黃 靖，陳 嬋

(福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350007)

福建為我國(guó)佛手主產(chǎn)地之一，福建佛手稱(chēng)“建佛手”或“閩佛手”，在福建泉州、寧德、莆田等地均有種植[1]。佛手(CitrusmedicaL var.sarcodactylis)為蕓香科柑橘屬植物，其藥性溫，味辛、苦、酸，歸肝、脾、肺經(jīng)。近年來(lái)，隨著佛手飲料[2]、佛手酥[3]、佛手發(fā)酵酒[4]等初加工食品的開(kāi)發(fā)，產(chǎn)生了大量未被利用的皮渣，造成了資源的浪費(fèi)[5]。研究表明，佛手皮渣中含有多糖、果膠、黃酮、精油等多種生理活性物質(zhì)，皮渣中果膠的提取已有系列報(bào)道[6-7]，其他活性成分的提取則未見(jiàn)報(bào)道。

章斌等[8]研究了復(fù)合酶法提取廣佛手多糖的工藝研究，其多糖的得率為4.13%。紀(jì)躍芝等[9]研究了傳統(tǒng)方法提取佛手多糖的最佳工藝設(shè)計(jì)，多糖得率最高可達(dá)7.21%。佛手多糖具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等保健功能，開(kāi)展佛手多糖的提取研究對(duì)我國(guó)佛手資源的綜合利用具有重大意義[5]。目前，對(duì)浙江的“金佛手”與廣東、廣西的“廣佛手”研究較多[10-12]，而對(duì)福建“建佛手”的研究較少，超聲波提取技術(shù)廣泛應(yīng)用于多糖的提取工藝中，其產(chǎn)生的空化和擊碎效應(yīng)等能有效提高細(xì)胞破碎效率，并加速多糖成分的擴(kuò)散釋放并溶于溶劑中，提高多糖提取率，但超聲波強(qiáng)烈的機(jī)械振動(dòng)可能會(huì)造成多糖結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而影響多糖的生理活性[13-14]。

本文采用低頻超聲功率，以福建佛手皮渣為原料，研究超聲波提取法提取佛手多糖的最優(yōu)工藝，并對(duì)提取得到的佛手多糖進(jìn)行抗氧化研究，為福建本地佛手資源的高值化利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試材料：佛手，由福建泉州向陽(yáng)賢芳佛手農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司提供。

葡萄糖、無(wú)水乙醇、蒽酮、硫酸、甲醇、正丁醇、鹽酸、硫酸鐵銨、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、三氯乙酸、2-脫氧D核糖、硫代巴比妥酸等均為分析純。

蒽酮硫酸溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取蒽酮0.1 g，加濃度為80%硫酸溶液100 mL使其溶解，搖勻(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

1.2 儀器與設(shè)備

PB 80 Easy 218美的破壁機(jī)，由廣東美的生活電器制造有限公司生產(chǎn)；101-2型鼓風(fēng)干燥箱，由上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；KQ-300 VDV三頻數(shù)控超聲波清洗機(jī)，由昆山超聲儀器有限公司生產(chǎn)；TDL-5低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；722 s可見(jiàn)分光光度計(jì)，由上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 多糖的測(cè)定方法 采用蒽酮硫酸法[15]測(cè)定多糖。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：精密吸取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL具塞試管中，補(bǔ)充蒸餾水至2.0 mL，加入硫酸蒽酮溶液6 mL，置沸水浴中加熱15 min，取出后放入水浴中冷卻15 min，每個(gè)濃度做3次重復(fù)，在625 nm波長(zhǎng)下迅速測(cè)定其吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，所測(cè)定的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在0～0.12 mg/mL的線(xiàn)性范圍內(nèi)，線(xiàn)性方程：y=0.0736x-0.0032，R2=0.9996。

樣品測(cè)定：將提取的樣品液稀釋至一定濃度，吸取1.0 mL按上述步驟操作，測(cè)定其吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算多糖含量。

1.3.2 建佛手粗多糖的超聲波提取工藝 佛手多糖超聲波提取工藝[10,16]：佛手皮渣→烘干至恒重→粉碎→過(guò)篩(40目)→脫脂(8倍95%乙醇浸泡過(guò)夜)→50 ℃烘干備用→浸泡佛手皮渣干粉30 min(50 ℃蒸餾水)→超聲提取(頻率為45 KHz)→提取液離心20 min(4000 r/min)→上清液定容→測(cè)定吸光值。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算佛手多糖得率。計(jì)算公式如下：

式中：C表示經(jīng)過(guò)稀釋后測(cè)定的多糖含量(μg)；V1表示提取后得到的上清液體積(mL);N表示稀釋倍數(shù)；V2表示用于測(cè)定的上清液體積(mL)；m表示用于提取的建佛手質(zhì)量(g)。

