鄧秋金，宿程遠(yuǎn)，陸欣雅，關(guān)鑫，覃容華，鄧鈺蓮，高澍，黃尊

（1 珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004； 2 廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西 桂林541004）

引 言

水體中氮污染已成為嚴(yán)峻水環(huán)境問(wèn)題，高濃度硝酸鹽和亞硝酸鹽廢水過(guò)量排放，致使水體富營(yíng)養(yǎng)化、污染地下水、誘發(fā)人體發(fā)生疾病等[1]，因此諸多學(xué)者積極探索廢水脫氮的有效方法[2]，生物法可利用反硝化細(xì)菌等將NO3--N 和NO2--N 轉(zhuǎn)化為N2，是現(xiàn)今最常用的脫氮方法之一[1]。微生物燃料電池（MFC）可利用微生物作為催化劑將有機(jī)化合物氧化分解，將有機(jī)物中的化學(xué)能直接轉(zhuǎn)化為電能，且可實(shí)現(xiàn)同步脫氮[3-4]。Huang 等[1]的研究表明MFC 在接種污泥的閉合電路下（Thauera 59.9%，Geobacter 6.5%）平均脫氮率可高達(dá)(12.2±0.6) kg NO3--N·(m3·d)-1，較開(kāi)放電路（Thauera 31.9%，Geobacter 0%）的脫氮率高74.3%。Jin 等[5]研究發(fā)現(xiàn)在MFC 反應(yīng)器的陽(yáng)極上，反硝化細(xì)菌可與產(chǎn)電菌共存，同時(shí)可通過(guò)有機(jī)物的氧化實(shí)現(xiàn)硝酸鹽還原與產(chǎn)電。Cheng 等[6]在MFC 陽(yáng)極表面接種好氧顆粒污泥，最大功率密度為(491±8)mW·m-2，COD 去除率為82%±5%，與單獨(dú)使用MFC相比，反應(yīng)器的啟動(dòng)時(shí)間縮短一周。

相關(guān)學(xué)者在探究高效脫氮時(shí)發(fā)現(xiàn)，甲烷作為一種重要的能源，同時(shí)也是重要的溫室氣體，其引起的溫室效應(yīng)強(qiáng)度是CO2的25～30 倍[7-8]；反硝化厭氧甲烷氧化（DAMO）過(guò)程對(duì)甲烷氧化發(fā)揮著重要作用，在沉積物、濕地等環(huán)境中，甲烷由產(chǎn)甲烷菌在底層厭氧區(qū)生成，并作為電子供體在向上擴(kuò)散過(guò)程中與NO3--N/NO2--N 等電子受體結(jié)合轉(zhuǎn)化為CO2、H2O和N2[9]，實(shí)現(xiàn)同步甲烷氧化與脫氮過(guò)程，對(duì)減少甲烷的排放和脫氮發(fā)揮潛在作用[10-11]。Hatamoto 等[12]研究了下流式海綿填料生物反應(yīng)器中的DAMO 過(guò)程，該反應(yīng)器對(duì)NO2--N 和NO3--N 的去除率分別為97.2%和64.0%，同時(shí)溶解性甲烷的利用率為2.6 mmol·(L·d)-1。Ding 等[13]研 究 發(fā) 現(xiàn)，MFC 可 強(qiáng) 化DAMO 菌群的富集，從而實(shí)現(xiàn)了甲烷驅(qū)動(dòng)下MFC 的成功運(yùn)行，這為解決DAMO 菌群難富集的問(wèn)題提供了新思路；同時(shí)有學(xué)者[14]指出顆粒污泥具有較大的比表面積及高負(fù)荷率，可為DAMO 菌群的生長(zhǎng)提供更為良好的環(huán)境。

基于此，本文構(gòu)建了新型生物電化學(xué)-顆粒污泥反應(yīng)器，探究了在溶解性甲烷存在條件下，不同進(jìn)水濃度的硝酸鹽和亞硝酸鹽對(duì)該反應(yīng)器脫氮性能、產(chǎn)電性能的影響，同時(shí)從污泥胞外聚合物（EPS）、溶解性微生物產(chǎn)物（SMP）、關(guān)鍵酶活性及微生物群落結(jié)構(gòu)等變化情況多維度揭示影響機(jī)制，以期得到一種高效、具有可持續(xù)發(fā)展性的廢水脫氮處理技術(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置與實(shí)驗(yàn)過(guò)程

