張海華，董海泉，李慧，袁璐韞，方哲，程軍

（1 杭州環(huán)境集團有限公司，浙江杭州310022； 2 浙江大學國家清潔能源利用重點實驗室，浙江杭州310027）

引 言

生物甲烷是一種可替代化石燃料的綠色可再生能源，通過畜禽糞便、農(nóng)作物秸稈、廢棄食品等多種有機質(zhì)廢棄物厭氧發(fā)酵產(chǎn)生[1-3]。厭氧發(fā)酵是多種微生物協(xié)同生化代謝過程，產(chǎn)乙酸細菌和產(chǎn)甲烷菌之間的電子傳遞速率決定著整個系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷反應(yīng)速率[4]。在厭氧發(fā)酵過程中，氫分子由產(chǎn)乙酸細菌產(chǎn)生，后直接被產(chǎn)甲烷菌利用過程稱為種間氫傳遞（IHT）過程，IHT 是一種以氫氣分子為媒介的種間電子傳遞過程[5-6]。然而，系統(tǒng)中較低的氫分壓限制了產(chǎn)乙酸細菌和產(chǎn)甲烷菌之間氫擴散速率，從而限制了生物甲烷的生產(chǎn)[7-8]，所以研究種間電子傳遞過程是解決生物甲烷產(chǎn)生速率瓶頸的關(guān)鍵。

有研究表明，產(chǎn)乙酸細菌和產(chǎn)甲烷菌之間還存在著直接種間電子傳遞（DIET）過程，DIET 不是通過氫為電子載體實現(xiàn)的，可以解決系統(tǒng)中氫分壓限制的問題[9-15]。對DIET 過程研究主要有以下三方面：①利用納米導線的DIET作用。納米導線是一種導電菌毛，由六血紅素C型細胞色素OmcS頭尾堆疊而成[16]。納米導線在細胞外電子傳遞中起重要作用，能將電子轉(zhuǎn)移到三價鐵以及其他胞外電子受體中，包括腐殖質(zhì)[17]。微生物分泌的具有電化學活性的胞外聚合物，其中的腐殖質(zhì)，如類富里酸具有氧化還原能力，參與胞外到胞內(nèi)的電子交換過程[1,18]。②利用膜結(jié)合電子轉(zhuǎn)運蛋白的DIET 作用。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞色素c和多血紅素細胞色素OmcZ能夠參與到DIET 過程[19]。③利用導電材料的DIET 作用。厭氧發(fā)酵過程中添加導電材料，如活性炭等碳基材料能夠促進甲烷生成[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，碳納米管的加入能夠通過改變胞外聚合物（EPS）和膜結(jié)合電子轉(zhuǎn)運蛋白來增強種間電子傳遞過程[13]。

近年來，金屬-有機框架MOF 材料由于其大比表面積、多孔性、顆粒大小形狀可控等性質(zhì)備受關(guān)注[20-21]。Gargiulo 等[22]研究了鉻基MOF 材料用于厭氧發(fā)酵沼氣的提純凈化，由于MOF 材料的多孔親和性，能夠有效去除H2S等雜質(zhì)，具有很大的工業(yè)運用潛力。有研究通過對不同MOF 材料的導電和催化特性的分析比較，總結(jié)了MOF 和金屬-有機骨架復合材料在電化學領(lǐng)域的發(fā)展方向。然而，MOF 材料用于厭氧發(fā)酵促進產(chǎn)甲烷方面鮮有研究[23]。在MOF材料中，ZIF-8是鋅沸石咪唑鹽框架，碳化后的ZIF-8材料具有良好的導電性和磁性[21]。但是，碳化后的ZIF-8 材料用于厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中對DIET 的影響機理尚未清楚。因此，本文的主要工作是探究碳化后的ZIF-8材料促進厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物種間電子傳遞過程的機理。從產(chǎn)甲烷污泥導電性、細胞色素c 含量和具有電化學活性的胞外聚合物成分變化來分析碳化后ZIF-8材料對DIET作用的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 材料和接種物

碳化后的ZIF-8 材料（以下簡稱：ZIF-8 衍生多孔碳）的制備采用如下步驟。①將810 mg 六水合硝酸鋅和526 mg 二甲基咪唑分別加入盛有40 ml乙醇的兩個燒杯中；②混合兩個燒杯中溶液，攪拌均勻，在室溫（25℃）條件下，靜置12 h左右；③離心收集得到的ZIF-8粉末，用甲醇反復洗滌多次，在真空干燥箱中80℃的條件下干燥；④800℃的氮氣氛圍中加熱3 h 進行碳化處理；⑤用HF（10%）清洗除去粉末中的鋅納米顆粒，得到ZIF-8衍生多孔碳材料。

