馮浩洋，胡平，喬鳳昌，王艷，許爭(zhēng)峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院&南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，南京210004)

自從2011年在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)富含脯氨酸的跨膜蛋白2 基因(PRRT2)(染色體16p11.2)的第1個(gè)突變以來(lái)，該基因突變被認(rèn)為與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，如陣發(fā)性運(yùn)動(dòng)性運(yùn)動(dòng)障礙(OMIM#128200)、良性家族性嬰兒癲癇(OMIM #605751)等[1]。此外，由于該基因突變與運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀密切相關(guān)，但智力障礙癥狀往往難以被聯(lián)系在一起，運(yùn)動(dòng)障礙同時(shí)伴有智力障礙的病例報(bào)道極為罕見(jiàn)，因此可能導(dǎo)致一些存在智力發(fā)育缺陷但運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀輕微的PRRT2突變患者漏診。近年來(lái)，外顯子測(cè)序技術(shù)的推廣使診斷單基因變異所致的遺傳病更為便捷、準(zhǔn)確[2]。本研究利用外顯子測(cè)序技術(shù)診斷1例智力發(fā)育障礙患者，該患者PRRT2基因存在c.649C>T雜合無(wú)義突變，并且在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該突變會(huì)導(dǎo)致編碼的PRRT2蛋白不能正常表達(dá)。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 患者，漢族，男性，14歲，江蘇鹽城人。于2017年7月因認(rèn)知障礙就診于南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院遺傳中心，進(jìn)行遺傳咨詢(xún)和進(jìn)一步評(píng)估?；颊邽樽阍马槷a(chǎn)，出生5個(gè)月后首次病發(fā)癲癇，程度較輕。2004年2月于鹽城市中醫(yī)院檢查腦CT和腦電圖，均提示正常，后服用中藥調(diào)理。2006年6月于江蘇省人民醫(yī)院診斷為自閉癥。后患者偶有癲癇發(fā)作，一般由突然站立引起，常僅持續(xù)數(shù)秒，并伴有輕微運(yùn)動(dòng)障礙。于我院就診時(shí)，患者面色呆滯，站立姿勢(shì)不穩(wěn)，雙手彎曲不自然，反應(yīng)遲緩，有輕微言語(yǔ)溝通障礙，情緒管理不良。據(jù)父母描述，該患兒自理能力較差，缺乏創(chuàng)造性想象力。智商檢測(cè)(IQ)為70。本研究通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No.寧婦倫字[2017] KY-081號(hào))，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2細(xì)胞系、主要儀器及試劑 HEK 293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。S220型Covaris超聲波破碎機(jī)(美國(guó)Covaris公司)，Veriti梯度PCR儀(美國(guó)ABI公司)，Qubit3.0熒光儀(美國(guó)Thermo公司)，Agilent 2100生物分析儀(美國(guó)Agilent公司)，Hiseq2500測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)，Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能公司)。DNA提取試劑盒(天根生物公司)，文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(上海德儀東方公司)，Agilent SureSelect QXT All Human Exon V6試劑盒(美國(guó)Agilent公司)，PCR擴(kuò)增試劑盒(南京諾唯贊公司)，PrimeSTAR?HS DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)，無(wú)連接克隆試劑盒(南京ABM公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，RIPA裂解液(上海碧云天公司)，Loading緩沖液(上海天能公司), 蛋白酶抑制劑(瑞士Roche公司)，兔抗鼠Prrt2多克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)，兔抗鼠FLAG多克隆抗體(美國(guó)CST公司)；羊抗兔IgG(H+L)-HRP二抗(南京巴傲得公司)。

1.3外顯子測(cè)序 分別抽取患者及父母入院時(shí)的外周血5 mL，使用EDTA-K2抗凝。提取先證者及父母外周血中基因組DNA并進(jìn)行遺傳分析，所有DNA濃度>50 ng/μL，總量>1.5 μg。通過(guò)超聲波從剪切的樣品中創(chuàng)建片段文庫(kù)，并按照Agilent SureSelect QXT All Human Exon V6試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行靶向富集。捕獲的DNA被擴(kuò)增，行固相橋擴(kuò)增，并在HiSeq2500測(cè)序儀上進(jìn)行雙端測(cè)序。使用基因組分析工具包3.4(GATK, www.broad institute.org/gatk)進(jìn)行與對(duì)人類(lèi)參考序列(hg19)的讀取和變體檢測(cè)比對(duì)。最后用PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證突變。針對(duì)點(diǎn)突變所在的Exon2的擴(kuò)增引物由Primer-BLAST在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)，由蘇州金唯智公司合成(正向引物：5′-TGCCGCTGTCTCTGCTATTC-3′和反向引物：5′-TAAGCGAAGGCCACGATGTT-3′)。PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智公司進(jìn)行一代測(cè)序驗(yàn)證。