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of experimental equipment

實(shí)驗(yàn)裝置如圖1 所示，該反應(yīng)器主要由兩部分組成：陽(yáng)極室（厭氧段）和陰極室（好氧段），總有效體積為5.61 L，其中陽(yáng)極室總體積為4.8 L（400 mm× 80 mm× 150 mm），有效體積為3.52 L；陰極室總體積2.2 L（400 mm× 55 mm× 100 mm），有效體積為2.09 L。陽(yáng)極室由4 個(gè)大小一致的小格室構(gòu)成，各個(gè)格室均置入一個(gè)碳刷（材質(zhì)由東麗碳絲與鈦絲構(gòu)成，型號(hào)CTN310）和質(zhì)子交換膜（型號(hào)為美國(guó)杜邦公司生產(chǎn)的Nafion117）[15]，并設(shè)有采樣口。陰極室中置入4 個(gè)碳布（為柱狀體，直徑4 cm，高度6 cm）依次與陽(yáng)極室4 個(gè)格室的碳刷及4 個(gè)1 kΩ 的外部電阻相連接[16]，并連接數(shù)據(jù)采集卡（泓格科技公司，型號(hào)為PISO-813U），通過(guò)電腦對(duì)電壓在線(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控。各格室陽(yáng)極與陽(yáng)極間距為50 mm，陰極與陰極間距60 mm，陽(yáng)極與陰極間距為40 mm。同時(shí)，陰極室中放置砂心曝氣頭，控制溶解氧濃度約為3.0 mg·L-1。該反應(yīng)器處理流程為廢水首先進(jìn)入陽(yáng)極室（自進(jìn)口處起依次命名為1、2、3、4 號(hào)格室），經(jīng)陽(yáng)極室處理后由4 號(hào)格室出水口進(jìn)入陰極室（5 號(hào)格室）進(jìn)行好氧處理，最后廢水由反應(yīng)器出水口流出。該反應(yīng)器水力停留時(shí)間為24 h，運(yùn)行溫度為室溫。

該反應(yīng)器陽(yáng)極室的接種污泥為桂林某啤酒廠(chǎng)的厭氧顆粒污泥與桂林某濕地底泥的混合污泥，陰極室的好氧活性污泥取自桂林某污水處理廠(chǎng)。陽(yáng)極室接種污泥量為各格室有效體積的2/3，此時(shí)可獲得較高的微生物量；陰極室接種污泥量為有效體積的1/3，可避免污泥過(guò)度增殖而形成過(guò)多的剩余污泥。實(shí)驗(yàn)用水為人工配制的模擬廢水[16-17]，成 分 為：CH3COONa（2.3 g·L-1）、NaHCO3（0.3 g·L-1）、KH2PO4（0.12 g·L-1）、CaCl2·2H2O（0.3 g·L-1）、MgSO4·7H2O（0.2 g·L-1），以及0.5 ml·L-1的酸性微量元素與0.2 ml·L-1的堿性微量元素。進(jìn)水中NaNO3和NaNO2在不同運(yùn)行階段加入量有所不同，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)階段進(jìn)水NO3--N 和NO2--N 濃度分別為60 mg·L-1和20 mg·L-1、100 mg·L-1和40 mg·L-1、140 mg·L-1和60 mg·L-1、180 mg·L-1和80 mg·L-1。

1.2 分析方法

COD 測(cè)定采用快速消解法，NO2--N 測(cè)定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，NO3--N 測(cè)定采用紫外可見(jiàn)分光光度法。溶解性甲烷的測(cè)定采用泵吸式采樣方式[18]，儀器名稱(chēng)為泵吸式氣體檢測(cè)報(bào)警儀，生產(chǎn)廠(chǎng)家為上海唐儀電子科技有限公司，型號(hào)為HD5S+。污泥中輔酶F420與乙酸激酶活性的測(cè)定采用紫外分光光度法，蛋白酶活性采用茚三酮分光光度法進(jìn)行分析[19-21]。污泥SMP 與EPS 中多糖與蛋白含量分別采用硫酸-蒽酮比色法和考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行測(cè)定[22-23]。

