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)的眼部炎癥指數(shù)均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見(jiàn)圖2D)。B組以睫狀充血為主，在干預(yù)后期甚至出現(xiàn)輕度的角膜水腫，可能與角膜上皮損傷和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，提示聚維酮碘局部滴眼可導(dǎo)致角結(jié)膜組織的炎癥反應(yīng)。

圖2 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)各臨床指標(biāo)的對(duì)比 A：BUT；B：淚液分泌量；C：角膜熒光素染色評(píng)分；D：炎癥指數(shù)。注：與A組相比，*P<0.05。

2.3 角膜共聚焦顯微鏡檢查共聚焦顯微鏡下觀察顯示，與A組相比，B組角膜上皮層可見(jiàn)少量高反光炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，基質(zhì)層亦可見(jiàn)炎癥細(xì)胞聚集，基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，提示可能出現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞活化；兩組角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)大致相同(圖3)。

圖3 共聚焦顯微鏡觀察兩組角膜組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)(×800)

2.4 組織病理學(xué)檢查結(jié)果角膜HE染色結(jié)果顯示，A組角膜上皮由排列整齊的4～6層上皮細(xì)胞構(gòu)成；B組角膜上皮細(xì)胞層數(shù)增多，上皮厚度增加，基底細(xì)胞呈現(xiàn)“空泡樣”結(jié)構(gòu)，角膜厚度稍有增加，角膜表面欠光滑。結(jié)膜PAS染色結(jié)果顯示，與A組相比，B組PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著降低，結(jié)膜上皮增厚，細(xì)胞層數(shù)增加，提示聚維酮碘局部滴眼可影響?zhàn)さ鞍椎暮铣膳c分泌，結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著降低。PMN/ED1雙重免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，A組無(wú)PMN/ED1染色陽(yáng)性細(xì)胞；而B(niǎo)組角膜上皮細(xì)胞層間可見(jiàn)少量PMN染色陽(yáng)性細(xì)胞，基質(zhì)層，尤其是淺層基質(zhì)，可見(jiàn)大量PMN/ED1染色陽(yáng)性細(xì)胞，提示聚維酮碘局部滴眼可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞聚集，導(dǎo)致明顯的角膜炎癥反應(yīng)(圖4)。

圖4 兩組組織病理學(xué)檢查結(jié)果

3 討論

近年來(lái)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，隨著生活習(xí)慣和工作環(huán)境的改變，人們干眼的患病率逐年升高，全球各年齡段的患病率為5%～35%[12]。干眼的病因眾多，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，建立理想、穩(wěn)定的動(dòng)物模型是研究干眼病理生理變化進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療的基礎(chǔ)?，F(xiàn)有的干眼動(dòng)物模型主要包括淚腺摘除[13]、降低周圍環(huán)境濕度[14]、使用阿托品類藥物[15]、局部滴用苯扎氯銨[16]或大氣顆粒物[17]等，然而，人類干眼的病理變化并沒(méi)有被精確再現(xiàn)，尤其缺乏符合臨床特征的干眼動(dòng)物模型。本研究使用10 g·L-1聚維酮碘成功誘導(dǎo)了蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼模型，該模型制作簡(jiǎn)便、性質(zhì)穩(wěn)定，可作為研究眼表炎癥的理想平臺(tái)。

聚維酮碘是臨床上使用最為廣泛的皮膚黏膜消毒劑之一[18]。為了預(yù)防眼內(nèi)炎的發(fā)生，晶狀體超聲乳化術(shù)、玻璃體切割術(shù)、青光眼濾過(guò)性手術(shù)等內(nèi)眼手術(shù)術(shù)前均常規(guī)使用聚維酮碘消毒[19]，尤其是玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物前使用聚維酮碘進(jìn)行結(jié)膜囊消毒已被寫(xiě)入多部指南和專家共識(shí)。一項(xiàng)使用濃度為6 g·L-1聚維酮碘局部滴眼治療腺病毒性結(jié)膜炎的臨床研究順利通過(guò)Ⅱ期臨床試驗(yàn)[20]?？梢?jiàn)，聚維酮碘的廣譜抗菌性和安全性得到了大多數(shù)臨床醫(yī)師的認(rèn)可。然而，多篇臨床報(bào)道指出，聚維酮碘本身具有眼表毒性，局部滴用聚維酮碘有引起結(jié)膜充血、角膜上皮剝脫甚至角膜炎的危險(xiǎn)[21-22]。蔣勁等[23]觀察使用不同濃度聚維酮碘兔結(jié)膜囊內(nèi)一次滴眼對(duì)角膜的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度(5 g·L-1)聚維酮碘未出現(xiàn)角膜毒性，而聚維酮碘原液(50 g·L-1)可引起嚴(yán)重的角膜上皮損傷并產(chǎn)生較重的角膜刺激癥狀。Lee等[24]采用國(guó)際通用的檢測(cè)某種化學(xué)物質(zhì)是否會(huì)導(dǎo)致角膜損傷的方法——牛角膜混濁和通透性實(shí)驗(yàn)，通過(guò)配置不同濃度的溶液處理牛角膜以評(píng)價(jià)聚維酮碘的安全性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚維酮碘對(duì)角膜組織的損傷隨濃度增加而加劇，濃度為10 g·L-1的聚維酮碘使用后，角膜熒光素染色評(píng)分幾乎與陽(yáng)性對(duì)照(純丙酮)相當(dāng)。反復(fù)多次使用聚維酮碘(尤其是多次玻璃體內(nèi)注射時(shí))導(dǎo)致的眼表不良反應(yīng)近年來(lái)越來(lái)越多地引起臨床工作者的重視，眼表?yè)p傷的嚴(yán)重程度、藥物劑量與損傷的關(guān)系、脫離接觸后損傷能否完全恢復(fù)等一系列問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究。

