謝林培，祝沖之,2，張曉東,2，余 冉①，展漫軍，孫麗偉

(1.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210096；2.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042；3.南京市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，江蘇 南京 210013)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)是由2個或多個苯環(huán)以直接連接、彎曲連接或聚集方式構(gòu)成的特殊化合物。PAHs具有熔點和沸點較高、低水溶性、蒸汽壓小、熱穩(wěn)定以及難降解等特點[1]，主要產(chǎn)生于有機(jī)物質(zhì)不完全燃燒過程以及石油開采、運輸、生產(chǎn)和使用過程中發(fā)生的溢油事件[2]。PAHs對生物體具有致癌、致畸和致突變的“三致作用”，是環(huán)境中普遍存在的有毒污染物[3]。PAHs可通過沉降和遷移進(jìn)入土壤和水體，并可通過直接接觸和食物鏈進(jìn)入人體而危害公共健康[4]。2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》中明確指出有機(jī)污染物主要在工業(yè)廢棄地、工業(yè)園區(qū)、采油區(qū)、采礦區(qū)、污水灌溉區(qū)和干線公路兩側(cè)累積[5]。目前，GB 36600—2018《土壤環(huán)境質(zhì)量 建設(shè)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》中有限值的PAHs(最低限值)有8種，分別為萘(25 mg·kg-1)、苯并[a]蒽(5.5 mg·kg-1)、苯并[a]芘(0.55 mg·kg-1)、(490 mg·kg-1)、苯并[b]熒蒽(5.5mg·kg-1)、苯并[k]熒蒽(55 mg·kg-1)、茚并[1，2，3-cd]芘(5.5 mg·kg-1)和二苯并[a，h]蒽(0.55 mg·kg-1)[6]。在產(chǎn)或退役農(nóng)藥廠場地土壤中除檢出農(nóng)藥類特征污染物外，同時還檢測出一定數(shù)量的PAHs[7]。因此修復(fù)PAHs污染土壤是緊迫和棘手的熱點研究問題之一。

污染土壤中PAHs可以采用物理、化學(xué)和生物修復(fù)法中的一種或多種聯(lián)合去除。傳統(tǒng)物理修復(fù)技術(shù)有客土法、填埋法、焚燒法、隔離法和換土法等[3]，化學(xué)修復(fù)技術(shù)有化學(xué)淋洗法、萃取法、化學(xué)氧化法和光催化降解技術(shù)等[8]。但是物理和化學(xué)修復(fù)法存在處理成本高、去除不徹底、易導(dǎo)致二次污染等缺點。生物修復(fù)法指利用特定生物降解土壤中污染物，或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為無害物質(zhì)[9]。微生物修復(fù)技術(shù)具有使用成本低、無二次污染、可以大面積普及使用等優(yōu)點，被認(rèn)為是具有廣泛應(yīng)用潛力的有效措施。相關(guān)研究[10]已發(fā)現(xiàn)微生物降解是污染土壤和沉積物中PAHs的主要自然去除途徑。

微生物經(jīng)過自然馴化，能以PAHs作為碳源用于生長繁殖[10]。但目前已發(fā)現(xiàn)的多種微生物僅能降解單一PAHs，而PAHs污染土壤通常具有復(fù)合污染特性。同時，微生物由于代謝通路限制，無法降解所有類型PAHs，或?qū)⑵渫耆到?，并極有可能產(chǎn)生有毒降解副產(chǎn)物[11]。因此，需要利用混合菌群協(xié)同作用，如共代謝作用等，并通過改善微生物作用環(huán)境以刺激微生物活性增強(qiáng)，如曝氣、添加必要營養(yǎng)物質(zhì)等。鑒于PAHs的水溶性差，生物可獲得性低，原位PAHs生物修復(fù)效果無法保證，有研究者嘗試添加表面活性劑改善土壤中PAHs溶解性，增加它們的生物利用度[12-13]。表面活性劑可分成離子型和非離子型2大類。非離子表面活性劑，如Tween 80，基團(tuán)之間排斥力較弱，對PAHs的溶解能力比離子型表面活性劑高，并且具有可生物降解、在固體表面不易吸附和環(huán)境友好的優(yōu)點，常應(yīng)用于土壤修復(fù)中[14-16]。生物堆處理技術(shù)是一種新型異位生物修復(fù)技術(shù)，是將大量污染土壤混合堆積成堆體，并通過調(diào)節(jié)氧氣、水分和養(yǎng)分以最大程度促進(jìn)微生物好氧降解污染物[17]。

