牛占宇 李建德 石永鵬 陳臨池 楊鵬飛 田換兵 高嵐

老年性黃斑病變(SMD)是世界范圍內(nèi)60歲以上老年人致盲的首要原因，明確SMD的發(fā)病過程和病理機制是進行有效治療的關鍵。碘酸鈉(NaIO3)是一種可以對視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞造成選擇性損傷的穩(wěn)定氧化劑[1]，在多種哺乳動物中能誘發(fā)氧化應激反應產(chǎn)生視網(wǎng)膜毒性，包括猴、綿羊、豬、兔、大鼠、小鼠[2-3]。由于NaIO3誘導的視網(wǎng)膜變性過程與非滲出性SMD患者病變過程相似，因此NaIO3誘導視網(wǎng)膜變性常作為非滲出性SMD的動物模型[4-5]。盡管已有不少基于小鼠SMD模型的研究，但是對于NaIO3誘導的小鼠SMD模型視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構隨時間變化的研究較少。因此，本研究旨在于評估尾靜脈單劑量注射NaIO3(35 mg·kg-1)后不同時間小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構的損傷程度，以期為NaIO3誘導SMD動物模型的研究提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組選取6～8周齡健康昆明小鼠36只，體質(zhì)量25～30 g，雌性(蘭州大學實驗動物中心提供)，飼養(yǎng)于符合醫(yī)學實驗動物要求的環(huán)境中。將小鼠分為對照組、損傷3 d組、損傷7 d組、損傷14 d組，每組9只小鼠，3只用于石蠟切片，3只用于冰凍切片，3只用于視網(wǎng)膜鋪片。對照組不作任何處理，各損傷組小鼠經(jīng)尾靜脈單劑量注射NaIO3，分別于損傷后3 d、7 d、14 d取材。實驗過程中無小鼠死亡，所有動物實驗均符合醫(yī)學動物實驗倫理規(guī)定。

1.1.2 主要儀器與試劑石蠟切片機、冰凍切片機(德國Leaca公司)，烤片機(天津天利航空機電有限公司)，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，體式顯微鏡(德國Zeiss公司)。NeuN抗兔多克隆抗體、Opn1mw抗兔多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，GFAP抗兔多克隆抗體(武漢博士德生物公司)，Iba1抗兔多克隆抗體(英國Abcom公司)，594標記的山羊抗兔二抗、兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，DAPI染色液、DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，NaIO3(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立稱取0.07 g NaIO3溶于PBS中，配制成終濃度為70 g·L-1溶液。按5 μL·g-1(35 mg·kg-1)體質(zhì)量尾靜脈單劑量注射到小鼠體內(nèi)，建立視網(wǎng)膜變性模型。將處理后的小鼠在干凈、安靜的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2.2 取材分別于NaIO3注射后3 d、7 d、14 d取材，將小鼠用50 g·L-1水合氯醛深度麻醉，四肢伸直、腹部朝上固定于解剖盤，剪開胸腔暴露心臟，剪破右心耳，注射器吸取20 mL PBS從左心室進針沖洗血液，隨后立即從同一位置注入40 g·L-1多聚甲醛20 mL，待小鼠全身僵硬后即完成心臟灌注。小心摘取雙側(cè)眼球，PBS中清洗后置于40 g·L-1多聚甲醛中于4 ℃固定24 h。

1.2.3 視網(wǎng)膜組織切片行HE染色將固定24 h的眼球在PBS中室溫浸洗30 min，行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋過夜，做厚6 μm石蠟切片，40 ℃烤片機烘烤6 h，進行HE染色，中性樹膠封片。每組隨機選取6張切片，400倍光學顯微鏡下每張切片隨機選取3個視野拍照，圖像用Image J軟件處理，統(tǒng)計視網(wǎng)膜組織每10 μm長度外核層(ONL)、內(nèi)核層(INL)中細胞數(shù)。

