戴勝云,馬青青,蔣雙慧,劉 杰,過立農(nóng), 喬 菲,周 娟,喬延江,鄭 健*,馬雙成*

(1.中國食品藥品檢定研究院,北京 100050；2.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院,青海 西寧 810016；3.中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院,江蘇 南京 210009；4.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院,四川 成都 611730； 5.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥信息學(xué)系,北京 102400)

附子(AconitiLateralisRadixPraeparata)為毛茛科烏頭屬植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.子根的加工品,是《中國藥典》2015年版一部的收載品種[1],屬于常用大宗中藥材,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為下品,具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽的功效,有“回陽救逆第一品”之稱[2]。附子的道地性比較顯著,道地產(chǎn)區(qū)主要為四川,尤其是江油等地,另外湖北和湖南等地也有產(chǎn)出。附子飲片包括黑順片、白附片、炮附片和淡附片,黑順片和白附片是市場(chǎng)上的常見中藥飲片,為常用有毒中藥[1]。研究表明,附子中的新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿等生物堿類成分,既是有效成分,也是毒性成分,均具有鎮(zhèn)痛和抗炎等作用,其中的3個(gè)雙酯型生物堿——新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿為劇毒性成分。附子經(jīng)炮制后,其劇毒的雙酯型生物堿降解為毒性較輕的單酯型生物堿[3]。《中國藥典》(2015年版)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定附子中單酯型生物堿(包括苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿)的總量不得少于0.01%；雙酯型生物堿(新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿)的總量不得過0.02%[1]。

現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)附子中的化學(xué)成分含量進(jìn)行測(cè)定時(shí),一般采用高效液相色譜與QDA質(zhì)譜聯(lián)用、等離子體質(zhì)譜法、高效液相色譜法和超高效液相色譜法[4-7]。這些方法均需對(duì)樣品進(jìn)行前處理,耗時(shí)較長(zhǎng),一般需在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)工作。而近紅外光譜因具有快速、無損、無需樣品前處理等優(yōu)點(diǎn)廣泛用于中藥各個(gè)領(lǐng)域,如中藥原料藥、中藥輔料、中藥制劑的質(zhì)量分析[8-10],以及中藥制藥過程的在線監(jiān)測(cè)與控制研究[11-13]、中藥產(chǎn)品實(shí)時(shí)放行策略[14-15]等,是中藥質(zhì)量快速分析的一種新方法。

為進(jìn)一步了解市場(chǎng)上附子飲片的質(zhì)量現(xiàn)狀,中國食品藥品檢定研究院民族藥室于2019年中藥飲片專項(xiàng)抽驗(yàn)中選擇附子開展專項(xiàng)抽驗(yàn)工作,共抽樣199批,檢驗(yàn)其【性狀】和【薄層色譜】項(xiàng),合格率為100%。由于上述6種雙酯型或單酯型生物堿在含量測(cè)定時(shí),前處理和色譜條件較復(fù)雜,耗時(shí)且檢測(cè)成本較高,故本研究從抽檢樣品中選擇部分樣品,采集近紅外光譜數(shù)據(jù),對(duì)比偏最小二乘(PLS)和最小二乘支持向量機(jī)(LS-SVM)定量校正模型,預(yù)測(cè)附子中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿6個(gè)成分以及雙酯型生物堿總量和單酯型生物堿總量,判斷附子的【檢查】項(xiàng)和【含量測(cè)定】項(xiàng)是否合格,以期為實(shí)現(xiàn)快速無損的附子質(zhì)量控制提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

GSA近紅外光譜儀(山東金璋隆祥智能科技有限責(zé)任公司)；UltiMate3000型高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器)(賽默飛世爾公司),Waters XBridge?C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱；萬分之一、十萬分之一電子天平(賽多利斯公司);KQ-300DA型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

