吳 昊，吳 軍，王洪勇，劉婭靈，韓國慶， 李文超，施青云，鄒 霈,2*

(1.國家衛(wèi)健委核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 無錫 214063；2.南京醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211166)

黃曲霉毒素(AFT)是一類由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的帶有雙呋喃環(huán)和香豆素結(jié)構(gòu)的毒素[1]，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，是目前已知致癌性最強(qiáng)的天然毒素[2]，1993年被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)劃定為1類致癌物[3]。中藥材在生產(chǎn)、加工、貯藏、運(yùn)輸?shù)冗^程中，受溫度或濕度的變化極易發(fā)生霉變而污染黃曲霉毒素?！吨袊幍洹?020版收載了24種中藥材中黃曲霉毒素殘留的限量檢測，規(guī)定其中AFB1的含量不得高于5 μg/kg。通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)中藥材或中藥飲片中受黃曲霉毒素污染的情況十分普遍。楊美華等[4]檢測了14種中藥材的29批樣品，發(fā)現(xiàn)被AFB1污染的有12批，含量最高達(dá)32.18 μg/kg。沈緊治等[5]對35種中藥飲片中AFB1的含量進(jìn)行測定，結(jié)果有17種中藥飲片被AFB1污染。趙祥升等[6]整理并分析了2000年以來中藥中AFB1檢測呈陽性結(jié)果的文獻(xiàn)，統(tǒng)計(jì)顯示149種中藥的1 168批樣品中檢出AFB1，陽性樣品超標(biāo)率達(dá)52.40%。

目前，黃曲霉毒素的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)[9]等。這些方法定量準(zhǔn)確、靈敏度高、抗干擾性強(qiáng)，但成本高昂、操作繁瑣、費(fèi)時(shí)耗力，不利于中藥中黃曲霉毒素的快速檢測，難以普及[10]。近年新發(fā)展起來的核酸信號放大技術(shù)，無論在儀器要求還是實(shí)際操作方面，均比傳統(tǒng)檢測技術(shù)有了長足的進(jìn)步，不僅擺脫了對精良設(shè)備的依賴，操作上也更為簡單方便。酶輔助靶標(biāo)循環(huán)信號放大技術(shù)是基于核酸內(nèi)切酶/核酸外切酶水解方式的差異性與核酸適配體技術(shù)、酶切循環(huán)效應(yīng)、納米技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)等相結(jié)合，發(fā)展而成的一種等溫核酸信號放大技術(shù)[11]。它具有反應(yīng)條件溫和、信號放大效率高、能在恒溫條件下進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)。酶輔助靶標(biāo)循環(huán)信號放大技術(shù)結(jié)合熒光[12]、比色[13]、化學(xué)發(fā)光[14]和電化學(xué)發(fā)光[15]等檢測技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)生物分子的高靈敏檢測。

G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶是一種由富含鳥嘌呤堿基G的核酸四鏈體和氯化血紅素(Hemin)形成的生物催化DNA酶[16]。它具有類似辣根過氧化物酶(HRP)的活性，可以在氯化血紅素作用下催化H2O2介導(dǎo)的多種底物的氧化，如3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)[17]。與其他DNA酶或蛋白酶相比，G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶因具有制備成本較低、不易水解、易于修飾以及熱穩(wěn)定性較高等明顯優(yōu)勢[18]，被廣泛用于核酸[19]、蛋白質(zhì)[20]、金屬離子[21]和小分子[22]的高靈敏檢測。

本文結(jié)合酶輔助靶標(biāo)循環(huán)信號放大技術(shù)和G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶，構(gòu)建了一種簡單、靈敏、低成本的免標(biāo)記化學(xué)發(fā)光適體傳感器。利用適體特異性結(jié)合目標(biāo)AFB1，核酸外切酶I (Exo I)特異性地剪切單鏈DNA的特性[23]，所構(gòu)建的酶輔助靶標(biāo)循環(huán)信號放大策略實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)AFB1的循環(huán)再利用，極大地提高了適體傳感器的檢測靈敏度。同時(shí)，G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶被巧妙地編碼到發(fā)夾探針中用作化學(xué)發(fā)光的信號分子，避免了發(fā)夾探針的熒光標(biāo)記和化學(xué)修飾。該適體傳感器制備成本低，操作簡單，對AFB1的檢測靈敏度高、線性范圍寬，并成功地應(yīng)用于中藥材樣品中AFB1的測定，顯示了良好的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SpectraMax M5e多功能酶標(biāo)儀(美谷分子儀器(上海)有限公司)；PHSJ-3F型精密酸度計(jì)(上海雷磁儀器有限公司)；Eppendorf 5417R小型臺式冷凍型離心機(jī)(艾本德中國有限公司)；HS3120D超聲波清洗器(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)。

黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素M1(AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)購自中國廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司；DEPC處理水和核酸外切酶I(Exo I)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；10×NEBuffer 3.1購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司；三(羥甲基-1)氨基甲烷(Tris)、2-(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基)乙磺酸(HEPES)、3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)、氯化血紅素和H2O2購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；當(dāng)歸、黨參和黃芪購自無錫市中醫(yī)院。本文所用寡核苷酸由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其序列(見圖1A)的顏色與圖1B中的顏色相同。

1.2 發(fā)夾探針H1、H2和適體探針H1-S1的制備

發(fā)夾探針H1和H2：將寡核苷酸H1和H2的粉末以12 000 r/min離心5 min，分別加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(200 mmol/L NaCl，20 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，pH 7.4)配成10 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液。將H1和H2的儲備液分別加熱至95 ℃，保持10 min后，緩慢冷卻至室溫以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

適體探針H1-S1：將寡核苷酸S1的粉末以12 000 r/min離心5 min，加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液配成10 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液。將50 μL 10 μmol/L H1和50 μL 10 μmol/L S1混合，37 ℃孵育30 min，待H1和S1充分雜交后得到適體探針H1-S1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，濃度為5 μmol/L，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 核酸外切酶I輔助的靶標(biāo)循環(huán)

將8 μL 1 μmol/L適體探針H1-S1、1 μL一定濃度的AFB1和1 μL 10 U/μL核酸外切酶I依次加入40 μL 1×NEBuffer 3.1緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，100 μg/mL BSA，pH 7.9)中，37 ℃孵育60 min。然后，將反應(yīng)液加熱至80 ℃，保持15 min使核酸外切酶I失活，自然冷卻至室溫。再加入10 μL 1 μmol/L發(fā)夾探針H2和40 μL 1×NEBuffer 3.1緩沖液，37 ℃孵育30 min，自然冷卻后得到酶輔助靶標(biāo)循環(huán)的反應(yīng)產(chǎn)物。

1.4 G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶的制備及化學(xué)發(fā)光檢測

將10 μL 2 μmol/L氯化血紅素和40 μL 25 mmol/L HEPES緩沖液(200 mmol/L NaCl，20 mmol/L KCl，1%二甲基亞砜，pH 7.4) 加入上述反應(yīng)產(chǎn)物中，室溫孵育60 min以形成G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶。然后加入25 μL 1 mmol/L魯米諾和25 μL 1 mmol/L H2O2，最終體積為200 μL。使用SpectraMax M5e多功能酶標(biāo)儀記錄各樣品溶液的化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度，檢測步長設(shè)為2 nm，收集380 ～510 nm范圍內(nèi)的化學(xué)發(fā)光光譜，最大發(fā)射波長為418 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器的檢測原理

圖1B為基于酶輔助靶標(biāo)循環(huán)的適體傳感器檢測AFB1的原理圖。如圖所示，該適體傳感器主要由適體探針H1-S1、發(fā)夾探針H2、核酸外切酶I、氯化血紅素、魯米諾和H2O2組成。適體探針H1-S1和發(fā)夾探針H2均含有一段G-四鏈體序列(共18個(gè)堿基)，一部分位于發(fā)夾的環(huán)狀區(qū)(12個(gè)堿基)，另一部分位于發(fā)夾的莖稈區(qū)(6個(gè)堿基)。當(dāng)適體探針和發(fā)夾探針未打開時(shí)，該段序列不能折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，因而不能結(jié)合氯化血紅素形成G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶。

當(dāng)體系中不存在目標(biāo)AFB1時(shí)，適體探針H1-S1和核酸外切酶I兩者穩(wěn)定共存，彼此不發(fā)生相互作用。這是因?yàn)檫m體探針H1-S1的末端是完全匹配的雙鏈結(jié)構(gòu)，而核酸外切酶I是單鏈特異性外切酶，不分解雙鏈DNA。將核酸外切酶I滅活后，加入發(fā)夾探針H2，適體探針H1-S1的末端因完全匹配的雙鏈結(jié)構(gòu)同樣不會和H2發(fā)生作用，使得兩個(gè)探針在體系中共存。由于適體探針和發(fā)夾探針未打開，加入氯化血紅素不會形成G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶，整個(gè)體系的化學(xué)發(fā)光信號可忽略不計(jì)。當(dāng)體系中存在目標(biāo)AFB1時(shí)，由于適體和靶標(biāo)間的高親和性，適體序列S1從適體探針H1-S1上脫離并與AFB1結(jié)合形成復(fù)合物AFB1-S1，適體探針H1-S1變?yōu)榘l(fā)夾探針H1。核酸外切酶I具有從3′-5′方向降解單鏈DNA的外切酶活性，能識別復(fù)合物AFB1-S1并逐步催化降解適體序列S1，釋放出目標(biāo)AFB1[24]。釋放的AFB1可以結(jié)合一個(gè)新的適體探針形成復(fù)合物，接著再次被核酸外切酶I剪切后釋放，不斷循環(huán)參與結(jié)合/剪切反應(yīng)，構(gòu)成酶輔助的靶標(biāo)循環(huán)(Cycle)。在靶標(biāo)不斷循環(huán)的過程中，生成了大量的發(fā)夾探針H1。這些發(fā)夾探針具有單鏈的3′-末段支臂，同樣被核酸外切酶I剪切，而單鏈的5′-末段支臂未被剪切得以保留。核酸外切酶I滅火處理后，加入發(fā)夾探針H2與帶有5′-末段單鏈支臂的發(fā)夾探針H1結(jié)合，生成復(fù)合物H1-H2。兩個(gè)探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，暴露出完整的G-四鏈體序列。G-四鏈體序列進(jìn)一步折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并結(jié)合氯化血紅素形成G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶。這些DNA酶可以催化氧化魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光體系，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，從而實(shí)現(xiàn)AFB1的放大檢測。

