尕 曼，賀玖明，張瑞萍，李舒冉，劉慶山， 更 桑，多杰仁青，再帕爾·阿不力孜,*

(1.中國醫(yī)學科學院 藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050；2.中央民族大學 藥學院，民族醫(yī)藥教育部重點實驗室，北京 100081；3.西藏藏醫(yī)藥大學 附屬醫(yī)院，西藏 拉薩 850000)

阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease，AD)是一種以進行性認知功能減退為特征的神經(jīng)退行性疾病[1]，我國AD患者已達600萬，是全球AD患者數(shù)量最多的國家[2]，因此加快發(fā)現(xiàn)及研發(fā)緩解或治療AD的藥物具有重要的現(xiàn)實意義。由于AD復雜的發(fā)病機制，多個單一特異靶點候選藥物的臨床研究遭遇失??；但發(fā)現(xiàn)多靶點的天然產(chǎn)物6-姜烯酚[3]、石衫堿甲等[4]在治療AD的臨床研究中顯示出顯著療效，因此研發(fā)治療AD的多靶點天然藥物或中藥(含民族醫(yī)藥)復方越來越備受關(guān)注。

藏藥學是在廣泛吸收、融合了中醫(yī)藥學及印度醫(yī)藥學等理論的基礎(chǔ)上，通過藏族人民在長期生產(chǎn)生活中實踐所形成的獨特醫(yī)藥體系。三味豆蔻湯是藏藥學中的經(jīng)典方劑，最早來源于著作《四部醫(yī)典》，由豆蔻、香旱芹、蓽茇等藥材組成，并經(jīng)牦牛奶煎湯內(nèi)服[5]。經(jīng)長期實踐，三味豆蔻湯在治療失眠[6]、心絞痛[7]等方面具有較多的臨床應(yīng)用。蒙醫(yī)學對該復方也有所研究，并將其稱之為蘇格木勒-3湯[7]。近年來，有研究指出三味豆蔻湯及其中單味藥材的成分具有改善認知、保護神經(jīng)細胞的功能，能夠?qū)D起到一定治療作用[8-14]。然而，對該方劑中的化學成分及其作用機制的研究較少，還缺乏相應(yīng)的質(zhì)量標準。因此，開展對三味豆蔻湯化學成分的系統(tǒng)分析，有助于了解該方劑的物質(zhì)基礎(chǔ)，為藥效或毒理及其后續(xù)藥理作用機制的研究提供科學依據(jù)。

因三味豆蔻湯由多味藥材熬煮而成，其化學組成復雜，所含成分的理化性質(zhì)差異大。據(jù)文獻報道，豆蔻、香旱芹兩種藥材中含有大量的揮發(fā)油類成分[15-19]；蓽茇中含有較高含量的生物堿類物質(zhì)(如胡椒堿、蓽茇明寧堿等[20-21])；而牦牛奶中含有大量氨基酸、脂肪酸等功效成分[22-23]。因此，針對三味豆蔻湯進行化學成分分析，采用單一分析技術(shù)的檢測能力有限。氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)作為效率高、重現(xiàn)性好的分析檢測技術(shù)之一，適用于揮發(fā)性、低極性及相對分子質(zhì)量較小成分分析(如揮發(fā)油、短鏈烷烴等[13])。而對于極性較大、熱不穩(wěn)定的非揮發(fā)性成分，液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)是理想的分析手段，其中超高效液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-HRMS/MS)技術(shù)結(jié)合了UPLC的高分離能力與質(zhì)譜技術(shù)的高靈敏度、高選擇性的結(jié)構(gòu)鑒定能力，適用于含量少、不易分離獲得或在分離過程中容易丟失的極性成分分析。若將GC-MS與UPLC-HRMS/MS技術(shù)聯(lián)合使用，可大大提高對檢測物的覆蓋范圍，獲得更多的成分信息[24-26]。因此，本研究采用GC-MS與UPLC-HRMS/MS技術(shù)，深入開展了三味豆蔻湯的化學成分分析。

1 實驗部分

1.1 藥材來源及制備

三味豆蔻湯制備所用藥材為印度豆蔻、香旱芹、蓽茇。其中，印度豆蔻為生姜科植物小豆蔻(ElettariacardamomumMaton)的成熟果實；香旱芹為傘形科植物孜然芹(CuminumcyminumL.)的干燥成熟果實；蓽茇為胡椒科胡椒屬植物蓽茇(PiperlongumL.)的干燥近成熟或成熟果穗；均由西藏藏醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供，并經(jīng)中央民族大學生命與環(huán)境科學學院植物學教授龍春林鑒定確認。