苯甲酰新烏頭原堿(批號(hào)111785-201805,純度93.1%)；苯甲酰烏頭原堿(批號(hào)111794-201705,純度99.1%)；苯甲酰次烏頭原堿(批號(hào)111796-201705,純度98.6%)；新烏頭堿(批號(hào)110799-201608,純度98.5%)；次烏頭堿(批號(hào)110798-201609,純度99.2% )；烏頭堿(批號(hào)110720-201312,純度98.7%)均來自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、異丙醇均為色譜純,濃氨溶液、乙酸乙酯、冰醋酸、三乙胺均為分析純,水為Milli-Q純化水。

白附片、黑順片、炮附片藥材均為2019年度國家藥品抽驗(yàn)計(jì)劃抽驗(yàn)樣品,自行收集樣品為本課題組赴四川江油調(diào)研期間收集。所有樣品經(jīng)中國食品藥品檢定研究院中藥所民族藥室鑒定為合格藥材。樣品粉碎后過3號(hào)篩,備用。樣品信息見表1。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information

1.2 供試品溶液的制備

取本品粉末約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加氨試液3 mL,精密加入異丙醇-乙酸乙酯(體積比,1∶1，下同)混合溶液50 mL,稱定重量,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz,水溫25 ℃以下)30 min,放冷,再稱定重量,用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL,40 ℃以下減壓回收溶劑至干,殘?jiān)芗尤胍译?水(體積比，21∶79,下同)混合溶液3 mL溶解,用0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

1.3 混合對(duì)照品溶液的制備

分別取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿對(duì)照品適量,精密稱定,用乙腈-0.2%冰醋酸溶液(21∶79)溶解并定容,制成每1 mL含苯甲酰新烏頭原堿453.2 μg、苯甲酰烏頭原堿549.4 μg、苯甲酰次烏頭原堿545.8 μg、新烏頭堿100.2 μg、次烏頭堿110.9 μg、烏頭堿113.0 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL至10 mL容量瓶中,加乙腈-0.2%冰醋酸溶液(21∶79)配制成上述6個(gè)成分別約50、50、50、10、10、10 μg·mL-1的混合溶液,即得。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 液相色譜條件色譜柱：Waters XBridge?C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；乙腈(A)-0.2%冰醋酸溶液(三乙胺調(diào)pH值至6.20)(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫：0～30 min,21%～29%A；30～51 min,29%～35%A；51～56 min,35%A；流速1.0 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL。

1.4.2 近紅外光譜條件使用近紅外光譜儀采集樣品的近紅外光譜。取已過3號(hào)篩的附子飲片粉末適量(盡量保證不同樣品的取樣量一致),混合均勻后倒入樣品杯,壓實(shí)。以內(nèi)置背景為參比,采用漫反射的方式采集樣品光譜圖,掃描范圍1 550～1 950 nm,掃描次數(shù)32,分辨率16 cm-1,溫度(25±2)℃,相對(duì)濕度(55±2)%。每份樣品重復(fù)測(cè)定3次(每次測(cè)定結(jié)束后將樣品重新倒回自封袋,混合均勻后進(jìn)行下一次測(cè)定),取平均光譜用于后續(xù)數(shù)據(jù)處理及建模以減少誤差。

2 結(jié)果與討論

2.1 附子HPLC方法學(xué)考察結(jié)果

經(jīng)方法學(xué)考察,得到苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的線性范圍分別為9.0～453.2、10.9～549.4、10.9～545.8、2.0～100.2、2.2～110.9、2.2～113.0 μg·mL-1,相關(guān)系數(shù)均為0.999 9,表明各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。6種生物堿的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性(48 h)均符合要求。

當(dāng)信噪比為3時(shí),苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的檢出限分別為0.27、0.36、0.37、0.23、0.26、0.36 μg·mL-1；當(dāng)信噪比為10時(shí),其對(duì)應(yīng)的定量下限分別為1.04、1.16、1.23、1.18、1.26、2.05 μg·mL-1。