圖1 3種核苷酸的序列(A)以及基于酶輔助靶標(biāo)循環(huán)的適體傳感器檢測AFB1的原理圖(B)Fig.1 Sequences of three oligonucleotides(A) ,and schematic diagram of AFB1 detection by aptasensor based on enzyme-assisted target recycling(B)

2.2 傳感器的信號放大效果

為了驗(yàn)證酶輔助靶標(biāo)循環(huán)策略的信號放大效果，在適體傳感器的設(shè)計(jì)上移除了核酸外切酶I，從而構(gòu)建了無信號放大的適體傳感器(圖2)。如圖2A所示，該適體傳感器主要由適體探針H1-S1、發(fā)夾探針H2、氯化血紅素、魯米諾和H2O2組成。同樣地，當(dāng)不存在目標(biāo)AFB1時(shí)，兩個(gè)探針在體系中穩(wěn)定共存，彼此不發(fā)生相互作用。

圖2 無信號放大的適體傳感器檢測AFB1的原理圖(A)，以及無信號放大的適體傳感器和酶輔助 靶標(biāo)循環(huán)的適體傳感器對同一濃度AFB1的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)圖(B)Fig.2 Schematic diagram of AFB1 detection by aptasensor without signal amplification (A),and chemiluminescence responses of the aptasensor without signal amplification and the aptasensor with enzyme-assisted target recycling to the same concentration of AFB1 (B)

當(dāng)存在目標(biāo)AFB1時(shí)，適體序列S1和目標(biāo)AFB1結(jié)合形成復(fù)合物AFB1-S1并從適體探針H1-S1上脫離，適體探針H1-S1變?yōu)榘l(fā)夾探針H1，并進(jìn)一步與發(fā)夾探針H2進(jìn)行雜交形成復(fù)合物H1-H2，導(dǎo)致發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開并暴露出完整的G-四鏈體序列。G-四鏈體序列進(jìn)一步折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并結(jié)合氯化血紅素生成G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶。這些DNA酶催化氧化魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光體系，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。圖2B是無信號放大的適體傳感器和酶輔助靶標(biāo)循環(huán)的適體傳感器對同一濃度AFB1(100 ng/mL)的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)圖。在無目標(biāo)AFB1的情況下，兩種傳感器均顯示出較低的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)(曲線a和b)。這說明適體探針H1-S1在溶液中既不會被核酸外切酶I剪切，也不會和發(fā)夾探針H2雜交。加入目標(biāo)AFB1后，無信號放大的傳感器可檢測到1個(gè)明顯的化學(xué)發(fā)光信號(曲線c)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在生物傳感器構(gòu)建過程中引入信號放大策略可顯著提高檢測靈敏度[25]。正如預(yù)期，采用酶輔助靶標(biāo)循環(huán)信號放大策略構(gòu)建的適體傳感器的化學(xué)發(fā)光信號(曲線d)明顯強(qiáng)于無信號放大的適體傳感器，信號增強(qiáng)了74.43%，表明所構(gòu)建的適體傳感器具有良好的信號放大效果。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 適體探針H1-S1濃度的優(yōu)化考察了不同濃度(20、30、40、50、60 nmol/L)適體探針H1-S1對AFB1檢測的影響。結(jié)果顯示，在適體探針濃度為40 nmol/L時(shí)，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比值I/I0最大，其中I和I0分別表示存在和不存在AFB1時(shí)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(λem=418 nm)。因此選擇適體探針H1-S1的最佳濃度為40 nmol/L。

2.3.2 核酸外切酶I用量的優(yōu)化考察了不同核酸外切酶I用量(6、8、10、12、14 U)對AFB1檢測的影響。結(jié)果顯示，隨著核酸外切酶I用量的增加，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸增加，但變化不大?？紤]到核酸外切酶I的性價(jià)比，選擇核酸外切酶I的最佳用量為10 U。