利用16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)分析該反應(yīng)器內(nèi)的微生物群落變化，分別在第Ⅰ和第Ⅳ階段運(yùn)行結(jié)束后，從每個(gè)格室中收集0.25 g 污泥樣本，采用Mag-Bind Soil DNA 試 劑盒（E.Z.N.ATM, OMEGA,USA）進(jìn)行DNA 提取。DNA 擴(kuò)增16S rRNA 基因可變 區(qū) 為 V3-V4， 引 物 為 341F （5′-CCTACGGGNGGCWGCAG - 3′) 和 805R （5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′），利用Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。序列以97%的相似性聚類(lèi)成操作分類(lèi)單元（OTUs），利用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目（RDP）分類(lèi)器對(duì)每個(gè)樣本序列進(jìn)行分類(lèi)[24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 各階段COD的去除情況

首先考察了不同進(jìn)水NO3--N 和NO2--N 濃度對(duì)生物電化學(xué)-顆粒污泥反應(yīng)器COD 去除率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同氮濃度對(duì)COD去除率的影響Fig.2 Effects of different nitrogen concentrations on COD removal efficiency

由圖2可知，在第Ⅰ階段（室溫為20～30℃）的第1～20 天，COD 去除率在98.0%～61.7%之間波動(dòng)，表明該反應(yīng)器中污泥處于適應(yīng)階段。自第21～57 天，出水COD 濃度在100 mg·L-1以下，COD 去除率維持在90%以上，表明此時(shí)反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定。在第Ⅱ階段時(shí)，由于進(jìn)水NO3--N 和NO2--N 濃度的增大與室溫的降低（室溫為0～15℃），出水COD 濃度與去除率處于波動(dòng)狀態(tài)；第58～67 天，COD 去除率由94.5%下降至65%；由于受到溫度影響，該反應(yīng)器運(yùn)行到第104 天，COD 去除率仍波動(dòng)較大，去除率在60%～70%之間。當(dāng)反應(yīng)器運(yùn)行至第Ⅲ、Ⅳ階段時(shí)，隨著室溫升高（室溫分別為20～30℃和30～35℃），即使進(jìn)水氮濃度逐漸升高，COD 去除率仍處于較穩(wěn)定的狀態(tài)。在第Ⅲ階段，第146～153天時(shí)，COD去除率維持在95%以上。至第Ⅳ階段，COD 去除率維持在96%以上，出水COD 濃度低至7 mg·L-1。表明經(jīng)過(guò)185 d運(yùn)行后，該反應(yīng)器對(duì)COD 去除效果良好，反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定，對(duì)提高進(jìn)水氮濃度表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性。

2.2 各階段的脫氮效果與溶解性甲烷利用情況

考察了各階段生物電化學(xué)-顆粒污泥反應(yīng)器的脫氮與溶解性甲烷利用情況，結(jié)果如圖3所示。

如圖3 所示，在第Ⅰ和第Ⅱ階段，NO3--N 和NO2--N去除效果穩(wěn)定且良好，第Ⅰ階段出水NO3--N濃度在0.01～0.96 mg·L-1，去除率達(dá)98.7%～99.9%；出水NO2--N 濃度在0.003～0.08 mg·L-1。在第Ⅱ階段，即使進(jìn)水氮濃度升高與溫度下降，出水NO3--N濃度仍維持在0.03～0.44 mg·L-1，出水NO2--N 濃度在0.006～0.20 mg·L-1，進(jìn)一步表明該反應(yīng)器即使在低溫環(huán)境下仍能進(jìn)行有效脫氮。在第Ⅲ階段，出水NO3--N 濃度在0.07～2.48 mg·L-1，出水NO2--N 濃度在0.001～0.54 mg·L-1，均變化幅度較大。到第Ⅳ階段，出水NO3--N 濃度在0.98～2.5 mg·L-1之間，NO2--N 去除率在99.9%以上，且出水NO2--N 濃度始終低于0.1 mg·L-1。這表明該反應(yīng)器在第Ⅲ和第Ⅳ階段，出水NO3--N 濃度出現(xiàn)小幅度升高，NO2--N 去除率一直保持在較高水平；NO3--N 在第Ⅲ和第Ⅳ階段的去除效率出現(xiàn)降低可能是進(jìn)水氮濃度提高對(duì)反應(yīng)器內(nèi)微生物有一定程度的抑制。