接種物為厭氧產(chǎn)甲烷污泥，來自于浙江省杭州市環(huán)境集團厭氧發(fā)酵罐，在(37.0±1.0)℃的條件下，重復富集3 次，每次7 d，得到富含甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）和甲烷絲菌屬（Methanothrix）的混合厭氧產(chǎn)甲烷菌污泥[24]。實驗中的富集培養(yǎng)液成分如下[25]：MgCl2·6H2O，0.2 g/L；K2HPO4，0.4 g/L；L-半胱氨酸，0.5 g/L；酵母膏，2 g/L；蛋白胨，2 g/L；氨三乙酸，10 g/L；微量元素液，10 ml/L；維生素液，10 ml/L。

1.2 厭氧發(fā)酵實驗

實驗設(shè)置四個實驗組和一個對照組。發(fā)酵瓶內(nèi)工作體積為200 ml，包含40 ml培養(yǎng)液、160 g 接種物和0.85 ml的乙醇作為發(fā)酵底物，實驗組中分別加入0（對照組）、50、100 和200 mg/L 的ZIF-8 衍生多孔碳材料，空白組中無乙醇底物和ZIF-8 衍生多孔碳材料的加入。所有發(fā)酵瓶初始pH 調(diào)整到8.0 左右，通氮氣5 min 左右，連接至AMPTS Ⅱ系統(tǒng)（Bioprocess Control，瑞典）中，發(fā)酵溫度設(shè)定為37℃，每三天取1 ml 發(fā)酵液用于液相成分測試。氣相數(shù)據(jù)從AMPTS Ⅱ系統(tǒng)中下載，液相數(shù)據(jù)從氣相色譜儀（GC-FID）分析得到。乙醇發(fā)酵實驗在AMPTS Ⅱ系統(tǒng)上進行，AMPTS Ⅱ系統(tǒng)如圖1 所示，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2基本被NaOH 溶液完全吸收，實驗結(jié)果得到氣體數(shù)據(jù)中甲烷體積組分為100%。

圖1 AMPTS Ⅱ厭氧發(fā)酵系統(tǒng)Fig.1 AMPTS Ⅱanaerobic digestion system

1.3 微生物和ZIF-8衍生多孔碳材料微觀表征

場發(fā)射掃描電鏡（SEM，Hitachi SU-8010，日本）用于觀察ZIF-8 衍生多孔碳材料的微觀形態(tài)以及ZIF-8 衍生多孔碳和產(chǎn)甲烷菌群之間的物理聯(lián)系。ZIF-8 衍生多孔碳材料的平均粒徑通過ImageJ 軟件在SEM 圖像中選取約200 個顆粒測量統(tǒng)計分析得到。掃描電鏡-能量色散光譜（SEM-EDS）用于表征合成ZIF-8 衍生多孔碳材料中的元素組成成分。ZIF-8 衍生多孔碳材料表征分析見附錄，ZIF-8衍生多孔碳的平均粒徑約為1.76 μm，比表面積為1727 m2/g，孔容積為0.758 cm3/g，孔徑為1.076 nm。

1.4 電化學分析

電化學分析用于測試發(fā)酵實驗中加入ZIF-8衍生多孔碳后厭氧產(chǎn)甲烷污泥的導電性變化。取發(fā)酵瓶中的混合污泥樣品，8000 r/min離心5 min，沉淀物用0.1 mol/L NaCl 溶液洗滌三次。采用三探針電導率測量污泥導電性，污泥樣品置于絕緣間隙中連接兩邊的金片，導電探針分別接觸兩金片電極以連通整個電路，電化學工作站施加的電壓范圍為-1.05～1.05 V，梯度為0.025 V[26]。利用得到的電壓電流值擬合得到污泥的電導率，計算公式如下：