通過生物堆反應(yīng)模擬裝置，對采用生物堆修復(fù)技術(shù)處置PAHs污染土壤的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化并探討其影響因素，篩選富集PAHs的高效降解混菌，研究投加降解菌對生物堆技術(shù)處理PAHs污染土壤的強(qiáng)化效果，同時研究非離子表面活性劑Tween 80對改善PAHs生物可獲得性、提高PAHs生物降解效率的影響機(jī)制，研究可為PAHs污染工業(yè)場地土壤修復(fù)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與裝置

PAHs污染土壤取自江蘇南京某化工廠退役場地，其pH值為8.33±0.39，含水率為(20.8±1.3)%，有機(jī)質(zhì)含量為(32.6±2.9) g·kg-1，全氮含量為(84.93±31.10) mg·kg-1，全磷含量為(18.13±0.53) mg·kg-1。土壤中含有16種美國環(huán)保署優(yōu)先控制PAHs，其平均含量為479.9～1 337.4 mg·kg-1，其中低分子質(zhì)量PAHs(2～3環(huán))質(zhì)量占總PAHs質(zhì)量的75.1%，中分子質(zhì)量PAHs(4環(huán))占17.8%，高分子質(zhì)量PAHs(5～6環(huán))占9.1%。

這16種PAHs的混合標(biāo)準(zhǔn)品選擇EPA610(美國o2si標(biāo)準(zhǔn)品公司)。

1.2 PAHs降解混菌的篩選富集

采用尿素和磷酸二氫鉀將污染土壤m(xù)(C)∶m(N)∶m(P)調(diào)節(jié)為100∶20∶1后，稱取100 g土壤懸浮于裝有0.5 L超純水的1 L燒杯中，以150 r·min-1攪拌2 h后取懸浮液以轉(zhuǎn)速為6 755 r·min-1(離心半徑為9.8 cm)離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾、高壓蒸汽滅菌(121 ℃，30 min)，獲得作為PAHs降解混菌富集培養(yǎng)所用的培養(yǎng)液。

將10 g PAHs污染土壤接種到100 mL培養(yǎng)液中于室溫條件下培養(yǎng)8 h，過中速定量濾紙，取上清液10 mL接種到90 mL新鮮培養(yǎng)液中，再加入10 mL PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(16種PAHs質(zhì)量濃度均為5 mg·L-1)。在25 ℃、遮光條件下以150 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 d。采用分光光度計監(jiān)測菌液在600 nm波長處的吸光度(D600)。取菌液D600值最大時的混菌菌液用于后續(xù)生物堆實驗研究，以驗證其實際PAHs降解效能。

1.3 生物堆降解實驗設(shè)計

生物堆降解實驗在自制反應(yīng)器(圖1)中進(jìn)行。反應(yīng)器主體為圓柱體不銹鋼容器，加帶密封圈的蓋子以確保密閉性。下層底部鋪設(shè)不銹鋼曝氣穿孔管，同時用三腳架支撐不銹鋼穿孔板，上鋪紗布，用于承載污染土壤。曝氣管與空氣泵相連接，氣泵啟停由定時器控制，曝氣管連接轉(zhuǎn)子流量計以控制曝氣流量。反應(yīng)器頂部蓋子開一小孔，以連接裝有活性炭的廢氣吸收裝置。

