郭峰，董明輝，高夢園，舒方，孫冬冬，汪維云

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥，230036)

作為現(xiàn)代食品工業(yè)的靈魂，食品添加劑對于食物在改善口感、提升質(zhì)量、延長保質(zhì)期等方面是必不可少的，化學(xué)食品添加劑常被廣泛使用于食品生產(chǎn)，但這種食品添加劑的安全隱患問題一直存在，因而尋找天然食品添加劑代替化學(xué)食品添加劑已成為食品安全關(guān)注的焦點[1-2]。植物精油作為一類具有廣譜抗細菌、抗真菌以及抗氧化等作用且安全、低毒、高效的植物源食品保鮮劑，逐漸開始進入大眾的視野[3-5]。

檸檬香蜂草(MelissaofficinalisL.)又稱蜜蜂花、蜂香脂、皺葉薄荷，原產(chǎn)于南歐和地中海地區(qū)，唇形科多年草本植物，因其具有清新的檸檬香氣和清爽香甜的口感，常被作為調(diào)味料用在食品及飲料中[6-7]。此外，作為一種享有聲譽的藥食兩用植物，檸檬香蜂草曾有被制成湯劑用于治療銀屑病的記載[8]，以及將檸檬香蜂草與其他藥草混合食用用于預(yù)防癡呆、延緩記憶障礙的記載[9]?，F(xiàn)有大量研究證明檸檬香蜂草精油還可作為抗菌劑、抗氧化劑、抗炎劑、鎮(zhèn)靜劑等用于治療各種疾病，且不同的檸檬香蜂草精油表現(xiàn)出對包含芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌在內(nèi)的多種微生物的抑菌效果[6]。清新的味道、良好的功效、低毒性和易于種植的特點使得檸檬香蜂草精油具有成為理想的天然食品添加劑的潛質(zhì)[10-11]。

基于不同的檸檬香蜂草精油成分受產(chǎn)地與溶劑的影響[12-13]，本研究采用水蒸氣蒸餾萃取法(steam distillation，SD)提取國產(chǎn)檸檬香蜂草的精油，紙片擴散法(kirby-bauer，K-B)初步篩選敏感菌株，稀釋涂布平板法測定半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)，初步判斷出該精油的抑菌能力，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分析該精油組成成分，結(jié)合目前研究結(jié)果分析該精油中的抑菌成分。旨在為檸檬香蜂草精油在食品加工領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

新鮮檸檬香蜂草(市售)，經(jīng)鑒定為唇形科薄荷屬檸檬香蜂草(MelissaofficinalisL.)全草。除去枝干，將葉片經(jīng)粉碎機粉碎后備用。

NaCl、無水硫酸鈉、無水乙醇、乙酸乙酯(均為分析純)，天津國藥集團。

1.1.2 供試菌株

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、四聯(lián)球菌(Micrococcustetragenus)，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基的制備

蒸餾水1 000 mL；蛋白胨10 g；瓊脂15～25 g；牛肉膏3 g；NaCl 5 g；調(diào)節(jié)pH至7.2～7.5，放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)120 ℃滅菌2 h后，將培養(yǎng)基倒入無菌空白培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基冷卻凝固備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 SD法提取精油

將粉碎后的檸檬香蜂草裝入圓底燒瓶中，水蒸氣蒸餾2 h以上得到水油混合物，用乙酸乙酯溶解后，加入無水硫酸鈉靜置12 h，抽濾，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，得到密度為0.71 g/mL的檸檬香蜂草揮發(fā)油，即檸檬香蜂草精油。

1.2.2 菌懸液的制備

蒸餾水1 000 mL；蛋白胨10 g；牛肉膏3 g；NaCl 5 g；調(diào)節(jié)pH至7.2～7.5，高壓蒸汽滅菌鍋120 ℃滅菌2 h。將活化后的細菌接種于該培養(yǎng)液中，搖床37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，即得菌懸液。

1.2.3 檸檬香蜂草精油稀釋液的制備

檸檬香蜂草精油以無水乙醇為溶劑，設(shè)置從10%～100%共10個濃度梯度的精油稀釋液，并設(shè)置溶劑空白對照試驗[13]。

1.2.4 抑菌活性測定

移液槍分別吸取1 mL 3種菌懸液于固體培養(yǎng)基中，將菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，夾取檸檬香蜂草精油稀釋液濾紙片置于培養(yǎng)基上，設(shè)置3組平行實驗，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。同時設(shè)置溶劑空白對照，通過測定抑菌圈直徑大小以評估抑菌活性。

1.2.5 檸檬香蜂草精油對四聯(lián)球菌IC50測定

取3 mL四聯(lián)球菌菌懸液，用無菌水將其稀釋，濃度梯度為10-1、10-2、10-4、10-5、10-6CFU/mL，分別將菌液、無水乙醇、純水按照表1加入到6根試管中作為對照組。

表1 稀釋涂布對照組

將菌液與檸檬香蜂草稀釋液按照表2加入到20根試管中作為實驗組。

將這26根試管放入搖床37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，稀釋涂布后，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。用平板菌落計數(shù)法計算菌落數(shù)，以抑菌率為縱坐標(biāo),檸檬香蜂草精油體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算IC50值。