有關(guān)聚維酮碘所致眼表改變的病理生理機(jī)制目前知之甚少。Shibata等[25]觀察聚維酮碘對(duì)培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞的影響，提出聚維酮碘引起角膜上皮細(xì)胞損傷的主要原因在于游離碘的直接損傷、溶液中的低pH值以及聚桂醇表面活性劑的細(xì)胞毒性。我們?cè)谇捌谘芯恐衃7]使用不同濃度聚維酮碘結(jié)膜囊內(nèi)一次滴眼觀察對(duì)大鼠角膜的影響，滴眼后12 h摘出眼球行組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)濃度為10 g·L-1的聚維酮碘處理組的角膜出現(xiàn)少量上皮細(xì)胞脫落；濃度為50 g·L-1的聚維酮碘處理組的中央角膜上皮細(xì)胞全層缺失，基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯下降，TUNEL檢測(cè)提示角膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞凋亡，提示細(xì)胞凋亡可能在聚維酮碘所致眼表?yè)p傷中發(fā)揮作用。本研究使用10 g·L-1聚維酮碘局部滴眼建立干眼模型，角膜共聚焦顯微鏡檢查及角膜組織切片均發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示炎癥可能在聚維酮碘引起的眼表?yè)p傷中發(fā)揮重要作用。炎癥與干眼互為因果，相互促進(jìn)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)通常是眼表?yè)p傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可能導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞凋亡以及鱗狀上皮化生[26]，慢性或嚴(yán)重炎癥也可能降低杯狀細(xì)胞的數(shù)量，這會(huì)惡化聚維酮碘誘導(dǎo)的眼表?yè)p傷，包括角膜染色評(píng)分增加和結(jié)膜PAS染色陽(yáng)性的杯狀細(xì)胞數(shù)量減少。干眼的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種炎癥細(xì)胞和炎癥因子在干眼的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同的作用，我們接下來(lái)進(jìn)行的分子生物學(xué)研究將為揭示模型的具體病理生理機(jī)制提供有力的支持。

我們前期研究(5 g·L-1聚維酮碘結(jié)膜囊滴眼，一天2次，共滴眼14 d)發(fā)現(xiàn)，低濃度的聚維酮碘不會(huì)引起明顯的淚膜穩(wěn)定性變化，而臨床常用的聚維酮碘原液(濃度為50 g·L-1)對(duì)角膜組織刺激性太大，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示每天2次滴眼后SD大鼠角膜很快出現(xiàn)上皮剝脫和水腫，滴眼3 d后即可觀察到角膜新生血管長(zhǎng)入。因此，本研究我們選擇10 g·L-1作為聚維酮碘的最佳滴眼液濃度誘發(fā)干眼。在將來(lái)的眼表毒性研究中，研究不同濃度聚維酮碘引起的眼表改變將是有趣的課題。除此之外，干眼是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，淚膜穩(wěn)態(tài)的失衡往往是多重因素共同作用的結(jié)果，在聚維酮碘誘導(dǎo)的干眼模型中，是否有氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬、神經(jīng)損傷等機(jī)制參與尚不得而知，需要更深入的研究加以探索。

綜上所述，10 g·L-1聚維酮碘局部滴眼可引起實(shí)驗(yàn)大鼠眼表結(jié)構(gòu)損傷和淚膜穩(wěn)定性下降，聚維酮碘的眼表毒性有必要引起臨床醫(yī)師的高度重視。另外，我們通過(guò)10 g·L-1聚維酮碘局部滴眼成功誘導(dǎo)了蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼模型，為研究干眼的病理生理學(xué)特點(diǎn)、發(fā)病機(jī)制和治療提供了簡(jiǎn)便易行且穩(wěn)定的造模方式，具有較強(qiáng)的理論和現(xiàn)實(shí)意義。