式中，σ 表示厭氧產(chǎn)甲烷污泥電導率，S/m；L 表示間隙的寬度,m；R 表示電流伏安曲線中斜率的倒數(shù)，Ω；S表示橫截面積，m2。

1.5 細胞色素c測試方法

細胞色素c 的濃度定義為微生物中單位質(zhì)量總蛋白中細胞色素c 的質(zhì)量。采用SDS-苯酚萃取法從發(fā)酵瓶中的混合污泥樣品提取蛋白，提取步驟簡述如下：細胞破碎（0.25 mol/L 檸檬酸，1% SDS，Tris飽和酚，0.1 mol/L 乙酸銨甲醇溶液），沉淀，溶解（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，2% 3-[(3-氯胺丙基)二甲基胺]-1-丙磺酸鹽，65 mmol/L 二硫代蘇糖醇）。提取得到的蛋白利用ELISA 試劑盒（Lanpai Bio，中國）測定細胞色素c濃度[9]。

1.6 三維熒光光譜分析胞外聚合物

三維熒光光譜法用于分析加入ZIF-8衍生多孔碳后產(chǎn)甲烷微生物EPS 的變化情況。EPS 的提取采用改進的加熱法[25]。三維熒光光譜儀（Horiba JY Aqualog）設(shè)置激發(fā)Ex波長范圍200～450 nm，增量為5 nm，掃描Em波長范圍250～550 nm，增量為5 nm。根據(jù)Ex/Em波長的值，可以將三維熒光光譜分為五個區(qū)域[27]，每個區(qū)域代表EPS 內(nèi)的一種有機物。各有機物的相對濃度由熒光響應(yīng)百分比表示[28-29]：

式中，φi代表熒光光譜區(qū)域的熒光體積；Δλex代表激發(fā)波長間隔（取5 nm）；Δλem代表發(fā)射波長間隔（取5 nm）；I(λexλem)代表每個激發(fā)發(fā)射波長對的熒光強度；φT代表熒光光譜下的累積體積。不同地區(qū)的熒光光譜頻譜與φT和φi的數(shù)值密切相關(guān)。

2 實驗結(jié)果和討論

2.1 ZIF-8 衍生多孔碳對厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷能力的影響

圖2 添加不同濃度ZIF-8衍生多孔碳對甲烷產(chǎn)量及產(chǎn)率的影響Fig.2 Methane yield and production rate with the addition of various concentrations of ZIF-8 derived porous carbon

表1 添加不同濃度ZIF-8衍生多孔碳時利用乙醇發(fā)酵產(chǎn)甲烷的動力學參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of fermentative methane production from ethanol with various concentrations of ZIF-8 derived porous carbon addition

圖3 厭氧發(fā)酵液相代謝產(chǎn)物分析Fig.3 Analysis of liquid metabolites in anaerobic digestion

在乙醇發(fā)酵產(chǎn)甲烷實驗中，不同濃度的ZIF-8衍生多孔碳的加入對甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷速率的影響如圖2 所示。隨著ZIF-8 衍生多孔碳添加量的增加，對應(yīng)的甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷峰值速率都呈現(xiàn)升高趨勢。尤其在加入200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳時，甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷峰值速率達到最大，分別為(569.10±13.99) ml/g 和(31.39±0.52) ml/(g·d)（以乙醇計）。與未添加ZIF-8衍生多孔碳的對照組相比，甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷峰值速率分別增加了18.81%和19.04%。利用Gompertz 公式對甲烷產(chǎn)率進行擬合得到的動力學參數(shù)如表1 所示，擬合結(jié)果表明隨著ZIF-8 衍生多孔碳添加量的增加，對應(yīng)的甲烷產(chǎn)率和產(chǎn)甲烷峰值速率都明顯增加，與實驗結(jié)果一致。在添加200 mg/L 的ZIF-8 衍生多孔碳時，甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷峰值速率分別達到628.40 ml/g和32.71 ml/(g·d)，相比對照組分別提高了19.3%和12.1%。說明ZIF-8衍生多孔碳的加入在一定程度上強化了發(fā)酵產(chǎn)甲烷能力，其強化的原因主要有兩點：①ZIF-8衍生多孔碳材料具有較大比表面積，有利于產(chǎn)甲烷微生物附著和富集；②ZIF-8 材料經(jīng)過碳化后具有導電性，有利于微生物的種間電子傳遞過程。

圖4 厭氧發(fā)酵結(jié)束后的產(chǎn)甲烷污泥SEM圖Fig.4 SEM images of methanogenic sludge after anaerobic digestion