第Ⅰ階段結(jié)束時(shí)，測(cè)得厭氧段（陽(yáng)極室）1 號(hào)～4號(hào)格室的溶解性甲烷含量分別為32.9、72.6、151.1和136.7%LEL CH4·kg-1，其中單位%LEL CH4·kg-1的含義為每千克廢水中含有的甲烷氣體的體積百分比濃度。在第Ⅱ階段的4 次檢測(cè)中，只在第1 次檢測(cè)到1 號(hào)～4 號(hào)格室溶解性甲烷含量分別為69.1、0、17.7、42.5%LEL CH4·kg-1，與第Ⅰ階段相比，溶解性甲烷含量明顯降低，原因可能是隨著反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)間和進(jìn)水氮濃度的增加，DAMO 菌出現(xiàn)而消耗溶解性甲烷去除NO3--N 和NO2--N。在第Ⅲ階段的3 次檢測(cè)中，只1次檢測(cè)到3號(hào)和4號(hào)格室的溶解性甲烷含量分別為21.5 和71.4%LEL CH4·kg-1；第Ⅳ階段的3 次檢測(cè)中，只1 次檢測(cè)到1 號(hào)和2 號(hào)格室的溶解性甲烷含量分別為33.3 和49.0%LEL CH4·kg-1，其余均未檢出。但與以甲烷氣體為有機(jī)底物的研究相比[25-26]，該反應(yīng)器由厭氧段產(chǎn)生的甲烷量較少，因此可推測(cè)出該反應(yīng)器的脫氮過(guò)程存在反硝化過(guò)程，同時(shí)存在由DAMO 菌利用溶解性甲烷進(jìn)行脫氮的過(guò)程。

2.3 各階段陽(yáng)極室的產(chǎn)電性能

繼而考察了各階段生物電化學(xué)-顆粒污泥反應(yīng)器功率密度與電流極化變化情況。本文按反應(yīng)器陽(yáng)極體積進(jìn)行計(jì)算，即體積電流密度，并通過(guò)調(diào)節(jié)電阻箱改變外電阻阻值，測(cè)出電流密度和功率密度值，從而得到功率密度曲線(xiàn)與極化曲線(xiàn)[27]，結(jié)果如圖4所示。

由圖4 可知，對(duì)于1 號(hào)和2 號(hào)格室，其在各階段的變化較為明顯，均為第Ⅲ階段達(dá)到最大功率密度值，分別為353.7 mV·m-3和293.7 mV·m-3，此時(shí)1 號(hào)和2 號(hào)格室最大的輸出電壓值分別為539.7 mV 和500.6 mV；最低為第Ⅱ階段，最大功率密度值僅分別為15.0 mV·m-3和78.2 mV·m-3，輸出電壓值分別為97.7 mV 和149 mV。雖然1 號(hào)和2 號(hào)格室在第Ⅲ階段時(shí)內(nèi)阻最大，可能因?yàn)? 號(hào)和2 號(hào)格室微生物在此生長(zhǎng)環(huán)境下適應(yīng)能力最佳，代謝活動(dòng)旺盛，因此可有效降低活化極化并減少電荷轉(zhuǎn)移內(nèi)阻[28]。對(duì)于3 號(hào)和4 號(hào)格室，在第Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ階段的功率密度曲線(xiàn)變化相近，均為第Ⅳ階段與其他3 個(gè)階段變化差異較大，3 號(hào)格室在第Ⅳ階段的功率密度值和輸出電壓值最小，僅為9.8 mV·m-3和95.2 mV；而4 號(hào)格室則最大，為471.2 mV·m-3和608.1 mV。綜合分析可知，該生物電化學(xué)-顆粒污泥反應(yīng)器的功率密度和輸出電壓最大值為第Ⅳ階段的4 號(hào)格室，且第Ⅱ階段各格室的功率密度值均最低（除3 號(hào)格室），原因與該反應(yīng)器運(yùn)行的溫度密切相關(guān)，此時(shí)室溫低于15℃，產(chǎn)電微生物活性受到抑制，這與有機(jī)物的去除情況也是一致的，同時(shí)與Chen 等[29]探討了不同運(yùn)行溫度對(duì)甲烷驅(qū)動(dòng)MFC 的影響結(jié)論相似，當(dāng)溫度降至10℃和5℃時(shí)，電壓僅為0.156 V 和0.190 V，考慮到工程應(yīng)用的簡(jiǎn)便，本研究未對(duì)反應(yīng)器進(jìn)行加熱。此外，適當(dāng)增加氮濃度，有利于提高反應(yīng)器的功率密度值和輸出電壓值。