1.2.4 視網(wǎng)膜組織切片NeuN免疫組織化學染色將固定24 h的眼球在PBS中室溫浸洗30 min，行梯度蔗糖脫水，300 g·L-1蔗糖4 ℃脫水過夜，OCT包埋，做厚10 μm冰凍切片，室溫自然干燥后于-20 ℃保存。將凍存的組織切片取出，室溫復溫30 min，按兔SP試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。每組隨機選取6張切片，400倍光學顯微鏡下每張切片隨機選取3個視野拍照，圖像用Image J軟件處理，統(tǒng)計視網(wǎng)膜組織每100 μm長度視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)數(shù)。

1.2.5 視網(wǎng)膜組織鋪片GFAP免疫熒光染色將固定過夜的眼球于體式顯微鏡下小心剝離視網(wǎng)膜組織，于96孔板中PBS浸洗30 min；體積分數(shù)0.3% Trition X-100通透30 min；體積分數(shù)10%山羊血清封閉1 h；加一抗(GFAP)4 ℃孵育過夜，室溫復溫30 min;加二抗室溫避光孵育1 h，將視網(wǎng)膜組織置載玻片上，神經(jīng)纖維層朝上平鋪，向中心處剪4～5個切口，后用甘油PBS封片。每個視網(wǎng)膜組織在距視盤500 μm處選取3個視野拍照，圖像用Image J軟件處理并統(tǒng)計每200 μm×200 μm范圍內(nèi)被激活的Müller細胞數(shù)。

1.2.6 視網(wǎng)膜組織切片Opn1mw、Iba1免疫熒光染色將凍存的冰凍切片取出，室溫復溫30 min，體積分數(shù)0.3% Trition X-100通透20 min;體積分數(shù)10%山羊血清封閉40 min;加一抗(Opn1mw、Iba1)4 ℃孵育過夜，室溫復溫30 min;滴加二抗室溫避光孵育1 h，DAPI室溫避光復染8 min，甘油PBS封片。每組隨機選取3張切片，200倍光學顯微鏡下觀察拍照。圖像用Image J軟件處理，觀察視錐細胞外節(jié)段厚度和小膠質(zhì)細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析本研究數(shù)據(jù)應用SPSS 24.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗進行組間比較。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NaIO3對視網(wǎng)膜形態(tài)學變化的影響對照組小鼠視網(wǎng)膜RPE層、光感受器細胞外節(jié)段、ONL、INL、神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)形態(tài)結(jié)構完整、邊界清晰，細胞排列密集；各損傷組中NaIO3注射不同時間后小鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構發(fā)生不同程度的變化，其中損傷7 d組、損傷14 d組小鼠視網(wǎng)膜ONL、INL厚度變薄，細胞數(shù)顯著減少，結(jié)構出現(xiàn)波浪狀，且與外網(wǎng)狀層(OPL)邊界模糊(圖1)。

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果(×400，標尺為50 μm) A：對照組；B：損傷3 d組；C：損傷7 d組；D：損傷14 d組。

損傷3 d組、損傷7 d組、損傷14 d組小鼠視網(wǎng)膜中ONL細胞數(shù)均低于對照組，損傷7 d組、損傷14 d組INL細胞數(shù)均低于對照組差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表1)。

表1 各組視網(wǎng)膜中ONL、INL、GCL各層細胞數(shù)比較

2.2 NaIO3對RGC數(shù)的影響NeuN作為神經(jīng)元標記物，在本實驗中用來標記GCL中的RGC。與對照組相比，損傷3 d組和損傷7 d組GCL中RGC數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)，損傷14 d組小鼠每100 μm長度GCL中RGC數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見表1和圖2)。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜NeuN染色結(jié)果(×400，標尺為50 μm) A：對照組；B：損傷3 d組；C：損傷7 d組；D：損傷14 d組。