取已知含量黑順片樣品粉末6份(13號(hào)樣品),每份約1 g,置于具塞錐形瓶中,分別精密加入對(duì)照品溶液(苯甲酰新烏頭原堿3.606 7 μg·mL-1、苯甲酰烏頭原堿0.477 7 μg·mL-1、苯甲酰次烏頭原堿0.489 8 μg·mL-1、新烏頭堿1.410 5 μg·mL-1、次烏頭堿1.267 7 μg·mL-1、烏頭堿0.239 8 μg·mL-1) 50 mL,按照“1.2”方法制備供試品溶液,按“1.4.1”色譜方法測(cè)定,計(jì)算回收率,得上述6個(gè)成分的回收率依次為99.9%、95.2%、97.6%、104%、101%、86.8%,表明各化合物回收率良好。

2.2 樣品測(cè)定

取各附子樣品,按“1.2”方法制備供試品溶液,按照“1.4.1”色譜條件進(jìn)行試驗(yàn),測(cè)定峰面積,用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中各成分的含量,并以此含量作為參考值,建立參考值與NIR光譜數(shù)據(jù)之間的定量校正模型。

圖1 附子的近紅外光譜圖Fig.1 NIR spectrogram of Aconiti Lateralis Radix Praeparata

2.3 NIR定量校正模型的建立

38批附子樣品的NIRS光譜見圖1。采用PLS和LS-SVM分別建立上述6種生物堿及單酯型生物堿總量和雙酯型生物堿總量校正模型的近紅外定量校正模型。數(shù)據(jù)處理均在Unscramber數(shù)據(jù)分析軟件(version 9.6,CAMO軟件公司)和MATLAB(version 7.0,Math works公司)軟件上完成。數(shù)據(jù)處理工具包分別為PLS toolbox和LS-SVM lab toolbox1.8。

采用化學(xué)計(jì)量學(xué)指示參數(shù)——相關(guān)系數(shù)(r)、校正均方根誤差(RMSEC)、交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)、預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)[16-17]和相對(duì)預(yù)測(cè)偏差(RPD)[18]進(jìn)行模型評(píng)價(jià)。其中RPD值越大,所對(duì)應(yīng)的校正模型的預(yù)測(cè)性能越好,當(dāng)RPD大于3時(shí),表明模型具有很好的預(yù)測(cè)性能；當(dāng)RPD小于2.5時(shí),表明模型預(yù)測(cè)性能差,不適于定量分析。在分析中,需綜合考慮校正集、驗(yàn)證集和交叉驗(yàn)證的結(jié)果,且在校正集和驗(yàn)證集相關(guān)參數(shù)接近時(shí)建立最優(yōu)化模型。

2.3.1 樣本集的選擇恰當(dāng)?shù)剡x取具有代表性的校正集將直接影響所建模型的準(zhǔn)確性和實(shí)用性,是建模成功的前提。選擇常用的K-S樣本集劃分方法,使校正集和驗(yàn)證集的樣品比例數(shù)約為2∶1,其中26個(gè)樣本作為校正集,剩余12個(gè)樣本作為驗(yàn)證集,校正集與驗(yàn)證集的數(shù)據(jù)分布如表2所示。

表2 校正集與驗(yàn)證集的數(shù)據(jù)分布Table 2 The data distribution for calibration set and validation set (%)

2.3.2 不同光譜預(yù)處理方法的選擇由于在NIR光譜的采集過程中,儀器狀態(tài)、樣品狀態(tài)及測(cè)量條件的差異會(huì)造成NIR光譜的偏差或旋轉(zhuǎn),需采用適當(dāng)?shù)念A(yù)處理方法予以矯正。本文分別采用多元散射校正(MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)、正則化變換(Normalize)、基線校正(Baseline)、光譜變換(ST)、光譜去噪(WDS)、S-G平滑加1階導(dǎo)數(shù)(SG-1st)和S-G平滑加2階導(dǎo)數(shù)(SG-2nd)(平滑點(diǎn)包括9和11)等預(yù)處理方法進(jìn)行處理。