本研究根據(jù)藏藥三味豆蔻湯的制備方法：取適量印度豆蔻、香旱芹、蓽茇，粉碎后將其混合物置于4 ℃牦牛奶(購自青海金祁連乳液有限責任公司，生產(chǎn)許可證號：SC10563222201028)中浸泡過夜，然后煎煮至原體積的2/3，經(jīng)冷卻、過濾制得三味豆蔻湯儲備液，于-20 ℃冷藏，備用。

1.2 試劑與儀器

乙腈、甲醇(色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司)；甲酸、正己烷(色譜純，美國Merck公司)；甲基叔丁基醚、氯仿(分析純，北京化工廠)；實驗用水為純凈水(杭州娃哈哈集團)。

單通道微量移液器(德國Eppendorf公司)；Adventurer AR1140分析天平(美國OHAUS公司)；MS3渦旋混合器(德國IKA公司)；Sigma 3-30K高速臺式冷凍離心機(德國SIGMA公司)；A502220多孔氮吹儀(月旭科技股份有限公司)；ACQUITY UPLC I-Class液相色譜儀、UPLC HSS T3 色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm，美國Waters公司)；HP-5彈性石英毛細管柱、Q-orbitrap質(zhì)譜儀(QExactive，配Xcalibur.Ink數(shù)據(jù)處理軟件)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Captiva 96孔板過濾裝置、7890A/MSD5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配NIST05 MS Research質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫)(美國Agilent Technologies公司)。

1.3 GC-MS法

1.3.1 樣品前處理精密量取三味豆蔻湯10 mL，加入正己烷低溫萃取10 h后，振蕩240 s，離心取上清液，加入硫酸鎂除水干燥，經(jīng)氮氣吹干，再加入200 μL正己烷復溶、振蕩、離心、過濾，待GC-MS分析。

1.3.2 分析條件色譜條件：采用HP-5彈性石英毛細管柱進行氣相色譜分離，進樣口溫度為250 ℃。程序升溫：起始溫度60 ℃，保持5 min；以3 ℃/min升至90 ℃，保持5 min；再以2 ℃/min升至200 ℃；最后以4 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，總運行時間為100 min[13]。載氣為氦氣，恒流模式，流速為0.8 mL/min，分流比為5∶1，進樣量：1 μL。質(zhì)譜條件：電離源：電子轟擊源(EI)，離子源溫度：250 ℃，轟擊能量：70 eV。全掃描分析，質(zhì)荷比范圍：m/z50～550 Da。

1.4 UPLC-HRMS/MS法

1.4.1 樣品前處理樣品采用 “兩相提取法”處理，分別得到弱極性和強極性組分：精密吸取三味豆蔻湯100 μL至10 mL玻璃管中，加3 mL甲醇-甲基叔丁基醚(MeOH-MTBE，體積比1∶1)，于2 500 r/min渦旋5 min，再以4 200 r/min(4 ℃)離心10 min，吸取上清液至干凈的玻璃管中。向上清液中加入3 mL MTBE和1.2 mL H2O，2 500 r/min渦旋15 min，4 200 r/min(4 ℃)離心10 min，樣品分層為上層有機相和下層水相。將上層有機相轉(zhuǎn)入新的玻璃管中，得到弱極性組分萃取液；下層水相轉(zhuǎn)入2 mL EP管，得到強極性組分萃取液。將兩管樣品用氮氣吹干，在下層強極性提取物中加入100 μL 乙腈-水(ACN-H2O，體積比2∶98)復溶；上層弱極性提取物中加入400 μL 甲醇-三氯甲烷(MeOH-CHCl3，體積比1∶1)復溶。復溶樣品在2 500 r/min渦旋5 min，在4 ℃條件下，分別將強極性提取物和弱極性提取物經(jīng)12 500 r/min和4 500 r/min下離心5 min，分取上清液，經(jīng)96孔板過濾，待UPLC-HRMS/MS分析。

1.4.2 分析條件樣品使用ACQUITY UPLC I-Class液相色譜儀和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)分離，采用四極桿-靜電場軌道阱(Q-Orbitrap)高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。①強極性提取物色譜條件：柱溫：35 ℃，流速：250 μL/min，進樣體積：5 μL。流動相：A為水(含0.1%甲酸)，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～8 min，2% B；8～17 min，2%～60% B；17～26 min，60% B；26～28 min，60%～100% B；28～38 min，100% B。②弱極性提取物色譜條件：柱溫：45 ℃，流速：350 μL/min，進樣體積：5 μL。流動相：A為水(含0.1%甲酸+2 mmol/L乙酸銨)；B為乙腈-異丙醇(體積比1∶1,含0.1%甲酸+2 mmol/L乙酸銨)；梯度洗脫程序：0～8 min，35% B；8～9 min，35%～50% B；9～12 min，50%～70% B；12～19 min，70%～90% B；19～24 min，90%～100% B；24～38 min，100% B。