1.4構(gòu)建質(zhì)粒 為更容易構(gòu)建質(zhì)粒，選用小鼠的基因序列。從本課題組前期研究的成年小鼠腦中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA[3]。以cDNA為模板使用PrimeSTAR擴(kuò)增全長(zhǎng)小鼠Prrt2編碼序列(正向引物：5′-ATGGCAGCCAGCAGCTCT-3′和反向引物：5′-TTACTTATACACGCCTAA-3′，設(shè)計(jì)及合成公司同1.3)，通過(guò)重疊PCR在Prrt2的蛋白質(zhì)羧基端插入1個(gè)FLAG表位以便于后續(xù)的蛋白質(zhì)檢測(cè)，利用無(wú)連接克隆試劑盒克隆至pCAGGS-GFP載體構(gòu)建Prrt2-FLAG質(zhì)粒。使用野生型Prrt2編碼序列進(jìn)行定點(diǎn)誘變重疊PCR以獲得Prrt2c.667C>T(p.R223X)序列[對(duì)應(yīng)人PRRT2c.649C>T(p.R217X)](前段序列正向引物：5′-ATGGCAGCCAGCAGCTCT-3′，反向引物：5′-CTGCTGCAGCAGCACTCGGGG-3′；后段序列正向引物：5′-CCCCGAGTGCTGCAGCAG-3′，反向引物：5′-TTACTTATACACGCCTAA-3′，設(shè)計(jì)及合成同上)，利用無(wú)連接克隆試劑盒克隆至pCAGGS-GFP載體構(gòu)建PRRT2mut-FLAG質(zhì)粒。通過(guò)測(cè)序整個(gè)編碼區(qū)域確認(rèn)構(gòu)建的突變質(zhì)粒。

1.5western blot HEK 293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，使用Lipofectamine 2000試劑按說(shuō)明書(shū)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染野生型及突變Prrt2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6 h后更換為原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，細(xì)胞在混合蛋白酶抑制劑(1∶100稀釋)的RIPA裂解液中裂解。4 ℃溫育1 h后，將裂解物4 ℃、13 800×g離心10 min。取野生型Prrt2上清液作為對(duì)照組，相同劑量和濃度的突變型Prrt2上清液作為實(shí)驗(yàn)組，將上清液與Loading緩沖液(1∶5稀釋)混合煮沸。分別將混合物加載至10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上電泳(90 V、20 min，100 V 1 h)。隨后將蛋白質(zhì)條帶在100 V、200 mA的條件下電轉(zhuǎn)移至0.22 μm聚乙二醇氟化膜中2 h。室溫條件下置于TBST溶解的50 g/L脫脂奶粉溶液封閉1 h。裁膜后分別加入兔抗鼠Prrt2多克隆抗體(1∶2 000稀釋)以及兔抗鼠FLAG多克隆抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃溫育過(guò)夜。蛋白質(zhì)條帶使用TBST洗膜1 h，再加入羊抗兔IgG(H+L)-HRP二抗(1∶20 000稀釋)溫育1 h。在曝光前使用ECL顯影液檢測(cè)，用Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)捕獲信號(hào)，曝光時(shí)間由機(jī)器自動(dòng)設(shè)定。拍攝后，利用ImageJ軟件計(jì)算目的條帶灰度值，并利用GraphPad軟件分析數(shù)據(jù)及制作柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1變異檢測(cè)及驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)軟件分析及數(shù)據(jù)過(guò)濾，將測(cè)序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭、去重復(fù)，過(guò)濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)，3例患者樣本的數(shù)據(jù)量、測(cè)序深度及覆蓋度見(jiàn)表1。

表1 3例研究對(duì)象樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量

進(jìn)一步采用全外顯子測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該患者16號(hào)染色體p11.2區(qū)域PRRT2基因的第2個(gè)外顯子編碼區(qū)檢測(cè)到1個(gè)雜合的無(wú)義突變(Chr16:29825024 C>T;c.649C>T;p.R217X, NM_145239.3)，遺傳自母親。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)原則(2015)[4]對(duì)該變異進(jìn)行評(píng)估，其變異分類(lèi)聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分為PVS1+PS1+PM1+PM2+PP4，綜合評(píng)定為致病性突變。用Sanger測(cè)序?qū)ν怙@子測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)該患者的無(wú)義突變c.649C>T來(lái)自于母親。見(jiàn)圖1。

注：A,該患者家系圖；B，該患者的臨床特征；C，Sanger測(cè)序驗(yàn)證患者及母親PRRT2基因突變。箭頭表示點(diǎn)突變所在位置及堿基，患者及母親均存在雜合突變。

2.2R217X突變導(dǎo)致PRRT2蛋白被過(guò)早降解 野生型及突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，經(jīng)western blot分析結(jié)果顯示，表達(dá)突變型Prrt2的細(xì)胞無(wú)法檢出Prrt2(識(shí)別蛋白氨基端)和FLAG(識(shí)別蛋白羧基端)信號(hào)，Prrt2 R223X不能表達(dá)，提示PRRT2 R217X在患者體內(nèi)不能正常表達(dá)。見(jiàn)圖2。

