王曉楠，徐 暉，張文博

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 大連 116011；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，哈爾濱 150081；3.南崗區(qū)疾病預(yù)防控制中心，哈爾濱 150000

碳青霉烯類藥物被認(rèn)為是治療多重耐藥革蘭氏陰性桿菌感染的最后手段。隨著碳青霉烯類藥物在臨床上的應(yīng)用越來越多，碳青霉烯類抗菌藥物耐藥現(xiàn)象也日益增加。自2010年以來，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Crabapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的流行情況惡化，CRKP繼續(xù)在歐洲醫(yī)院蔓延，特別是在地中海地區(qū)。2012年中國的檢出率顯著高于美國［1］。肺炎克雷伯菌主要引起肺炎，肺外感染也并非少見，如尿路感染，膽道感染，菌敗血癥等，其中菌敗血癥病情兇險，病死率高達(dá)37%～50%，故本實驗選擇研究大連地區(qū)血流感染（Bloodstream Infection，BSI）耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥特征，為臨床抗生素的選擇提供依據(jù)，降低CRKP-BSI相關(guān)的發(fā)病率和死亡率。同時在流行病學(xué)分析上也是有意義的。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2017年1月—2018年12月在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者的血流感染肺炎克雷伯菌206株。這些患者的病歷特點是臨床上驟發(fā)寒戰(zhàn)，有高熱表現(xiàn)，進(jìn)行血培養(yǎng)檢測，血培養(yǎng)檢測結(jié)果顯示肺炎克雷伯菌感染呈陽性。納入標(biāo)準(zhǔn)：血液培養(yǎng)分離的致病菌為肺炎克雷伯菌，半年內(nèi)同一患者有多次（2次及以上）肺炎克雷伯菌的血流感染，取首次感染菌株；并且達(dá)到血流感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，參照2016年美國CDC［2］；年齡大于等于18周歲患者。將感染碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌作為實驗研究組（CRKP組），共55例；感染對碳青霉烯類藥物敏感的肺炎克雷伯菌（Carbapenem susceptible Klebsiella pneumoniae，CSKP）作為實驗對照組（CSKP組），共151例。查閱病歷資料包括患者性別、年齡等基礎(chǔ)信息，所患主要疾病以及住院過程中全部診療記錄，同時進(jìn)行上述一般資料各參數(shù)間的統(tǒng)計分析，證實差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

鑒于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院是大連市規(guī)模最大的綜合性醫(yī)院，患者主要來自大連市不同縣區(qū)，206例患者中，1例來自長?？h，9例來自莊河，28例來自普蘭店，17例來自瓦房店，151例來自大連市內(nèi)四區(qū)。因此，實驗結(jié)果可以代表大連地區(qū)的流行情況。

1.2 質(zhì)控菌株

大腸埃希菌 ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603，銅綠假單胞菌ATCC27853，以上菌株均由衛(wèi)生部臨檢中心提供。

1.3 實驗儀器及試劑

HF safe-1200型生物安全柜（力康發(fā)展有限公司，中國）、BACTEC FX-200/9240型全自動血培養(yǎng)儀（美國Becton Dickinson公司）、CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）、Microscan Walk-Away 96plus全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀及配套試劑（德國Siemens公司）、舒普森（頭孢哌酮/舒巴坦）藥敏紙片（英國Oxoid公司）等。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定及藥敏實驗方法

菌株鑒定及藥敏實驗采用MicroScan Walkaway 96 plus全自動微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)完成，參照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI 2017版）的標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。頭孢哌酮/舒巴坦采用K-B紙片擴散法測定，方法如下：（1）制備菌懸液：將培養(yǎng)后的純菌落用無菌棉簽蘸取適量，溶解于2 ml無菌生理鹽水中，混勻后用比濁儀校準(zhǔn)濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫取＃?）無菌棉簽蘸取適量上述0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，于MH瓊脂培養(yǎng)基表面均勻涂布接種，每次接種涂布時，將平板旋轉(zhuǎn)60°，連續(xù)涂布接種3次，最后沿著平板邊緣再涂抹2周。（3）貼藥敏紙片：將接種好的MH培養(yǎng)基在室溫下放置3～5 min，按照實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，用無菌鑷子取藥敏紙片，將其貼于瓊脂表面。操作時注意紙片不能過于貼近平板邊緣，其中心需距離平板邊緣大于等于15 mm。（4）孵育：將接種好的培養(yǎng)基于15 min內(nèi)放置恒溫培養(yǎng)箱孵育，孵育時間16～24 h。（5）結(jié)果判讀：用游標(biāo)卡尺（精確度為1 mm）測量抑菌環(huán)直徑，以肉眼不能明顯見到菌落生長區(qū)域為抑菌環(huán)邊緣，根據(jù)測得的抑菌環(huán)直徑大小來判斷該菌株對相應(yīng)抗生素的敏感性，結(jié)果根據(jù)美國實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會CLSI2017版所提供的肺炎克雷伯菌的抑菌環(huán)直徑解釋判讀。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

將收集的數(shù)據(jù)運用Excel表格進(jìn)行整理，計算構(gòu)成百分比。然后采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對其進(jìn)行統(tǒng)計，計算χ2值及P值，進(jìn)行差異性分析，當(dāng)P＜0.05時提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯類抗生素耐藥與敏感菌株耐藥性

圖1、表1顯示血流感染CRKP的分離率為26.70%（55/206），CSKP分離率為73.30%（151/206）。碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌對以下21種抗生素的耐藥率均大于敏感株，有顯著性差異（P＜0.05）。相比之下，CRKP對氨基糖苷類抗生素阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素耐藥率較低，分別為52.73%、67.27%、70.91%。