向PAHs污染土壤中混入w為1%的短稻草(長度為0.5～1.0 cm)和w為25%的沙子(粒徑為0.150～0.250 mm)，以改善土壤透氣性。加入尿素和磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)m(C)∶m(N)∶m(P)為100∶20∶1，混合均勻后分裝到4個平行反應(yīng)器中。試驗設(shè)置4個處理:1#為對照；2#添加1 000 mg·kg-1的Tween 80；3#以30 mL·min-1通氣速率進(jìn)行通氣；4#添加1 000 mg·kg-1Tween 80并以30 mL·min-1通氣速率通氣(表1)。通風(fēng)方式采用間歇通風(fēng)，每隔4 h通風(fēng)4 h。試驗31 d時，采用噴瓶向3#和4#處理反應(yīng)器噴灑10 mL·kg-1已篩選富集的PAHs降解菌劑，邊噴灑邊攪拌，使菌液與土壤均勻混合。

表1 實驗條件設(shè)置

以預(yù)處理后分裝到反應(yīng)器前的土壤為0 d時樣品，分別在9、16、23、31、41和80 d時于反應(yīng)器上、中和下層分別隨機(jī)取3個樣混合，共約150 g。取樣后向通風(fēng)的3#和4#處理反應(yīng)器加入適量水，保持土壤含水率穩(wěn)定在20%～30%。

1.4 分析方法

1.4.1PAHs的分析方法

采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定土壤中PAHs含量。稱取土壤樣品10 g(精確至0.1 g)，與適量硅藻土混合研磨后，采用戴安ASE300加速溶劑萃取儀進(jìn)行提取。提取劑為丙酮和二氯甲烷(體積比為1∶1)，提取溫度為100 ℃，提取時間為10 min。提取液用KD濃縮器濃縮至約1 mL，加入1 mL正己烷后繼續(xù)濃縮，再用正己烷定容至1 mL后采用安捷倫7890-5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀測定。儀器條件參照HJ 834—2017《土壤和沉積物 半揮發(fā)性有機(jī)物的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》。

試驗質(zhì)量控制采用空白加標(biāo)、基質(zhì)加標(biāo)、樣品平行和添加替代物方式?？瞻准訕?biāo)16種PAHs標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率為74.0%～100.0%，基質(zhì)加標(biāo)的平均回收率為76.0%～90.0%。2-氟苯酚、苯酚-d6、硝基苯-d5、2-氟聯(lián)苯、2，4，6-三溴苯酚和對-三聯(lián)苯-d14這6種替代物的回收率為70%～110%。

1.4.2脫氫酶活性的分析方法

土壤脫氫酶活性測定采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)法。在含有1.00 g土壤樣品的25 mL試管中加入2.5 mL Tris-TTC溶液(ρ為10 g·L-1，pH值為7.6)，振蕩試管使土壤顆粒與溶液充分混合，于37 ℃暗處孵育24 h。取出后加入10 mL乙醇溶液，渦旋1 min后靜置，過0.45 μm濾膜過濾，將濾液在1 h內(nèi)于485 nm波長下測吸光度。同時設(shè)置無土壤的對照組和以1% Tris溶液代替1% Tris-TTC溶液的對照組。

2 結(jié)果與討論

2.1 PAHs降解混菌的篩選富集

在一定范圍內(nèi)，菌液中微生物細(xì)胞濃度與D600值呈正比。在添加外源PAHs的土壤滲濾液中進(jìn)行PAHs降解混菌的富集篩選培養(yǎng)，并監(jiān)測培養(yǎng)液D600變化以指示生物量變化。經(jīng)過4 d的生長適應(yīng)期后，降解混菌進(jìn)入對數(shù)增長期，其D600從0.029增長到8 d時的0.331，之后進(jìn)入穩(wěn)定衰亡期(圖2)。因此收集培養(yǎng)8 d時處于快速增長期的混菌菌液用于后續(xù)生物堆實驗。