1.3.3 工藝優(yōu)化試驗(yàn)說(shuō)明 參考文獻(xiàn)[7,17]，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)以建佛手皮渣干粉為試樣，多糖得率為考察指標(biāo)，分別考察料液比、超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度、超聲功率4個(gè)因素對(duì)佛手多糖得率的影響。

本文均采用超聲頻率為45 KHz，固定超聲功率50 W，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為60 min，料液比(m/v)為1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100；固定料液比為1∶80，提取溫度為50 ℃，超聲功率為50 W，提取時(shí)間為20、40、60、80、100 min；固定超聲時(shí)間為60 min，超聲功率為50 W，料液比為1∶80，提取溫度為50、60、70、80 ℃；固定料液比為1∶80，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為60 min，超聲功率為40、50、60、70、80 W。根據(jù)單因素試驗(yàn)最終結(jié)果選定4因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定超聲波提取的最佳工藝參數(shù)。根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.4 建佛手粗多糖的抗氧化研究 比較同濃度下建佛手粗多糖與VC對(duì)羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(·O2-)的清除能力。清除·OH能力采用Fenton反應(yīng)法[18]，清除·O2-能力的測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法[19]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 單因素及正交試驗(yàn)均平行3次，應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)建佛手果渣粗多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取定量的建佛手干粉，在超聲功率為50 W，提取溫度為50 ℃條件下，分別選用1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100料液比提取60 min，考察料液比對(duì)粗多糖提取率的影響。結(jié)果顯示：料液比影響建佛手粗多糖的提取率。在料液比為1∶20～1∶80范圍內(nèi)，佛手多糖得率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶80時(shí)，建佛手多糖的提取率最高，達(dá)到3.09%，隨后略有下降。料液比的增加能有效促進(jìn)水溶性多糖物質(zhì)的溶出，但當(dāng)提取溶劑用量過(guò)大時(shí)會(huì)造成多糖濃度過(guò)低，影響后續(xù)的濃縮、沉淀等操作步驟，造成部分多糖損失(圖1)。

圖1 料液比對(duì)建佛手多糖提取率的影響

2.2 超聲時(shí)間對(duì)建佛手粗多糖提取率的影響

一定量建佛手干粉在料液比為1∶80，超聲功率50 W，提取溫度為50 ℃時(shí)分別提取20、40、60、80、100 min，考察超聲提取時(shí)間對(duì)建佛手粗多糖提取率的影響。結(jié)果表明：在超聲頻率為45 KHz，超聲功率為50 W，超聲提取溫度為50 ℃，料液比為1∶80的提取條件下，超聲時(shí)間在20～80 min范圍內(nèi)，提取時(shí)間越長(zhǎng)，建佛手多糖提取率越高，提取時(shí)間為80 min時(shí)，建佛手多糖的提取率最高，隨后下降。原因可能是當(dāng)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，容易造成多糖的降解，從而使多糖提取率下降(圖2)。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)佛手多糖提取率的影響

2.3 超聲提取溫度對(duì)建佛手粗多糖提取率的影響

其他提取條件不變，將提取溫度設(shè)置為50、60、70、80 ℃時(shí)提取60 min，考察超聲提取溫度對(duì)建佛手粗多糖提取率的影響。結(jié)果表明：在超聲過(guò)程中，溫度會(huì)有小幅波動(dòng)，本試驗(yàn)采用的超聲頻率為45 KHz，在超聲提取過(guò)程中溫度的波動(dòng)幅度在±3 ℃。本次試驗(yàn)所用的超聲設(shè)備在溫度超過(guò)80 ℃時(shí)，會(huì)自動(dòng)斷電進(jìn)行自我保護(hù)，因此，提取溫度為80 ℃時(shí)，提取率會(huì)受一定影響。在本研究過(guò)程中，其他條件不變時(shí)，超聲提取溫度在70 ℃時(shí)提取率最高，為3.102%(圖3)。

圖3 超聲溫度對(duì)佛手多糖提取率的影響

2.4 超聲功率對(duì)建佛手粗多糖提取率的影響

在料液比為1∶80，提取溫度為70 ℃的條件下，選用超聲功率為40、50、60、70、80 W提取60 min，考察超聲功率對(duì)建佛手粗多糖提取率的影響。結(jié)果表明：超聲功率對(duì)建佛手多糖的提取率有影響，建佛手多糖的提取率隨著超聲功率的提高而增加，在超聲功率為60 W時(shí)，建佛手粗多糖的提取率最高，達(dá)到2.97%，當(dāng)超聲功率大于60 W后，提取率反而下降(圖4)。