2.3.3 偏最小二乘模型采用PLS建立定量模型時(shí),最優(yōu)潛變量因子數(shù)由留一交叉驗(yàn)證法(LOO)和預(yù)測(cè)誤差平方和(PRESS)獲得。模型性能采用RPD、RMSEC、RMSECV、RMSEP及其相應(yīng)相關(guān)系數(shù)r(rcal和rpre)進(jìn)行評(píng)價(jià)。相關(guān)系數(shù)越大,各類誤差越小,RPD值越大,說明模型性能越好。由表3可知,苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和單酯型生物堿總量分別在采用MSC(或SNV)、SNV、MSC和MSC預(yù)處理方法時(shí)所建的PLS模型優(yōu)于其他方法；3種雙酯型生物堿及其總量則在采用Baseline預(yù)處理方法時(shí)所建的PLS模型性能較好。分別采用其最優(yōu)預(yù)處理方法對(duì)6個(gè)成分及單酯型和雙酯型生物堿總量進(jìn)行建模。如表3所示,單酯型生物堿及其總量和雙酯型生物堿及其總量的RPD值均較小,最大值僅為3.8(雙酯型生物堿總量),多數(shù)模型的RPD值小于3,說明PLS模型的性能不高,需進(jìn)一步提高模型的可靠性。因PLS模型為線性關(guān)系,故考慮建立非線性的最小二乘支持向量機(jī)模型。

表3 采用不同預(yù)處理方法的PLS模型參數(shù)Table 3 The PLS model with different pre-processing methods

*original spectrum(Raw),multiplicative scatter correction(MSC),standard normal variate transformation(SNV),baseline,normalize,spectroscopic transformation(ST),wavelet denosing of spectra(WDS),Savitzky-Golay smoothing with 9 points(SG(9)) plus first-order derivatives(SG9-1st),SG(9) plus second-order derivatives(SG9-2nd),SG(11) plus first-order derivatives(SG11-1st),and SG(11) plus second-order derivatives(SG11-2nd)

2.3.4 最小二乘支持向量機(jī)模型支持向量機(jī)是由Vapnik在統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)理論的基礎(chǔ)上建立的一種非常有效的機(jī)器學(xué)習(xí)方法[19],最初用于模式識(shí)別,目前在信號(hào)處理、系統(tǒng)辨識(shí)與建模、先進(jìn)控制和軟測(cè)量等領(lǐng)域均得到了廣泛應(yīng)用。最小二乘支持向量機(jī)(LS-SVM)作為支持向量機(jī)(SVM)的一種類型[19],已越來越廣泛地運(yùn)用于各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域。Chauchard等[20]研究指出,LS-SVM模型考慮了自變量和因變量之間的非線性關(guān)系。

采用LS-SVM建立定量模型時(shí),評(píng)價(jià)參數(shù)為RPD、偏差(BIAS)、RMSEP及其相應(yīng)決定系數(shù)r(rcal和rpre)。在基于LS-SVM建立定量模型時(shí)需要對(duì)兩個(gè)超參數(shù)gam和sig2通過交叉驗(yàn)證進(jìn)行優(yōu)化。gam是正則化參數(shù),用于確定訓(xùn)練誤差最小化和預(yù)測(cè)函數(shù)平滑度的平衡；sig2是高斯徑向基(Gaussian radial basis function)核函數(shù)參數(shù)。

表4為不同預(yù)處理方法下LS-SVM的建模結(jié)果?？梢钥闯?苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、單酯型生物堿總量和雙酯型生物堿總量的最佳預(yù)處理方法分別為SNV、MSC、SG9-1st、WDS、SG9-1st、SNV(或MSC)和Baseline,其中烏頭堿不經(jīng)過光譜預(yù)處理也能建立很好的模型,故采用原始光譜建立烏頭堿的LS-SVM模型。

表4 不同預(yù)處理方法的LS-SVM模型參數(shù)Table 4 The LS-SVM model with different pre-processing methods