極化曲線(xiàn)斜率可用來(lái)表征電極的極化程度，斜率越大，其極化程度越大[28]。由圖4 可知，極化曲線(xiàn)變化與功率密度曲線(xiàn)變化趨勢(shì)相似，1號(hào)和2號(hào)格室在各階段的極化程度差異較大，表現(xiàn)為Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅳ＞Ⅲ，而極化程度越低，電荷傳遞速率越快，產(chǎn)電性能越好[28]；1 號(hào)和2 號(hào)格室在各階段的極化程度與其產(chǎn)電性能相對(duì)應(yīng)，為第Ⅲ階段的產(chǎn)電性能最佳，最大電流密度分別為1859.1 mA·m-3和1233.6 mA·m-3，最大開(kāi)路電壓分別為832.7 mV 和793.7 mV。對(duì)于3號(hào)和4號(hào)格室而言，其極化曲線(xiàn)在第Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ階段變化均較小且相近。此外各格室的極化曲線(xiàn)變化趨勢(shì)為在第Ⅱ階段時(shí)極化程度最大，在第Ⅲ階段時(shí)極化程度最小，原因可能是一方面該反應(yīng)器在第Ⅱ階段運(yùn)行時(shí)的溫度低，產(chǎn)電微生物活性受到抑制，致使極化程度增大；另一方面，隨著進(jìn)水氮濃度的增大，電子從陽(yáng)極傳遞至陰極的電子受體濃度增加，且電荷傳遞速率加快，從而形成較高的產(chǎn)電性能。

結(jié)合相關(guān)研究，如楊金萍等[30]基于雙室MFC，在陰極分別接種活性污泥和反硝化細(xì)菌處理硝酸鹽廢水，NO3--N 濃度由97.74 mg·L-1下降到10.2 mg·L-1，最高電壓輸出為280. 98 mV；Liu 等[31]構(gòu)建了一種新型的三室生物電化學(xué)裝置，其對(duì)硝酸鹽的反硝化速率為3.87 mg N·(L·h)-1，輸出電壓穩(wěn)定在622 mV±20 mV；可見(jiàn)本反應(yīng)器在結(jié)構(gòu)上的改進(jìn)可實(shí)現(xiàn)對(duì)污染物高效、穩(wěn)定的去除，實(shí)現(xiàn)能源的回收利用，同時(shí)微生物的存在可加快系統(tǒng)的電子傳遞效率[31]。

2.4 各階段對(duì)污泥EPS多糖和蛋白的影響

EPS是微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的多聚化合物總稱(chēng)，其會(huì)對(duì)顆粒污泥的形成速度及其穩(wěn)定性、污泥沉降性能有著重要影響，其中多糖和蛋白在EPS 中占據(jù)的比例最大[23]，因此通過(guò)分析不同階段污泥SMP、緊密胞外聚合物（TB-EPS）和松散胞外聚合物（LB-EPS）中的多糖與蛋白含量，可以反映該反應(yīng)器中的污泥性能，結(jié)果如圖5所示。

圖4 不同氮濃度下的功率密度曲線(xiàn)(a)和電流極化曲線(xiàn)(b)Fig.4 Power density curves(a)and current polarization curves(b)under different nitrogen concentrations