2.2 土壤PAHs含量變化

生物堆反應(yīng)器運行期間，土壤pH和含水率基本保持穩(wěn)定，含水率在20%～25%之間，pH值維持在8.4～9.0之間。由圖3可知，1#～4#處理9 d時總PAHs降解率分別為84%、90%、86%和85%，各處理80 d時總PAHs降解率均在83%～85%之間。

由圖4可知，不同分子質(zhì)量PAHs降解速率存在明顯差異，低分子質(zhì)量PAHs在9 d內(nèi)減少91%，反應(yīng)9 d時平均降解速率為49 mg·kg-1·d-1；而中、高分子質(zhì)量PAHs只有60%被降解，反應(yīng)9 d時平均降解速率分別僅為8.4和4.2 mg·kg-1·d-1。已有研究表明，低分子質(zhì)量的萘在土壤中半衰期約為2 d[18]，菲的半衰期約為17 d[19]，而4～6環(huán)的中高分子質(zhì)量PAHs半衰期大于100 d[20]。因此，低分子質(zhì)量PAHs較容易被污染土壤中土著微生物代謝降解，PAHs環(huán)數(shù)越高，降解難度越大。此外，土壤受污染時間也影響其對污染物的生物降解能力。有研究[21]表明污染200 d的土壤中PAHs降解速率高于污染50 d的土壤。MACLEOD等[22]研究了芘在牧地和林地2種土壤中的降解，發(fā)現(xiàn)隨著芘與土壤接觸時間的增加，其降解滯后期顯著減少，降解速率提高。RHODES等[23]研究結(jié)果表明，菲與土壤接觸84 d時的降解速率比接觸1 d時更快。因此，研究區(qū)土壤由于長期受到PAHs污染，其中的PAHs，尤其是低分子質(zhì)量PAHs有極強(qiáng)的降解能力，而中高分子質(zhì)量PAHs降解則需更長時間。

高分子質(zhì)量PAHs主要以共代謝方式進(jìn)行生物降解[2]，目前對其降解機(jī)制的研究主要集中在5環(huán)的苯并[a]芘的厭氧降解。在厭氧條件下，苯并[a]芘首先通過甲基化和還原反應(yīng)使苯環(huán)斷裂，隨后在脫甲基作用下形成苯并[a]蒽和，最終經(jīng)過甲基化反應(yīng)形成蒽和菲[24-25]。由圖4可知，生物堆土壤中低、中和高分子質(zhì)量PAHs含量在41 d時有所提高，這可能是由于高環(huán)數(shù)PAHs經(jīng)過一系列生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為低環(huán)數(shù)PAHs[24，26]。

投加Tween 80在試驗期內(nèi)對生物堆PAHs降解率沒有顯著影響(P>0.05)。添加Tween 80的2#處理PAHs降解率與1#對照相比沒有明顯提高。在通風(fēng)條件下，與3#處理相比，添加Tween 80的4#處理PAHs降解率也沒有明顯提高(P>0.05)。PAHs水溶性低，微生物只能利用其進(jìn)入水相的部分，表面活性劑能夠促使PAHs由土壤吸附態(tài)或非水相向水相轉(zhuǎn)移，從而提高PAHs的生物可利用性，促進(jìn)PAHs生物降解[16]。但筆者試驗中Tween 80的添加對生物堆降解PAHs沒有起到積極作用，這可能是由于9 d時易降解PAHs已基本都被利用，難降解PAHs則需更長的生物反應(yīng)時間。

同時，經(jīng)過9 d的生物堆反應(yīng)，85%以上的PAHs均已被去除，故以30 mL·min-1通風(fēng)的3#處理PAHs降解效率與1#對照相比沒有明顯差異(P>0.05)。PAHs的微生物降解以好氧降解為主[27-28]。筆者試驗中氧氣可能不是PAHs生物降解速率的限制因素。在生物堆反應(yīng)31 d后添加10 mL·kg-1PAHs降解混菌的3#和4#處理，總PAHs降解效率與加入菌液前沒有明顯提高，說明土壤中殘留的難降解PAHs需要更長的生物降解時間，同時所投加混菌對難降解PAHs的降解能力還需進(jìn)一步篩選優(yōu)化。