表2 稀釋涂布實驗組

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬香蜂草精油的GC-MS結(jié)果分析

采用GC-MS技術(shù)對檸檬香蜂草精油揮發(fā)性成分進行分析，得到檸檬香蜂草精油的總離子流圖如圖1所示。

圖1 檸檬香蜂草揮發(fā)性成分總離子流圖

由圖1可知，用SD法提取出的檸檬香蜂草精油含有眾多不同類型的揮發(fā)物，成分復(fù)雜，根據(jù)每個峰在質(zhì)譜庫中進行檢索，與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(NIST11)比對，設(shè)定相似度閾值(>85%)進行化合物甄別，最終共得到30種揮發(fā)性成分，解析結(jié)果如表3所示[14-15]。

表3 檸檬香蜂草精油揮發(fā)性成分

這30個揮發(fā)性成分中脂肪族化合物有8個占比為25.91%，芳香族化合物有5個占比為20.16%，萜類化合物有17個占比為53.93%。

根據(jù)表3可知,角鯊烯(squalene)的相對含量最高，可達6.44%。角鯊烯是一種天然的脂溶性三萜化合物，具有很強的攜氧能力，還具有抗氧化、抗輻射、解毒、調(diào)節(jié)膽固醇代謝等生物活性，所以被廣泛運用在化妝品和醫(yī)療保健方面[16-17]。其他具有抗菌、抗氧化等功效的揮發(fā)性物質(zhì)分別為β-石竹烯(caryophyllene oxide)3.46%、香茅醇(citronellal)2.42%、檸檬醛(2,6-octadienal, 3,7-dimethyl)2.39%。

2.2 檸檬香蜂草精油抑菌實驗結(jié)果分析

按照1.2.5中抑菌性測定方法，以無水乙醇溶劑空白試驗為參照，采用K-B法進行抑菌活性測定，以抑菌圈直徑大小評估抑菌活性。抑菌圈直徑>20 mm 時為極敏；16～20 mm為高敏；11～15 mm為中敏；8～10 mm為低敏；<8 mm為不敏感。以無水乙醇為溶劑的檸檬香蜂草精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、四聯(lián)球菌的抑菌效果如表4所示[14]。

表4 檸檬香蜂草精油對3種待試菌的抑菌活性

由表4可知,檸檬香蜂草精油對這3種細菌的抑制效果由強到弱為四聯(lián)球菌>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌。抑菌圈直徑最大達26 mm，且在實驗濃度范圍內(nèi)隨著精油稀釋液濃度的升高，抑菌圈直徑增大，抑菌能力增強。

2.3 檸檬香蜂草精油對四聯(lián)球菌IC50值測定

本研究采用平板菌落計數(shù)法，檢測了10個不同濃度的檸檬香蜂草精油對四聯(lián)球菌的抑菌活性,并以概率單位為縱坐標(biāo),樣品不同稀釋液體積分?jǐn)?shù)對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制曲線圖，計算IC50值為457 μg/mL。半數(shù)抑菌濃度越小，樣品的抑菌活性越高，從該結(jié)果可知，檸檬香蜂草精油對四聯(lián)球菌有較好的抑制效果。

3 討論

從檸檬香蜂草精油GC-MS分析結(jié)果可以看出，檸檬香蜂草精油中萜類化合物占比較大，可達50%以上，其中角鯊烯的相對含量在所有化合物中最高；從檸檬香蜂草精油的抑菌實驗結(jié)果可以看出，該精油對于四聯(lián)球菌有著較好的抑制作用，且通過該作用能進一步延緩食物腐敗。結(jié)合王靜等[18-19]、劉曉生等[20]對檸檬香蜂草精油和精氣的揮發(fā)性成分分析結(jié)果，可初步判斷在該檸檬香蜂草精油中，對四聯(lián)球菌的生長繁殖起抑制作用的揮發(fā)性物質(zhì)是β-石竹烯、香茅醇和檸檬醛。

4 結(jié)論

本研究通過SD法制備檸檬香蜂草精油，以無水乙醇為溶劑配制不同濃度的檸檬香蜂草稀釋液。通過K-B法測定不同體積分?jǐn)?shù)的稀釋液對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和四聯(lián)球菌抑菌效果，篩選敏感菌株。該實驗結(jié)果顯示，檸檬香蜂草精油對于四聯(lián)球菌的抑制作用最好，且在實驗濃度范圍內(nèi)，隨稀釋液體積分?jǐn)?shù)增加，抑制作用也隨之增強，而對于金黃色葡萄球菌則幾乎沒有抑制作用。通過稀釋涂布平板法測得檸檬香蜂草精油對四聯(lián)球菌的IC50為457 μg/mL。通過GC-MS對檸檬香蜂草精油中揮發(fā)性成分進行分析，可確定精油中各類化合物占比，初步篩選出檸檬香蜂草精油中對四聯(lián)球菌具有抑制作用的化合物。本研究結(jié)果為研發(fā)綠色健康的食物添加劑提供了更多理論基礎(chǔ)，拓寬了研究思路。