由圖5 可知，在第Ⅰ階段，SMP、LB-EPS 和TBEPS的多糖和蛋白含量在各格室變化趨勢(shì)為：1、3和5號(hào)格室含量較高，2號(hào)和4號(hào)格室含量較低，且TBEPS 的多糖和蛋白含量相對(duì)較高。在第Ⅱ階段時(shí)，各格室污泥SMP、LB-EPS 和TB-EPS 的多糖與蛋白含量變化趨勢(shì)明顯，均為5＞1＞2＞3＞4 號(hào)格室，其中5號(hào)格室的SMP、LB-EPS 和TB-EPS 的多糖和蛋白含量均為最高，分別為3.4、2.8 和13.7 mg·g-1，14.7、11.1 和11.0 mg·g-1，原因可能是在此階段隨著進(jìn)水氮濃度的升高和溫度的降低，1 號(hào)格室負(fù)荷增大，EPS 分泌增多，而隨著污染物逐漸去除，2 號(hào)～4 號(hào)格室的EPS 含量逐漸降低，但此時(shí)厭氧段出水COD 仍較高，使得好氧段5號(hào)格室微生物代謝旺盛，多糖和蛋白含量較高。各格室在第Ⅲ和第Ⅳ階段的多糖和蛋白含量變化趨勢(shì)一致，為2 號(hào)、4 號(hào)和5 號(hào)格室的多糖和蛋白含量較高，表明反應(yīng)器各格室中污泥的形成和穩(wěn)定性呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，為反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行提供了保障作用，且溫度升高增多了污泥EPS中多糖和蛋白的分泌。

2.5 各階段污泥的關(guān)鍵酶活性

不同的功能微生物具有不同的特性酶，反應(yīng)器的運(yùn)行是在一系列功能微生物與關(guān)鍵酶共同參與下完成對(duì)污染物的轉(zhuǎn)化過(guò)程[32-33]。因此，本文對(duì)不同階段該反應(yīng)器中污泥輔酶F420、乙酸激酶和蛋白酶活性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。

輔酶F420是產(chǎn)甲烷菌所特有的功能酶，其能作為電子載體，參與厭氧消化的產(chǎn)甲烷階段以合成甲烷，并可用于指示產(chǎn)甲烷菌的活性與產(chǎn)氣效率[20,34]。由圖6 可知，厭氧段1 號(hào)～4 號(hào)格室的輔酶F420活性均在第Ⅲ階段最高，活性最高的為2 號(hào)格室（0.21 μmol·g-1）；最低為第Ⅱ階段的1號(hào)格室，主要是溫度對(duì)輔酶F420活性有著重要影響[9]；同時(shí)合適的進(jìn)水氮濃度有利于提高輔酶F420活性，更有利于DAMO 菌利用溶解性甲烷進(jìn)行脫氮。乙酸激酶參與厭氧菌的乙酸代謝，而乙酸代謝中首要的是乙酸的活化，其由乙酸激酶催化，進(jìn)入三羧酸循環(huán)完成乙酸代謝，在生物體內(nèi)有著重要意義[35]。由圖6 可知，1 號(hào)格室乙酸激酶活性在各階段的趨勢(shì)為Ⅰ＞Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅱ，最高活性為2.88 μmol·g-1，最低為1.02 μmol·g-1。而2號(hào)～4號(hào)格室的乙酸激酶活性在第Ⅱ階段達(dá)到最大 值，分 別 為3.72 μmol·g-1、2.60 μmol·g-1和4.34 μmol·g-1。1 號(hào)格室與其他3 個(gè)格室變化規(guī)律不同的原因可能是1 號(hào)格室所承受的有機(jī)負(fù)荷最大，因此在第Ⅰ階段1 號(hào)格室污泥中乙酸激酶活性最大。第Ⅱ階段由于溫度的降低，使得1 號(hào)格室微生物活性受到影響，乙酸激酶活性降低，僅為0.58 μmol·g-1，使得有機(jī)污染物在后續(xù)2 號(hào)～4 號(hào)格室繼續(xù)完成乙酸代謝，從而使得乙酸激酶活性升高。蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，而蛋白酶是一類(lèi)具有復(fù)雜功能結(jié)構(gòu)并能夠催化蛋白質(zhì)水解生成多肽及小分子氨基酸的酶，其活性可反映出污泥中微生物的新陳代謝和活動(dòng)能力[36]。由圖6 可知，各階段1 號(hào)～4號(hào)格室的蛋白酶活性總體趨勢(shì)為Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ，這與測(cè)定的EPS 的蛋白含量相關(guān)。2 號(hào)格室在第Ⅲ和Ⅳ階段的蛋白酶活性最高，分別為2.69 mg·g-1和3.14 mg·g-1。隨著進(jìn)水氮濃度提高，該反應(yīng)器各格室微生物需要通過(guò)水解作用產(chǎn)生更多的胞內(nèi)和胞外酶參與微生物的新陳代謝與調(diào)控[36]，第Ⅱ階段蛋白酶活性最低亦與溫度降低有關(guān)。由此表明進(jìn)水氮濃度的升高對(duì)該反應(yīng)器內(nèi)微生物蛋白酶活性造成的抑制作用不明顯，反而有利于提高蛋白酶活性，從而提高了該反應(yīng)器的脫氮效能。