2.3 NaIO3對Müller細胞活化的影響GFAP的表達在視網(wǎng)膜中可作為檢測Müller細胞活化的指標，故在本實驗中用GFAP抗體來標記Müller細胞。與對照組相比，NaIO3損傷組中每200 μm×200 μm 范圍內(nèi)Müller細胞激活數(shù)量均有所增加(圖3)。損傷3 d組、損傷7 d組、損傷14 d組Müller細胞激活數(shù)量由對照組的(16.96±0.85)個分別增加至(20.42±1.64)個、(24.73±1.91)個、(30.04±3.76)個，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜GFAP免疫熒光染色結(jié)果(×200，標尺為50 μm) A：對照組；B：損傷3 d組；C：損傷7 d組；D：損傷14 d組。

2.4 NaIO3對小鼠視網(wǎng)膜中視錐細胞和小膠質(zhì)細胞的影響本實驗中Opn1mw抗體和Iba1抗體分別特異性標記視網(wǎng)膜中視錐細胞外節(jié)段和小膠質(zhì)細胞。對照組小鼠視網(wǎng)膜中視錐細胞外節(jié)段整齊排列成束狀，經(jīng)NaIO3損傷后隨著損傷時間延長，外節(jié)段排列逐漸紊亂，且外節(jié)段厚度與對照組相比明顯變薄。

對照組中Iba1陽性細胞主要分布于GCL、INL，經(jīng)NaIO3損傷后Iba1陽性細胞分布于整個視網(wǎng)膜，數(shù)量較對照組有所增加，且呈現(xiàn)出一種胞體增大、分支減少的“阿米巴”狀形態(tài)(圖4)。

圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜Opn1mw、Iba1染色結(jié)果(×200，標尺為50 μm) A、E：對照組；B、F：損傷3 d組；C、G：損傷7 d組；D、H：損傷14 d組。A 、B、C、D為Opn1mw染色結(jié)果；E、F、G、H為Iba1染色結(jié)果。

3 討論

NaIO3作為一種穩(wěn)定的強氧化劑，當小鼠體內(nèi)注射劑量最低為20 mg·kg-1時，誘導視網(wǎng)膜產(chǎn)生氧化應激反應，氧自由基(ROS)、丙二醛(MDA)以及氧化應激相關蛋白Hmox1表達升高，超氧化物歧化酶(SOD)表達降低[2,6]，并且引起RPE細胞壞死[2,7]，致使脈絡膜毛細血管萎縮[8]及全視網(wǎng)膜變性[9-10]。NaIO3引起的視網(wǎng)膜變性模型已被多次報道[11-13]，并用于神經(jīng)損傷方面治療的評估[14-15]，高劑量的NaIO3(30～100 mg·kg-1)誘導視網(wǎng)膜變性的主要原因是氧化應激[2]，在2～12 h 內(nèi)引起RPE細胞發(fā)生碎片化和細胞核丟失[10,16]，隨后對感光細胞外節(jié)段產(chǎn)生影響[9]，但因細胞毒性發(fā)生太快，無法明確識別視網(wǎng)膜損傷的機制[2]。根據(jù)不同的研究目的，NaIO3的給藥方式、濃度和損傷時間也不一致，在本實驗中采取尾靜脈單劑量注射的方式，濃度為35 mg·kg-1[17]，損傷時間梯度為3 d、7 d、14 d，來研究NaIO3對視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)NaIO3處理后，小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構發(fā)生明顯的改變，與對照組對比，各損傷組中RPE結(jié)構被破壞，視網(wǎng)膜光感受器細胞外節(jié)段受損，ONL、INL呈現(xiàn)出波浪狀的結(jié)構改變、厚度變薄，并且各層邊界模糊，細胞排列散亂，且這種損傷具有時間依賴性；研究結(jié)果還顯示，NaIO3作用后，ONL、INL每10 μm長度細胞總數(shù)具有顯著的下降趨勢，該結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致[2,18]。