注：A,western blot條帶圖，Prrt2為使用anti-Prrt2抗體溫育，F(xiàn)LAG為使用anti-FLAG抗體溫育，Prrt2-FLAG為野生型蛋白，Prrt2mut-FLAG為R223X突變蛋白；B，western blot條帶的灰度值統(tǒng)計(jì)柱狀圖；C，人PRRT2 R217X突變與正常PRRT2蛋白表達(dá)異常對(duì)比的示意圖。

3 討論

在本研究中，我們通過(guò)全外顯子測(cè)序技術(shù)鑒定了1例智力障礙合并癲癇及運(yùn)動(dòng)障礙的男性患者的PRRT2基因存在雜合無(wú)義突變(c.649C>T;p.R217X)。PRRT2基因(NM_145239.2)位于16p11.2，含有4個(gè)外顯子，編碼340個(gè)氨基酸。該基因最常見(jiàn)的突變?yōu)閏.649dupC，與本研究發(fā)現(xiàn)的突變相似，均導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)在脯氨酸富集區(qū)與跨膜區(qū)之間提前終止翻譯。目前，該基因突變被報(bào)道的主要臨床癥狀為癲癇及運(yùn)動(dòng)障礙，這與該患者的部分臨床癥狀吻合[5-6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該基因翻譯蛋白PRRT2通過(guò)參與形成突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)，釋放復(fù)合物，負(fù)向調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)釋放[7]。因此，突變導(dǎo)致調(diào)控機(jī)制失調(diào)，后膜興奮性異常增高，最終引發(fā)運(yùn)動(dòng)障礙以及癲癇。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，一些PRRT2突變患者表現(xiàn)出非典型癥狀如偏頭痛和智力障礙[8-9]，但原因未明。目前，僅少數(shù)病例報(bào)道為智力障礙表型[4]。攜帶純合PRRT2截?cái)嗤蛔兊幕颊咧杏?2.4%(11/21)存在智力障礙，而攜帶雜合突變的患者中只有0.6%(8/1 423)存在智力障礙。PRRT2突變的智力障礙患者在嬰幼兒時(shí)期往往出現(xiàn)嚴(yán)重的癲癇甚至強(qiáng)直性陣攣發(fā)作[10]，可能引起腦組織損傷從而影響智力。然而，本研究中的病例沒(méi)有嚴(yán)重的癲癇大發(fā)作并且腦CT及腦電圖均無(wú)異常，提示該患者的智力障礙與重度癲癇之間可能無(wú)必然聯(lián)系。值得注意的是，患者母親也是該雜合突變的攜帶者，但無(wú)任何臨床癥狀。曾有報(bào)道PRRT2突變家系中存在外顯不全的個(gè)體[11]。因此，推測(cè)患者母親可能同樣為PRRT2突變不完全外顯。

PRRT2在哺乳動(dòng)物中高度保守，人和小鼠PRRT2蛋白脯氨酸富集區(qū)至跨膜區(qū)氨基酸序列完全一致，小鼠Prrt2的Arg223氨基酸位點(diǎn)對(duì)應(yīng)人PRRT2基因的Arg217位點(diǎn)。為了進(jìn)一步研究PRRT2(c.649C>T)的突變致病機(jī)制，我們克隆了小鼠Prrt2基因并設(shè)計(jì)了R223X(c.667C>T)突變模擬人類(lèi)PRRT2_R217X突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Prrt2_R223X蛋白不能正常表達(dá)，提示PRRT2_R217X突變患者PRRT2蛋白體內(nèi)異常表達(dá)，且低于健康人，這與既往報(bào)道的PRRT2R217X附近的截?cái)嗤蛔儗?dǎo)致蛋白質(zhì)過(guò)早被降解相一致[12]。本研究局限性在于PRRT2蛋白僅在腦組織中特異表達(dá)，人體樣本取材困難，我們僅從體外驗(yàn)證PRRT2 R217X蛋白質(zhì)表達(dá)異常，暫時(shí)無(wú)法進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證缺少PRRT2是否影響智力發(fā)育。隨著科技水平進(jìn)步，相關(guān)終會(huì)揭示其更深層的致病機(jī)理并以此治療此類(lèi)患者。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PRRT2基因截?cái)嗤蛔兂藭?huì)導(dǎo)致癲癇、運(yùn)動(dòng)障礙等常見(jiàn)臨床癥狀外，還會(huì)引起智力障礙等神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常。檢測(cè)PRRT2基因?qū)τ谝恍┩瑫r(shí)存在智力發(fā)育障礙以及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)障礙的患者具有一個(gè)預(yù)警的作用。外顯子測(cè)序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地診斷該類(lèi)患者的遺傳學(xué)病因。