圖5 不同氮濃度對(duì)EPS的多糖(a)和蛋白(b)含量的影響Fig.5 Effects of different nitrogen concentrations on polysaccharide(a)and protein(b)contents of EPS

圖6 不同氮濃度對(duì)關(guān)鍵酶活性的影響Fig.6 Effects of different nitrogen concentrations on key enzyme activities

2.6 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)該生物電化學(xué)-顆粒污泥反應(yīng)器運(yùn)行的第Ⅰ階段與提高進(jìn)水氮濃度后第Ⅳ階段的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，旨在從微生物角度揭示影響機(jī)制[23]，其結(jié)果如圖7和圖8所示。

圖7 門(mén)水平的菌群相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of microbial community at phylum level

由圖7可知，在門(mén)水平下，該反應(yīng)器運(yùn)行至第Ⅳ階段時(shí)，變形菌門(mén)（Protebaoteria）的相對(duì)豐度變化最為明顯，在各格室中分別減少了20.25%、15.07%、8.58%、11.12%和16.93%，但其仍是1 號(hào)、2 號(hào)和5 號(hào)格室的主導(dǎo)菌群，原因在于變形菌門(mén)（Protebaoteria）在碳源和氮素的代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，可能隨著進(jìn)水氮濃度不斷加大，對(duì)其產(chǎn)生了一定的抑制作用，也致使氮去除效果出現(xiàn)了小幅度下降。綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）在2 號(hào)格室（增加了9.85%）和4 號(hào)格室（減少了9.02%）變化較大，其能降解碳水化合物和微生物的細(xì)胞物質(zhì)，常出現(xiàn)在自養(yǎng)脫氮反應(yīng)器中[37]。厚壁菌門(mén)（Firmicutes）在1 號(hào)和5 號(hào)格室分別減少了3.27%和6.51%，而2 號(hào)、3 號(hào)和4 號(hào)格室分別增加了18.5%、8.36%和3.8%，其為1 號(hào)、2 號(hào)和3 號(hào)格室的優(yōu)勢(shì)菌群，原因可能是至第Ⅳ階段時(shí)，1 號(hào)格室承受的有機(jī)負(fù)荷過(guò)大，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）豐度降低，而2號(hào)～4號(hào)格室的豐度升高，以進(jìn)一步去除有機(jī)物，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）與脫氮效能緊密相關(guān)，其能在厭氧或有氧的環(huán)境下進(jìn)行反硝化過(guò)程，且有利于COD 的降解[38-39]。浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）則是在各格室有不同程度的增加，分別為2.2%、0.86%、3.47%、5.3%和25.09%，其中5號(hào)格室增加的豐度最高，為5 號(hào)格室的主導(dǎo)菌群。有研究表明，浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）具有脫氮功能，并隨反應(yīng)器內(nèi)負(fù)荷增大而增多[40]。