視桿細胞和視錐細胞作為視網(wǎng)膜輸入的第一級神經(jīng)元，對視功能具有非常重要的作用。RPE細胞頂部的微絨毛緊密包裹著視桿細胞和視錐細胞的外節(jié)，故注射高劑量NaIO3會引起RPE細胞、視桿細胞和視錐細胞的退化，最終致使ONL和RPE層完全融合[19]。NaIO3在小鼠體內(nèi)所引發(fā)的氧化應激反應造成光感受器細胞中光傳導基因表達量下降以及光感受器細胞外節(jié)段受損[2,20]。在本研究中，用Opn1mw抗體特異性標記視錐細胞外節(jié)段，采用免疫熒光染色技術即可以觀察視錐細胞外節(jié)段損傷情況。本研究結(jié)果顯示，對照組中由Opn1mw抗體所標記的細胞結(jié)構呈束狀有規(guī)律排列，結(jié)構完整，經(jīng)NaIO3作用后，隨作用時間延長陽性信號區(qū)域面積逐漸減少、排列混亂且結(jié)合HE染色結(jié)果可知，視錐細胞外節(jié)段長度減少。說明NaIO3能引起視錐細胞結(jié)構損傷，且損傷程度具有時間依賴性。

RGC是視網(wǎng)膜中能唯一產(chǎn)生動作電位的神經(jīng)元，其軸突形成視神經(jīng)將視覺信號從視網(wǎng)膜傳到大腦[21]。視網(wǎng)膜在缺氧缺血的情況下所誘發(fā)的氧化應激會損傷RGC甚至引起其凋亡[22]。NeuN作為神經(jīng)元標記物可用來標記視網(wǎng)膜GCL中RGC。本研究采用NeuN免疫組織化學染色的方式來觀察視網(wǎng)膜中RGC數(shù)的變化，結(jié)果顯示，對照組中GCL細胞排列密集；經(jīng)NaIO3作用后，GCL細胞排列紊亂，其中NaIO3作用14 d 后，RGC數(shù)目減少且與對照組相比有顯著性差異，說明在體內(nèi)環(huán)境下NaIO3會誘發(fā)RGC損傷。

Müller細胞作為視網(wǎng)膜中特有的一種星形膠質(zhì)細胞，在視網(wǎng)膜發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持、營養(yǎng)支持等方面發(fā)揮重要作用[23]。視網(wǎng)膜處于病理狀態(tài)時會激活Müller細胞，使其發(fā)生反應性膠質(zhì)化，激活后的Müller細胞會大量表達GFAP，因此可用GFAP抗體染色來檢測Müller細胞的激活量，從而反映視網(wǎng)膜損傷程度。本研究中，通過視網(wǎng)膜鋪片GFAP免疫熒光染色對Müller細胞的反應性膠質(zhì)化程度進行評估。對視網(wǎng)膜每200 μm × 200 μm 范圍內(nèi)GFAP陽性細胞進行計數(shù)，結(jié)果顯示，與對照組比較，NaIO3作用后單位面積內(nèi)GFAP陽性細胞數(shù)量增加，說明NaIO3能激活Müller細胞。小膠質(zhì)細胞作為腦和視網(wǎng)膜的免疫監(jiān)視器，當組織受損后其可通過改變自身形態(tài)轉(zhuǎn)化為吞噬細胞而響應組織損傷。利用Iba1可對小膠質(zhì)細胞進行特異性染色，本研究發(fā)現(xiàn)，NaIO3作用后Iba1陽性細胞增多，且細胞形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)出胞體增大、分支減少的“阿米巴”狀，說明NaIO3作用后能激活小膠質(zhì)細胞。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，小鼠尾靜脈單劑量注射NaIO3會引起小鼠視網(wǎng)膜ONL、INL、GCL的細胞數(shù)減少，同時激活Müller細胞膠質(zhì)化反應和小膠質(zhì)細胞，且NaIO3對視網(wǎng)膜的損傷具有時間依賴性。本研究以期為NaIO3誘導SMD動物模型的研究提供更多的實驗數(shù)據(jù)與支持。