黃錦，劉佳淑，劉勝鳳，敬巧，劉玉娟

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川南充 637000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖道中常見的惡性腫瘤之一。早期患者的5年生存率超過90%，而晚期以侵襲性轉(zhuǎn)移的發(fā)生和高復(fù)發(fā)率為特征，因此晚期子宮內(nèi)膜癌患者的5年生存率降至20%以下[1-2]。近年來研究表明，微小RNA(microRNA)與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，可參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中，故而有望成為腫瘤診斷和治療的新型標(biāo)志物[3]。miR-873作為一類微小RNA，在食管癌和肝癌中均有不同程度的異常表達(dá)[4-5]，但其在子宮內(nèi)膜癌中作用機(jī)制的研究報(bào)道少見。因此，本研究旨在探討miR-873在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及對(duì)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖和侵襲的影響，從而為子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料

1.1標(biāo)本來源 收集2016年1月至2020年1月于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的88例子宮內(nèi)膜癌患者手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌組織，患者年齡(49.7±10.0)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)[6]：經(jīng)病理檢查證實(shí)為子宮內(nèi)膜癌；術(shù)前未接受化療及放療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤患者。臨床資料中肌層浸潤深度：≥1/2肌層22例，<1/2肌層66例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，其中累及淋巴管15例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期：Ⅰ～Ⅱ期66例，Ⅲ～Ⅳ期22例；組織學(xué)類型：Ⅰ型78例，Ⅱ型10例；分化程度：低分化34例，中高分化54例。另收集同期因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)的60例患者正常子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照組，患者年齡(50.6±9.8)歲。兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.566，P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2015ER117-1)，患者及家屬知情同意。

1.2細(xì)胞系、主要試劑及儀器 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa(武漢博士德公司)。DMEM、胎牛血清、DMSO、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，miRNA提取試劑盒、miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒、miRNA cDNA合成試劑盒(大連寶生物公司)，MTT試劑(上海東仁化學(xué)科技公司)，結(jié)晶紫(美國Sigma公司)，Matrigel(美國BD公司)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Epitomics公司)，miR-873模擬物(miR-873 mimic)及模擬物陰性對(duì)照(miR negative control，miR-NC,廣州市銳博公司)。Transwell小室(美國Millipore公司)，ACB-4A1超凈工作臺(tái)(新加坡Esco公司)，3110型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，QuantStudioTM12K Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR(美國Life technologies公司)，SpectraMax M5酶聯(lián)儀(美國Molecular device公司)，IX71正置/倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將Ishikawa細(xì)胞加入至含10%胎牛血清的DMEM中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染前1 d接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合度達(dá)30%～50%時(shí)，利用Lipofectamine 2000將miR-873 mimic和陰性對(duì)照(miR-NC)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，并分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-873過表達(dá)組。其中,空白對(duì)照組：細(xì)胞不做處理，正常培養(yǎng);陰性對(duì)照組：按照Lipofectamine 2000說明書將miR-NC轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L，每孔轉(zhuǎn)染2 mL；miR-873過表達(dá)組：按照Lipofectamine 2000說明書將miR-873 mimic轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L，每孔轉(zhuǎn)染2 mL。轉(zhuǎn)染6 h后更換為含10%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 取大小約為0.5 cm×1.0 cm的子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織，于液氮中進(jìn)行充分研磨，另取各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞約1×106個(gè)，采用miRNA提取試劑盒提取組織及細(xì)胞中miRNA，使用SpectraMax M5酶聯(lián)儀檢測(cè)吸光度(A260/280 nm)值為1.8～2.1的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取2 μL miRNA，按照miRNA cDNA合成試劑盒說明書操作獲得cDNA，置于-20 ℃保存。根據(jù)NCBI中GenBank提供的miR-873(序列號(hào)：NC_000009.12)，U6(序列號(hào)：NC_000898.1)基因序列，由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成引物。采用miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)組織及細(xì)胞中miR-873的表達(dá)水平，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括：5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 12 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；在60 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)，并用QuantStudioTM12K Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR自帶軟件進(jìn)行熔解曲線分析，以U6作為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-873的表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.3.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 采用12.5 g/L胰蛋白酶將各組細(xì)胞消化并接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(按3 000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種)，每孔培養(yǎng)液總體積為100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁，更換為新的DMEM培養(yǎng)基，每孔加入混有10% MTT檢測(cè)試劑的培養(yǎng)液，37 ℃溫育1 h，從培養(yǎng)箱取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板室溫平衡后分別于24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)，采用SpectraMax M5酶聯(lián)儀在波長490 nm處檢測(cè)各孔吸光度(A490 nm)值，計(jì)算平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 取各組轉(zhuǎn)染后的Ishikawa細(xì)胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106/mL，接種于Transwell小室的上室中，在小室下室加入300 μL含胎牛血清的DMEM，37 ℃溫育24 h。用無菌棉簽輕輕擦拭上室中的上層細(xì)胞，擦拭干凈后用0.2%結(jié)晶紫染色10 min，棄去染液，PBS清洗5 min，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中miR-873的表達(dá)水平 與正常子宮內(nèi)膜組織(1.07±0.04)比較，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-873的表達(dá)水平(0.52±0.12)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=34.199，P<0.05)。