圖4 超聲功率對(duì)佛手多糖提取率的影響

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，得出因素水平(表1)。以建佛手干粉為試樣，以粗多糖提取率為考察對(duì)象，選擇超聲提取時(shí)間、超聲功率、超聲提取溫度、料液比4種因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，研究超聲波提取佛手粗多糖的最佳工藝條件。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由表2和表3可知，在影響建佛手多糖的超聲波提取工藝中，影響因素為A(提取時(shí)間)>C(提取溫度)>B(超聲功率)>D(料液比)。提取時(shí)間對(duì)佛手多糖的提取率影響極顯著(P<0.01)，超聲溫度與超聲功率的影響顯著(P<0.05)，料液比的影響無(wú)明顯顯著性。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，超聲波提取建佛手粗多糖最佳提取工藝條件為A1B1C2D2，即料液比1∶60、超聲功率50 W、提取溫度60 ℃的條件下提取40 min，提取率最高。經(jīng)過(guò)5次驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下，佛手多糖的提取率最高可達(dá)3.32%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。表明超聲波提取法提取建佛手多糖，工藝可行穩(wěn)定，且省時(shí)高效，試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

表2 佛手多糖超聲波提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.6 建佛手粗多糖抗氧化活性分析

配制0.2～1.4 mg質(zhì)量濃度的建佛手多糖提取液，以同濃度的VC溶液為對(duì)照組。用Fenton反應(yīng)法及鄰苯三酚自氧化法測(cè)定其對(duì)·OH及對(duì)·O2-的清除作用，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。建佛手多糖溶液有較好的抗氧化活性，在濃度為0.2～1.4 mg/mL時(shí)，其清除能力與濃度呈正比，建佛手多糖溶液對(duì)·OH具有較好清除能力，清除作用略低于同濃度的VC溶液，其對(duì)·O2-的清除作用低于同濃度的VC溶液。當(dāng)建佛手多糖質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL時(shí),佛手多糖對(duì)·OH和·O2-的清除率分別為86.12%和35.87%。

3 結(jié)論

福建佛手皮渣中富含多糖物質(zhì)，本研究通過(guò)超聲波提取技術(shù)，獲得建佛手多糖的最優(yōu)提取工藝為：超聲頻率45 KHz、料液比1∶60、超聲功率50 W、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間40 min，佛手多糖的提取率最高，可達(dá)3.32%。章斌等[8]研究了復(fù)合酶法提取廣佛手多糖的工藝研究，工藝條件為酶用量1.2%、酶解時(shí)間150 min、料液比1∶40、酶解溫度50 ℃,佛手多糖得率為4.13%。紀(jì)躍芝等[9]研究了水提法提取佛手多糖的最佳工藝設(shè)計(jì)，提取工藝條件為浸提時(shí)間1.5 h、提取溫度100 ℃、料液比1∶20，多糖得率最高可達(dá)7.21%。王琴等[12]采用超聲波法提取廣佛手多糖，結(jié)果為超聲波預(yù)處理25 min，料液比1∶30，熱水浸提4 h，粗多糖得率為3.18%。本研究得出的提取率與章斌[8]、紀(jì)躍芝[9]等的研究結(jié)果差異較大，接近于王琴等[12]的研究結(jié)果，但在技術(shù)工藝上也存在較大差異。原因主要在于以下2個(gè)方面：一是提取原料不同，不同產(chǎn)地、不同部位佛手多糖含量有差異。本研究采用福建佛手加工中廢棄的皮渣，為佛山加工中廢棄物的高值化利用提供了技術(shù)參考。二是提取技術(shù)與測(cè)定方法不同，所選用參數(shù)不同。本研究采用蒽酮硫酸法，區(qū)別于其他文獻(xiàn)中的苯酚硫酸法，蒽酮硫酸法條件溫和、重現(xiàn)性好、線(xiàn)性范圍廣，但有報(bào)道說(shuō)可能存在提取率偏高的問(wèn)題[20-21]，可在后續(xù)研究中繼續(xù)討論。綜上所述，本研究采用的超聲波提取福建佛手多糖的工藝可行、省時(shí)高效。

圖5 建佛手與VC對(duì)·O2-的清除能力

圖6 建佛手與VC對(duì)·OH的清除能力

體外抗氧化活性試驗(yàn)表明，本研究提取的福建佛手皮渣多糖溶液有較好的抗氧化活性，在溶液濃度為0.2～1.4 mg/mL內(nèi)，清除能力與濃度呈正比。當(dāng)建佛手多糖質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL時(shí),佛手多糖對(duì)·OH和·O2-的清除率分別為86.12%和35.87%。對(duì)·OH清除作用略低于同濃度的VC溶液。該研究結(jié)果增加了其開(kāi)發(fā)利用的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。