將原始光譜進(jìn)行最佳光譜預(yù)處理后,建立LS-SVM校正模型。LS-SVM的兩個(gè)超參數(shù)通過交叉驗(yàn)證進(jìn)行優(yōu)化,模型參數(shù)如表4所示。其中,苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿、單酯型生物堿總量和雙酯型生物堿總量所建模型的RPD分別為3.3、3.2、4.1、7.7、8.8、7.6、4.0和8.6。相較于PLS模型,RPD得到顯著提升。如圖2所示,6種生物堿及單酯型生物堿總量和雙酯型生物堿總量定量校正模型的相關(guān)系數(shù)均在0.9以上,RMSEC和RMSEP均在0.1以下,說明NIR模型預(yù)測(cè)值和HPLC測(cè)定值有較好的線性關(guān)系,模型擬合能力良好。苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿、單酯型生物堿總量和雙酯型生物堿總量所建模型的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的偏差分別為0.003 3、0.000 6、0.001 9、0.001 5、0.002 4、0.000 6、0.004 8和0.004 3。表明應(yīng)用近紅外光譜結(jié)合LS-SVM建模方法可以準(zhǔn)確快速地進(jìn)行附子中單酯型生物堿和雙酯型生物堿的含量預(yù)測(cè),對(duì)于附子的質(zhì)量控制有一定的指導(dǎo)意義。

2.3.5 PLS與LS-SVM建模結(jié)果的比較以附子中的3個(gè)單酯型生物堿及其總量和3個(gè)雙酯型生物堿及其總量共計(jì)8個(gè)數(shù)值為研究對(duì)象,對(duì)比了LS-SVM模型和PLS模型的建模效果,結(jié)果如表5所示。由表可知,對(duì)于上述8個(gè)數(shù)值,LS-SVM模型的預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)均得到不同程度的下降；驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)rpre和RPD則得到不同程度的提升。對(duì)于建模預(yù)測(cè)結(jié)果而言,驗(yàn)證集的相關(guān)系數(shù)越大,越接近1,預(yù)測(cè)均方根誤差越小,相對(duì)預(yù)測(cè)偏差越大,表明模型預(yù)測(cè)性能越好。由對(duì)比結(jié)果可知,LS-SVM的預(yù)測(cè)性能相比PLS模型均有不同程度的提高,這是由于LS-SVM模型考慮了自變量和因變量之間的非線性關(guān)系,改善了其預(yù)測(cè)性能。而本次實(shí)驗(yàn)的對(duì)象是附子粉碎后的樣品,樣品的粒徑大小可能會(huì)對(duì)建模結(jié)果有影響,而建模結(jié)果的提高則表明NIR光譜與粒徑之間可能存在著一些非線性關(guān)系。

圖2 附子中6個(gè)生物堿及其總量實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖Fig.2 Correlation between measured value and predicted value for the 6 components in Aconiti Lateralis Radix Praeparata A-H:benzoylmesaconine;benzoylaconine;benzoylhypaconine;meaconitine;hypaconitine;aconitin;the total of monoester-type alkaloids;the total of diester-type alkaloid

表5 PLS模型和LS-SVM模型建模預(yù)測(cè)結(jié)果比較Table 5 The comparison of the prediction results between PLS and LS-SVM

3 結(jié) 論

本文以附子為研究對(duì)象,對(duì)其中的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿、單酯型生物堿總量和雙酯型生物堿總量進(jìn)行了近紅外光譜快速測(cè)定，并比較了PLS和LS-SVM兩種建模方法的性能。結(jié)果表明，LS-SVM性能顯著優(yōu)于PLS,說明附子中生物堿的量與NIR光譜預(yù)測(cè)值之間存在非線性關(guān)系。通過本研究建立的方法,基于近紅外光譜結(jié)合LS-SVM建?？梢钥焖兕A(yù)測(cè)雙酯型生物堿總量和單酯型生物堿總量,方法操作簡(jiǎn)單,無需樣品預(yù)處理,實(shí)現(xiàn)了快速、綠色分析的目的,也為更好控制附子藥材質(zhì)量提供了幫助。