2.3 土壤脫氫酶活性變化

由圖5可知，各處理土壤脫氫酶活性在反應(yīng)前41 d隨反應(yīng)時間延長緩慢增加，到80 d時，除1#對照外，其他處理土壤脫氫酶活性大幅增加。2#、3#和4#處理80 d時土壤脫氫酶活性較41 d時分別增加3倍、7倍和9倍。脫氫酶能催化有機(jī)物脫氫反應(yīng)，作為氫的中間傳遞體，對有機(jī)物氧化還原反應(yīng)起著重要作用。土壤脫氫酶活性可間接反映土壤微生物對PAHs的降解活性和對土壤有機(jī)質(zhì)的代謝能力[29]。反應(yīng)0～41 d時，與1#對照相比，2#～4#處理土壤脫氫酶活性均沒有顯著提高。反應(yīng)41 d后，1#對照土壤脫氫酶活性基本不變，而其他各處理土壤脫氫酶活性顯著提高。各處理80 d時土壤脫氫酶活性由大到小依次為4#(10 740 μg·g-1·h-1)>3#(7 300 μg·g-1·h-1)>2#(3 340 μg·g-1·h-1)>1#(986 μg·g-1·h-1)。而與0 d時相比，各處理9 d時PAHs降解率沒有明顯提高，這說明雖然PAHs尤其是低分子質(zhì)量PAHs能夠快速降解，但其并未完全礦化，而是轉(zhuǎn)化為其他中間產(chǎn)物，并在反應(yīng)41～80 d時被繼續(xù)降解。

好氧條件下，PAHs首先在加氧酶催化下轉(zhuǎn)化為順式或反式二氫二醇化合物，然后在脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇后再進(jìn)行下一步水解[30]。在厭氧條件下，PAHs首先經(jīng)歷一系列的甲基化、羥基化反應(yīng)開環(huán)轉(zhuǎn)化為甲酚，然后在脫氫酶作用下進(jìn)一步水解[31]。Cycloclasticussp.Strain P1在降解菲和芘的過程中編碼二氫二醇脫氫酶的基因高度表達(dá)，在降解萘的過程中編碼二氫二醇脫氫酶的基因和水楊醛脫氫酶的基因特異性上調(diào)[32]。Rhodococcussp.P14在PAHs降解過程中脫氫酶基因表達(dá)增加，脫氫酶是PAHs降解過程中的限速酶[33]。

在厭氧條件下，菲和芘是Microbacteriumsp. strain M.CSW3和Pseudomonassp.JP1降解苯并[a]芘的中間產(chǎn)物[24，26]，菲和芘的進(jìn)一步降解也需要脫氫酶參與。筆者研究中，各處理可能對PAHs降解的中間產(chǎn)物降解有顯著促進(jìn)作用，其中2#處理促進(jìn)作用較小，3#處理促進(jìn)作用較明顯，而4#處理促進(jìn)作用最大。值得注意的是，3#和4#處理土壤脫氫酶活性在41 d后大幅提高，這說明31 d時添加的菌液在經(jīng)過適應(yīng)期后發(fā)揮了降解作用，雖然投加的混菌不具備降解土壤殘留難降解PAHs的能力，但對降解中間產(chǎn)物的進(jìn)一步礦化可能有顯著促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

采用微生物修復(fù)法處理PAHs污染土壤，通過模擬生物堆實驗運行80 d后，各處理PAHs污染土壤總PAHs降解率均在83%～85%之間，表明添加1 000 mg·kg-1的Tween 80、以30 mL·min-1通風(fēng)和投加10 mL·kg-1降解混菌的生物堆處理可以應(yīng)用于PAHs污染場地土壤修復(fù)。