2.3.3 靶標(biāo)循環(huán)反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化考察了不同靶標(biāo)循環(huán)反應(yīng)時(shí)間(40、50、60、70、80 min)對AFB1檢測的影響。結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度迅速增加然后趨于平緩，60 min后進(jìn)入平臺期。因此選擇靶標(biāo)循環(huán)反應(yīng)時(shí)間為60 min。

2.3.4 適體探針H2濃度的優(yōu)化考察了不同濃度(30、40、50、60、70 nmol/L)發(fā)夾探針H2對AFB1檢測的影響。結(jié)果顯示，加入50 nmol/L發(fā)夾探針H2時(shí)，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比值最大。因此選擇發(fā)夾探針H2的最佳濃度為50 nmol/L。

2.4 黃曲霉毒素B1的檢測

為了考察所構(gòu)建適體傳感器的檢測性能，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測試了該適體傳感器對不同質(zhì)量濃度(0、0.001、0.01、0.1、1、10、100 ng/mL) AFB1的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)。如圖3A所示，隨著目標(biāo)AFB1質(zhì)量濃度在0～100 ng/mL范圍內(nèi)增加，其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也相應(yīng)增加。從圖3B可以看出，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與AFB1質(zhì)量濃度呈指數(shù)對應(yīng)的關(guān)系。此外，由插圖可見，當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度在0.001～100 ng/mL范圍內(nèi)時(shí)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(I)與AFB1質(zhì)量濃度的對數(shù)(lgC)呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為I=42 952+10 888lgC，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995 5。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算得到AFB1的檢出限為0.93 pg/mL。

2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

特異性是衡量傳感器性能的重要指標(biāo)。選擇黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素M1(AFM1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)作為潛在的干擾物質(zhì)(圖4A為其化學(xué)結(jié)構(gòu)式)，考察了適體傳感器的特異性。由圖4B可見，ZEN和OTA的化學(xué)發(fā)光信號和空白(Blank) 的化學(xué)發(fā)光信號無明顯差異。AFB2、AFG1、AFM1與AFB1的分子結(jié)構(gòu)相似，雖然同屬于黃曲霉毒素家族，但其化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度僅略高于ZEN和OTA，而目標(biāo)AFB1的化學(xué)發(fā)光信號明顯增強(qiáng)。結(jié)果表明所構(gòu)建的適體傳感器對AFB1具有良好的特異性。進(jìn)一步使用無信號放大的適體傳感器對同濃度的干擾物質(zhì)進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。通過對比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用信號放大策略的適體傳感器的IAFB1/IAFB2比值顯著高于無信號放大的適體傳感器的比值，表現(xiàn)出更為優(yōu)良的特異性。這是因?yàn)樵谶m體本身高特異性的基礎(chǔ)上，信號放大策略可以進(jìn)一步放大同家族成員間的差異，導(dǎo)致IAFB1/IAFB2比值升高。因此，該適體傳感器的優(yōu)良特異性可歸因于適體和靶標(biāo)分子間的高特異性與酶輔助靶標(biāo)循環(huán)策略的高信號放大效率。

2.6 中藥材樣品中AFB1的檢測

選取當(dāng)歸、黨參和黃芪3種中藥材作為實(shí)際樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，以評估適體傳感器對實(shí)際樣品的檢測能力。準(zhǔn)確稱取2 g中藥材樣品，加入5 mL甲醇-水(體積比6∶4)萃取液，浸泡60 min后超聲處理45 min，然后將混合物以3 000 r/min離心5min。提取1 mL上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾后，用1×NEBuffer 3.1緩沖液定容至10 mL。將3種質(zhì)量濃度水平(1、10、100 ng/mL)的AFB1加標(biāo)至稀釋的樣品溶液中進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測定3次。計(jì)算得AFB1的回收率為93.7%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.7%～6.4%，表明所構(gòu)建的適體傳感器可用于中藥材樣品中AFB1的檢測。

3 結(jié) 論

本文基于酶輔助靶標(biāo)循環(huán)信號放大策略成功構(gòu)建了一種用于AFB1高靈敏檢測的適體傳感器。所設(shè)計(jì)的適體探針和發(fā)夾探針，以G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶為信號分子，無需任何化學(xué)修飾和熒光標(biāo)記，制備成本低。整個(gè)反應(yīng)在等溫均一的溶液中進(jìn)行，無需復(fù)雜的分離程序和耗時(shí)的熱循環(huán)，操作簡單。該適體傳感器對AFB1的檢測靈敏度高、線性范圍寬、特異性好，并成功地應(yīng)用于中藥材樣品中AFB1的測定。