在乙醇厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中，主要包括乙醇酸化和乙酸產(chǎn)甲烷兩個過程。由圖3(a)看出，在第6天實驗組中乙醇被完全消耗，說明乙醇酸化過程已全部結(jié)束。在加入不同濃度的ZIF-8 衍生多孔碳后，乙醇的降解速率快于對照組，說明ZIF-8衍生多孔碳促進了乙醇的酸化降解過程。由圖3(b)可知，第6天乙酸含量達到最高，后不斷降低，這是因為乙醇已全部酸化生成乙酸，而后乙酸被消耗用于產(chǎn)甲烷。添加200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳實驗組中，乙酸含量最高為62.37 mmol/L，是對照組的1.35 倍。6 d后，乙酸消耗速率隨著添加ZIF-8衍生多孔碳濃度的增加而加快。通過液相代謝產(chǎn)物中乙醇和乙酸動態(tài)含量的分析，表明ZIF-8 衍生納米多孔碳同時促進乙醇酸化和乙酸產(chǎn)甲烷兩個過程。

2.2 微生物表面形態(tài)分析

乙醇產(chǎn)甲烷發(fā)酵結(jié)束后，取添加0 和200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳的厭氧產(chǎn)甲烷污泥用于SEM 觀察，可以分析ZIF-8 衍生多孔碳和產(chǎn)甲烷微生物之間表面結(jié)合情況。如圖4(a)所示，在未添加ZIF-8衍生多孔碳的對照組中，可以觀察到桿狀和球狀微生物表面光滑均勻，分布較獨立。在加入200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳之后，通過對厭氧產(chǎn)甲烷污泥樣本不同位置的觀測[圖4(b)]，明顯觀察到球狀產(chǎn)甲烷微生物主要聚集在ZIF-8 衍生多孔碳顆粒周圍，并且附著在材料表面上。如圖4(c)所示，球狀產(chǎn)甲烷菌表面還出現(xiàn)了類似于“納米導線”狀的胞外聚合物，使產(chǎn)甲烷菌和ZIF-8 衍生多孔碳之間結(jié)合更緊密。SEM 分析結(jié)果表明ZIF-8衍生多孔碳對于產(chǎn)甲烷菌起到較好的固定化作用，而且“納米導線”的大量出現(xiàn)，有利于促進DIET過程。

2.3 厭氧產(chǎn)甲烷污泥的導電性

添加ZIF-8衍生多孔碳有利于提高厭氧產(chǎn)甲烷污泥的導電性。如圖5所示，乙醇發(fā)酵實驗結(jié)束后，未添加ZIF-8 衍生多孔碳的對照組污泥電導率為7.93 μS/cm，加入200 mg/L ZIF-8衍生多孔碳后電導率提高了84.6%，為14.64 μS/cm。其中對照組污泥去除EPS 后的系統(tǒng)電導率為1.37 μS/cm，加入200 mg/L ZIF-8衍生多孔碳的實驗組去除EPS 后系統(tǒng)電導率為6.28 μS/cm，提高了3.58 倍。以上結(jié)果說明加入ZIF-8衍生多孔碳后能夠顯著提高產(chǎn)甲烷污泥導電性，一方面是由于ZIF-8 衍生多孔碳本身的導電性，另一方面可能是由于外加的ZIF-8 衍生多孔碳通過刺激EPS的成分變化來提高微生物胞外電子傳遞能力。

圖5 厭氧發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)甲烷污泥電導率Fig.5 Conductivity of methanogenic sludge after anaerobic digestion

細胞色素c 在厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的過程中起到電子傳遞作用[19,30-31]。如圖6 所示，隨著加入ZIF-8 衍生多孔碳濃度的增加，厭氧產(chǎn)甲烷污泥中總蛋白質(zhì)濃度由0.605 g/L 提高到0.868 g/L（以懸浮污泥計），說明ZIF-8 衍生多孔碳提高了微生物的富集，起到固定化作用。然而，細胞色素c 濃度降低，添加200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳的實驗組c-Cyt 濃度最低，為0.261 mg/g（以蛋白質(zhì)計），相比對照組降低了26.1%。這是因為ZIF-8 衍生多孔碳具有良好的導電性，在一定程度上代替了細胞色素c 的電子傳遞作用。

2.4 ZIF-8衍生多孔碳材料對EPS的影響

圖6 乙醇發(fā)酵結(jié)束后厭氧產(chǎn)甲烷污泥中總蛋白質(zhì)濃度和細胞色素c 濃度變化Fig.6 Changes of total protein and c-Cyts’concentration in methanogenic sludge after anaerobic digestion