圖1 CRKP和CSKP對常用抗菌藥物的耐藥率柱狀圖示

表1 2017-2018年血液分離CRKP和CSKP對常用抗菌藥物的耐藥性 例%

2.2 耐藥性分析

從圖2可以看出除頭孢曲松外，血流感染肺炎克雷伯菌對其它20種抗生素耐藥率2018年比2017年均有所降低。

圖2 2017、2018年血液分離肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥率（%）柱狀圖示

表2、圖2中的206株肺炎克雷伯菌藥敏分析結(jié)果顯示：2017年、2018年該菌對哌拉西林的耐藥率最高，2017年為66.98%、2018年為61%；對氨基糖苷類阿米卡星的耐藥率表現(xiàn)為最低，2017年為18.87%、2018年為13.00%；在對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的敏感性方面，該菌對頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的敏感度要優(yōu)于氨芐西林/舒巴坦和替卡西林/棒酸。2017年頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為32.08%，哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率為34.90%，氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為42.45%，替卡西林/棒酸的耐藥率為44.34%，2018年頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率均為29.00%，氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為40.00%，替卡西林/棒酸的耐藥率為39.00%。對比2017年和2018年，該菌對頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢西丁和妥布霉素、慶大霉素的耐藥率有顯著性差異，此五種抗生素的耐藥率2018年較2017年有所降低，對其余16種抗生素的耐藥率均無顯著性差異。

2.3 血流感染肺炎克雷伯菌碳青霉烯類抗生素耐藥與敏感的生存分析

206株血流感染肺炎克雷伯菌28天的總死亡率為20.39%（42例），碳青霉烯類耐藥組的死亡率為50.90%（28例），而碳青霉烯類抗生素敏感組的死亡率為9.27%（14例），統(tǒng)計分析結(jié)果顯示血流感染肺炎克雷伯菌碳青霉烯類抗生素耐藥組患者28天死亡率明顯高于碳青霉烯類抗生素敏感組患者，P＜0.05，有顯著性差異，見圖3。

圖3 感染CRKP和CSKP患者的生存曲線分析

3 討論

鑒于肺炎克雷伯菌對氨芐西林天然耐藥，以及替加環(huán)素的使用說明，替加環(huán)素主要是用于呼吸系統(tǒng)的感染，不適于血流感染，故本研究未做氨芐西林和替加環(huán)素的藥敏實驗。研究結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌對頭孢西丁的耐藥率較其他頭孢菌素類抗生素耐藥率低，2017年為36.79%，2018年為28%。對碳青霉烯類抗生素、氨基糖苷類抗生素阿米卡星保持較低的耐藥率。這與文獻(xiàn)報道的國內(nèi)其他地區(qū)檢測的肺炎克雷伯菌的耐藥性結(jié)果基本一致［3-7］。在對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的敏感性方面，該菌對頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的敏感度要優(yōu)于氨芐西林/舒巴坦和替卡西林/棒酸。從圖2柱狀圖可以直觀看出該菌株對上述20種抗生素的耐藥率2018年較2017年均有所降低，分析原因，醫(yī)院的檢驗科對患者的耐藥情況進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，并及時與院感科和臨床進(jìn)行反饋溝通。院感科嚴(yán)格進(jìn)行院內(nèi)感染的監(jiān)測，控制感染，同時加強對臨床醫(yī)生抗生素合理使用的培訓(xùn)。臨床醫(yī)生在治療過程中對抗生素使用更加慎重，摒棄了以往濫用的行為，取而代之的是積極治療患者原發(fā)疾病，盡可能減少侵襲性操作，在必要的侵襲性操作過程中，盡量降低感染風(fēng)險?；颊咴卺t(yī)生的宣教下，通過飲食、鍛煉、合理規(guī)律的作息來不斷提高自身免疫力，同時積極配合醫(yī)生的治療，陪護人員也能注意手衛(wèi)生。本研究僅選擇了近兩年符合條件的樣本，后期將繼續(xù)跟蹤，加大樣本量進(jìn)行耐藥特征相關(guān)性試驗，探索耐藥率降低的具體原因，但是實驗結(jié)果可以說明本地區(qū)血流感染肺炎克雷伯菌的耐藥情況得到了有效的控制。

表2 2017-2018年血液分離肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的耐藥性分析 例%

本實驗從大連地區(qū)206例血流感染肺炎克雷伯菌中分離出耐碳青霉烯類抗生素菌株共55株，百分率為26.70%（55/206），這與國內(nèi)研究結(jié)果基本一致［8］。研究結(jié)果表明，CRKP對氨基糖苷類抗生素阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素耐藥率相對較低，分別為52.73%、67.27%、70.91%，臨床上對于CRKP建議采取聯(lián)合用藥，增強藥物間潛在的協(xié)同作用，減緩耐藥性，降低不良反應(yīng)。

CRKP對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥機制復(fù)雜，包括產(chǎn)碳青霉烯酶、高產(chǎn)AmpC酶或ESBLs、外膜蛋白的缺失、高表達(dá)的主動外排泵系統(tǒng)，其中產(chǎn)生碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類藥物的主要耐藥機制，故以后的研究將補充耐藥基因?qū)嶒?。本實驗僅選取了2017年和2018年兩年的研究數(shù)據(jù)，日后會持續(xù)研究，擴大樣本量，全面了解本地區(qū)耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌耐藥趨勢與特征，完善實驗結(jié)果。