圖8 屬水平的菌群相對(duì)豐度Fig.8 Relative abundance of microbial community at genus level

由圖8可知，對(duì)屬水平而言，具有重要反硝化作用的脫氮菌陶厄氏菌屬（Thauera）和假單胞菌屬（Pseudomonas）在第Ⅳ階段時(shí)在各格室均有不同程度的減少[41-42]。陶厄氏菌屬（Thauera）在1 號(hào)格室明顯減少（8.64%），由于1 號(hào)格室的氮素負(fù)荷最高，故Thauera 相對(duì)豐度最高。但在第Ⅳ階段時(shí)，Pseudomonas 在1 號(hào)～3 號(hào) 格 室 出 現(xiàn) 減 少，分 別 由14.79%減少至0.69%、14.24%減少至0.36%、1.88%減少至0.03%，可能是氮素負(fù)荷的升高對(duì)Thauera 和Pseudomonas 產(chǎn)生了一定的抑制作用，尤其是對(duì)Pseudomonas，但氮污染物仍得以高效去除，表明該反應(yīng)器中其他脫氮菌群增多。其次變化較明顯的是不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），其是一種專(zhuān)性好氧的革蘭陰性桿菌[41]，在1 號(hào)、5 號(hào)格室的變化較明顯，分別由6.65%減少至0.06%、15.37%減少至0.01%。Acinetobacter 在第Ⅳ階段時(shí)相對(duì)豐度的降低與溫度有關(guān)，有研究表明，Acinetobacter 更喜好低溫環(huán)境[23]，而這亦可能與第Ⅲ和第Ⅳ階段的NO3--N 出水濃度略高相關(guān)。而具有產(chǎn)甲烷作用的甲烷絲狀菌屬（Methanothrix）與甲烷桿菌屬（Methanobacterium）分別在4 號(hào)格室增加了4.54% 和1 號(hào)格室增加了0.74%，其中Methanothrix 仍是4 號(hào)格室的優(yōu)勢(shì)菌屬（12.3%），也由此表明產(chǎn)甲烷菌能在該反應(yīng)器中與其他菌群聯(lián)營(yíng)共存。嗜堿菌屬（Alkaliphilus）在1 號(hào)格室減少，而在2 號(hào)～4 號(hào)格室中分別增加了1.24%、2.58%和1.95%，原因可能是由于1 號(hào)格室承受的負(fù)荷增大后，內(nèi)部有機(jī)酸物質(zhì)增多，抑制了Alkaliphilus的生長(zhǎng)。Levilinea 亦在2 號(hào)～4 號(hào)格室中增加較顯著，分別增加了1.88%、5.31%和5.78%，是3 號(hào)和4號(hào)格室的優(yōu)勢(shì)菌群。而具有產(chǎn)電性能的地桿菌屬（Geobacter）在陽(yáng)極室中分別減少了0.29%、1.36%、1.25%和2.54%，表明除Geobacter 外，還有其他產(chǎn)電菌存在；同時(shí)有研究表明，氮濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)對(duì)Geobacter有一定的抑制作用[43]。

3 結(jié) 論

（1）構(gòu)建了新型生物電化學(xué)-顆粒污泥反應(yīng)器，該反應(yīng)器在進(jìn)水NO3--N 和NO2--N 濃度分別為180 mg·L-1和80 mg·L-1時(shí)，其出水濃度分別為0.98 mg·L-1和0.1 mg·L-1，可實(shí)現(xiàn)對(duì)水中溶解性甲烷的利用；其中4號(hào)格室的輸出電壓最大，為608.1 mV，同時(shí)溫度對(duì)該反應(yīng)器的運(yùn)行有較大影響。

（2）反應(yīng)器中第Ⅱ階段5 號(hào)格室SMP、LB-EPS和TB-EPS 的多糖和蛋白含量最高；對(duì)于酶活性而言，1 號(hào)格室輔酶F420活性相對(duì)最低，進(jìn)水氮濃度的增大提高了污泥中蛋白酶活性，而溫度的降低使得后續(xù)格室污泥中乙酸激酶活性增大。

（3）隨著進(jìn)水氮濃度的增加，各格室變形菌門(mén)變化顯著，分別減少了20.25%、15.07%、8.58%、11.12%和16.93%，但仍為各格室的主要菌群，浮霉菌門(mén)則在各格室有不同程度的增加，5 號(hào)格室增加了25.09%；具有反硝化作用的陶厄氏菌屬和假單胞菌屬在第Ⅳ階段出現(xiàn)了減少，同時(shí)進(jìn)水氮濃度的增大，對(duì)地桿菌屬產(chǎn)生了一定的抑制作用。