在乙醇發(fā)酵產(chǎn)甲烷的過程中，具有氧化還原活性的EPS 的存在有利于微生物胞外電子傳遞過程，提高產(chǎn)甲烷能力。如圖7 所示，三維熒光光譜分析將EPS 中有機物分為五個區(qū)域。區(qū)域（1）酪氨酸類蛋白和區(qū)域（4）可溶性微生物副產(chǎn)物是可生物降解的，區(qū)域（2）色氨酸類蛋白、區(qū)域（3）類富里酸和區(qū)域（5）類胡敏酸不可降解，具有氧化還原能力，能夠參與到微生物胞外電子傳遞過程中[32-34]。表2 中根據(jù)三維熒光光譜的計算結(jié)果得出，添加200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳的實驗組中，區(qū)域（1）酪氨酸類蛋白和區(qū)域（4）可溶性微生物副產(chǎn)物相對含量均有所下降，區(qū)域（3）類富里酸相對含量由18.0%提高到23.6%，說明添加ZIF-8衍生多孔碳提高了微生物的降解能力以及通過類富里酸分子介導的胞外電子傳遞效率。

2.5 ZIF-8 衍生多孔碳材料強化產(chǎn)甲烷過程機理分析

在乙醇厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷實驗中添加ZIF-8 衍生多孔碳后，系統(tǒng)中甲烷產(chǎn)量、最大產(chǎn)甲烷速率、乙醇酸化速率以及乙酸的生成消耗速率均有不同程度的提高。ZIF-8 衍生多孔碳材料強化生物發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程的機理示意如圖8 所示。ZIF-8 衍生多孔碳材料較大的比表面積起到菌群固定化作用，并且促進納米導線產(chǎn)生。其良好的導電性強化了產(chǎn)乙酸細菌和產(chǎn)甲烷古菌之間的種間電子傳遞過程，種間電子傳遞的強化使得CO2和乙酸等代謝加快，從而達到強化乙醇發(fā)酵產(chǎn)甲烷的效果。

3 結(jié) 論

（1）實驗結(jié)果表明，ZIF-8 衍生多孔碳強化厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷能力，添加200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳時，甲烷產(chǎn)量和最大產(chǎn)甲烷速率分別增加了18.81%和19.04%。

（2）厭氧產(chǎn)甲烷污泥的SEM 表明ZIF-8 衍生多孔碳起到菌群固定化作用，并且能促進納米導線產(chǎn)生。

表2 基于三維熒光光譜圖的各熒光區(qū)域百分比參數(shù)Table 2 Parameters of five fluorescent regions based on the 3D-EEM spectrogram

圖7 微生物胞外聚合物三維熒光光譜分析Fig.7 3D-EEM analysis of microbial extracellular polymeric substance

（3）添加200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳時，去除EPS 的系統(tǒng)導電性提高了3.58 倍，而細胞色素c 含量降低了26.1%，說明ZIF-8 衍生多孔碳具有良好的導電性，并且能在一定程度上代替細胞色素c 的電子傳遞作用。

（4）三維熒光光譜分析表明ZIF-8 衍生多孔碳的加入提高了微生物的降解能力以及通過類富里酸分子介導的胞外電子傳遞效率。

符 號 說 明

Em——掃描波長，nm

Ex——激發(fā)波長，nm

Hm——最大產(chǎn)甲烷潛力，ml/g

I(λexλem)——激發(fā)發(fā)射波長對的熒光強度

L——間隙的寬度，m

圖8 ZIF-8衍生多孔碳材料強化生物甲烷化過程機制示意圖Fig.8 The enhanced mechanism of bio-methanation with ZIF-8 derived porous carbon materials

R——電流伏安曲線中斜率的倒數(shù)，Ω

Rm——產(chǎn)甲烷峰值速率，ml/(g·d)

S——橫截面積，m2

Tm——產(chǎn)甲烷峰值時間，h

λ——產(chǎn)甲烷遲滯時間，h

Δλem——掃描波長間隔，nm

Δλex——激發(fā)波長間隔，nm

σ——厭氧產(chǎn)甲烷污泥電導率，S/m

φi——熒光光譜區(qū)域的熒光體積

φT——熒光光譜下的累積體積