2.2miR-873表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌患者癌組織中miR-873的表達(dá)水平與肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期有關(guān)(t分別為11.557、9.626、7.923，P均<0.05)；而與年齡、分化程度、組織類型無關(guān)(t分別為0.407、0.381、0.536，P均>0.05)，見表2。

表2 miR-873表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-873的表達(dá)水平 與空白對(duì)照組(0.51±0.02)和陰性對(duì)照組(0.51±0.01)比較，miR-873過表達(dá)組中miR-873的表達(dá)水平(1.38±0.02)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5 855.962，P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功；進(jìn)一步行組間兩兩比較結(jié)果顯示，miR-873過表達(dá)組miR-873的表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為93.985、93.448，P均<0.05)，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.537，P>0.05)。

2.4MTT法檢測(cè)各組Ishikawa細(xì)胞的增殖能力 與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染24 h后miR-873過表達(dá)組細(xì)胞增殖受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；進(jìn)一步行組間兩兩比較結(jié)果顯示，miR-873過表達(dá)組在24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)的細(xì)胞增殖水平顯著低于空白對(duì)照組(t分別為5.908、15.995、19.913、30.242，P均<0.05)和陰性對(duì)照組(t分別為5.514、14.715、19.048、28.542，P均<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為0.394、1.280、0.866、1.699，P均>0.05)。見圖1。

注：與空白對(duì)照組比，*，P<0.05；與陰性對(duì)照組比，#，P<0.05。

2.5Transwell試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力 各組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染24 h后行Transwell試驗(yàn)，結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，miR-873過表達(dá)組細(xì)胞穿膜數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.553，P<0.05)；進(jìn)一步行組間兩兩比較結(jié)果顯示，miR-873過表達(dá)組細(xì)胞穿膜數(shù)顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為7.571、7.227，P均<0.05)，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.344，P>0.05)。見圖2。

注：A，陰性對(duì)照組；B，空白對(duì)照組；C，miR-873過表達(dá)組。

3 討論

研究表明，結(jié)腸癌[7]、肝細(xì)胞癌[8]、非小細(xì)胞肺癌[9]等惡性腫瘤中miR-873的表達(dá)均降低，提示其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。Lin等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-873在原發(fā)性胃癌組織中下調(diào)，在胃癌進(jìn)展過程中起到腫瘤抑制作用。本研究結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-873的表達(dá)水平與正常子宮內(nèi)膜組織相比顯著降低，提示miR-873可能在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展過程中發(fā)揮抑癌基因的功能。進(jìn)一步對(duì)miR-873的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-873低表達(dá)與肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和國際婦產(chǎn)聯(lián)合會(huì)FIGO分期有關(guān)。肌層浸潤深度≥1/2肌層、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期的子宮內(nèi)膜癌患者組織中miR-873的表達(dá)水平顯著低于肌層浸潤深度<1/2肌層、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及Ⅰ～Ⅱ期的子宮內(nèi)膜癌患者組織，提示miR-873低表達(dá)可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌患者病情的進(jìn)展。

miRNA廣泛存在于真核生物中，在細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、遷移等生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-873-5p在甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-873-5p可抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Liang等[13]研究表明，miR-873在宮頸癌組織中呈低表達(dá)；miR-873的上調(diào)明顯抑制了人宮頸癌C33a細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，但在SiHa細(xì)胞中下調(diào)的miR-873呈現(xiàn)相反的結(jié)果。為探討miR-873對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響，本研究采用Lipofectamine 2000將miR-873 mimc瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，結(jié)果顯示miR-873過表達(dá)組miR-873表達(dá)水平明顯增加，提示轉(zhuǎn)染成功。筆者進(jìn)一步通過增殖與侵襲試驗(yàn)檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞增殖和侵襲能力，結(jié)果顯示miR-873過表達(dá)組細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯減弱，提示過表達(dá)miR-873能明顯抑制Ishikawa細(xì)胞增殖和侵襲能力。

綜上所述，miR-873在人子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá)，通過上調(diào)miR-873表達(dá)可抑制Ishikawa細(xì)胞增殖和侵襲的能力，初步明確miR-873在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。但本研究仍存在以下不足之處：(1)本研究中的臨床樣本較少，且未進(jìn)行預(yù)后分析；(2)本研究只是初步明確miR-873在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，沒有進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)及相關(guān)機(jī)制研究；(3)本次實(shí)驗(yàn)只是在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證，沒有進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，后續(xù)應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步完善miR-873對(duì)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制。