質(zhì)譜條件：采用全掃描(Full scan)與動態(tài)二級質(zhì)譜掃描(Data dependent MS/MS,ddMS2)結(jié)合的方式，使用Xcalibur.Ink軟件進行數(shù)據(jù)分析，獲取檢測物的質(zhì)譜信息。具體參數(shù)為：離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描模式：正/負離子模式；毛細管電壓：3 kV(+)/2.5 kV(-)；自動增益控制目標離子數(shù)(AGC Target)：3×106；最大離子注入時間：200 ms；離子傳輸管溫度：350 ℃；質(zhì)荷比范圍：m/z100～1 500 Da；全掃描分辨率：70 000；二級質(zhì)譜掃描分辨率：17 500；碰撞能量(NCE)：20 V/30 V/40 V；掃描時間：30 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS 前處理條件的優(yōu)化

為盡可能多地檢出低含量的揮發(fā)油類成分，考察了氮氣吹干濃縮對GC-MS分析中檢出峰個數(shù)以及信號強度的影響。結(jié)果顯示：富集前(圖1A)樣品的總離子流圖中檢出59個峰，色譜峰豐度最高為2.8×105；富集后(圖1B)檢出87個峰且主要集中在70～90 min內(nèi)(此時間段檢出成分主要為分子量和極性相對較大的成分)，豐度最高為1.8×106，且在70～90 min內(nèi)峰面積增大最為顯著；表明通過富集可整體提高化合物檢出個數(shù)及靈敏度。同時考察了不同時間段化合物的質(zhì)譜信號響應(yīng)與變化，發(fā)現(xiàn)10～40 min(多數(shù)為揮發(fā)性、小極性分子)化合物的相對強度在富集前后無明顯升高或降低(如圖1C、D)，可能在氮氣吹干過程中有部分損失。而保留時間為70～90 min的檢出物富集后的信號強度明顯提高(如圖1E、F)。由此可見，氮吹富集操作更有利于極性及分子量相對較大成分的富集。

2.2 GC-MS分析結(jié)果

經(jīng)GC-MS分析并結(jié)合NIST05 MS數(shù)據(jù)庫檢索和譜圖比對，選出匹配度最佳的化合物，以保證分析結(jié)果的準確性，并通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)以及相關(guān)文獻[15,19-20,22-23]推斷化合物可能來源。圖2為部分化合物的質(zhì)譜圖，分別為1,3-二叔丁基苯(圖2A)、乙酸松油酯(圖2B)、棕櫚酸(圖2C)、胡椒堿(圖2D)，這些化合物與NIST數(shù)據(jù)庫中標準譜圖的匹配程度均在90%以上。通過GC-MS分析和數(shù)據(jù)庫比對，檢出41個化合物(表1)，主要包括來源于豆蔻和香旱芹的含氧單萜及單萜烯類的桉油精、β-蒎烯、α-松油醇、α-蒎烯;來源于蓽茇的長鏈烷烴(如十二烷、瓊蠟烷)、長鏈烯酸(如月桂酸、棕櫚酸)以及生物堿類物質(zhì)(如胡椒堿)等。其中含氧單萜及單萜烯類化合物不僅質(zhì)譜響應(yīng)較低，其對應(yīng)峰面積也普遍低于其他種類化合物，除氮氣吹干的富集操作影響外，長時間熬煮也是影響其揮發(fā)油含量的因素之一。

表1 GC-MS分析結(jié)果Table 1 Analysis results of GC-MS

2.3 UPLC-HRMS/MS分析結(jié)果

針對該方劑的非揮發(fā)性成分，在前處理過程中分別獲得強極性提取物和弱極性提取物，經(jīng)UPLC-HRMS/MS方法獲取其高分辨質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息，并通過中藥綜合數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Integrated Database,TCMID)、人類代謝數(shù)據(jù)庫(Human Metabolome Database,HMDB)等檢索和比對分析。結(jié)果顯示，強極性組分中檢出19個化合物的可能結(jié)構(gòu)，主要包括氨基酸類(如苯丙氨酸)、肉堿類(如乙酰肉堿、異丁酰肉堿)、季銨鹽類(如膽堿、醋甲膽堿)、黃酮苷類(如木犀草素-3-葡萄糖-7-鼠李糖苷)、香豆素類(如羥基香豆素)等。表2列出質(zhì)譜響應(yīng)較高且初步鑒定的9種特異性化合物，其他化合物結(jié)構(gòu)尚需進一步鑒定與確認。由表中數(shù)據(jù)可見，大部分化合物是在中藥材中比較少見的肉堿、膽堿、亞油酸、馬尿酸等成分，分析認為可能主要來源于牦牛奶。

GC-MS檢測范圍為m/z50～550 Da，未覆蓋弱極性但分子量在550 Da以上的化學成分，因此采用UPLC-HRMS/MS技術(shù)對弱極性提取物進行檢測(掃描范圍m/z100～1 500)。結(jié)果顯示：經(jīng)UPLC-HRMS/MS檢測并初步鑒定出42個化合物(圖3A)，以脂質(zhì)為主，分析認為其主要來源于牦牛奶。在脂質(zhì)亞型方面，檢出9個三酰甘油類成分(Triacylglycerol,TG)，4個乳糖神經(jīng)酰胺類成分(Lactosylceramide,LacCer)，6個磷脂酰乙醇胺類成分(Phosphatidyl ethanolamine,PE)，4個磷脂酰絲氨酸類成分(Phosphatidylserine,PS)和3個磷脂酰膽堿類成分(Phosphatidylcholine,PC)。圖3B列出了質(zhì)譜響應(yīng)較高的前10個脂質(zhì)類成分，主要為TG和PE類成分。除此之外，在正離子模式下還檢出胡椒堿。在UPLC-MS/MS的強極性和弱極性組分中，均能檢出蔗糖與乳糖。

表2 經(jīng)UPLC-MS/MS檢出的9種強極性組代表性物質(zhì)鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of 9 representative compounds in the polar group via UPLC-MS/MS

圖3 分析獲得的主要脂質(zhì)亞型分類及個數(shù)(A)與質(zhì)譜響應(yīng)最高的前10種脂質(zhì)(B)
Fig.3 Subtypes and numbers of major detected lipids(A) and top 10 detected lipids which have the highest intensity(B) TG:triacylglycerol(三酰甘油類);LacCer:lactosylceramide(乳糖神經(jīng)酰胺類);PE:phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺類); PS:phosphatidylserine(磷脂酰絲氨酸類);PC:phosphatidylcholine(磷脂酰膽堿類)

綜上，通過UPLC-HRMS/MS檢出的大部分成分，包括肉堿及脂質(zhì)類成分可能主要來源于牦牛奶。此外，還檢測到主要來源于香旱芹的黃酮苷、香豆素類活性物質(zhì)，彌補了GC-MS分析的不足。

3 結(jié) 論

本研究通過GC-MS技術(shù)共檢出41種化合物，通過UPLC-HRMS/MS方法分別在強極性、弱極性提取物中檢出19、42種成分，其中蔗糖與乳糖在強極性和弱極性組分中均被檢出，胡椒堿在GC-MS和UPLC-HRMS/MS方法中均被檢出，因而從三味豆蔻湯中共發(fā)現(xiàn)及初步鑒定出99個化學成分。通過本分析方法初步掌握了該方劑的物質(zhì)基礎(chǔ)，并結(jié)合分析結(jié)果、TCMSP、TCMID、HMDB數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻分析等，推斷出三味豆蔻湯的代表性化合物及其來源分別為：來源于豆蔻和香旱芹的含氧單萜和單萜烯類成分(如桉油精、β-蒎烯、α-蒎烯)，來源于香旱芹的黃酮及黃酮苷類成分(如木犀草素-3-葡萄糖-7-鼠李糖苷)，來源于蓽茇的長鏈烯酸類成分(如棕櫚酸)和生物堿類成分(如胡椒堿)，以及來源于牦牛奶的甘油酯及磷脂類成分(如甘油三酯、磷脂酰乙醇胺、中性鞘糖脂)等。

本方法檢出的部分成分治療AD的藥效作用在相關(guān)文獻中已有報道或證實。如Gomaa等[8]提出揮發(fā)油中的含氧單萜和單萜烯類成分能夠降低乙酰膽堿酯酶的活性和谷氨酸受體的表達，可應(yīng)用于對AD的治療。Paul等[11]研究表明從豆蔻中獲得的含有桉油精的提取物與合成的桉油精相比，能夠在體外更好地抑制自由基的產(chǎn)生，可防止β42-淀粉樣蛋白(Amyloid beta-42,Aβ42)的積聚。此外，也有文獻提出香旱芹中的枯茗醛可抑制突觸蛋白纖維化過程[12,27]；木犀草素可能通過影響煙堿受體活性來減輕東莨菪堿或Aβ導致的記憶缺失等癥狀[28-29]；胡椒堿能夠通過降低脂質(zhì)過氧化程度和乙酰膽堿酯酶的活性起到改善認知的作用等[30]。因此，本研究結(jié)果可為三味豆蔻湯的配伍合理性提供了一定依據(jù)，為進一步開展藥效、藥物作用機制研究以及藥物質(zhì)量控制提供參考信息。