練計(jì)明 王海鵬 朱襲嘉 高雪原 李 皓 田小林 龐凌坤 李盛國 甘澤林

桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胃腸外科，廣西桂林市 541199

結(jié)直腸癌是我國最常見的消化道腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著我國人民的健康。近年來，我國結(jié)直腸癌已經(jīng)上升為我國男性第五位、女性第四位高發(fā)性惡性腫瘤，死亡率已位居我國惡性腫瘤第五位[1]。目前在臨床上對結(jié)直腸癌提出了以手術(shù)治療為主，化療、放療、免疫治療為輔的多學(xué)科綜合治療的理念，而輔助化療是結(jié)直腸癌綜合治療的重要組成部分。洛鉑為第三代鉑類化療藥物，具有水溶性好、抗瘤譜廣、抗瘤活性強(qiáng)及不良反應(yīng)少等諸多特點(diǎn)[2]，具有明顯的腹腔灌注化療藥代動力學(xué)優(yōu)勢[3]。研究發(fā)現(xiàn)其療效與洛鉑作用部位、作用有效濃度及作用時(shí)間有關(guān),其不良反應(yīng)則與外周血藥濃度有關(guān)，主要副作用表現(xiàn)為血小板減少、白細(xì)胞減少、貧血[4]。常規(guī)靜脈輸注全身化療的毒、副作用明顯，而腹腔灌注化療，因藥物不經(jīng)過血液從而可以減少藥物毒、副作用[5]；而且腹腔灌注化療可以提高靶區(qū)域或靶器官的藥物濃度，以達(dá)到更好的消滅患者體內(nèi)癌細(xì)胞的效果。洛鉑腹腔灌注化療由于其獨(dú)特的給藥方法,可實(shí)現(xiàn)局部區(qū)域的腫瘤靶向治療,具有局部藥物濃度高、全身血藥濃度低、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[6]。

因此設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，探討洛鉑腹腔灌注化療對進(jìn)展期結(jié)直腸癌裸鼠動物模型的治療效果，從而為進(jìn)展期結(jié)直腸癌的臨床多途徑治療及預(yù)后等提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 結(jié)直腸癌細(xì)胞株lovo由上海中科院細(xì)胞庫提供。25只alb/c裸鼠、雄性，4～6周齡，體重15～20g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。注射用洛鉑購自海南長安國際制藥有限公司。5%葡萄糖溶液購自廣東圣戈生物科技有限公司。生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)購自撫州市醫(yī)寶城醫(yī)療器械有限公司。DMEM培養(yǎng)液購自廣州威佳科技有限公司。胎牛血清購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 進(jìn)展期結(jié)直腸癌裸鼠動物模型的制備 將結(jié)直腸癌細(xì)胞株lovo置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期結(jié)直腸癌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×107個/ml，取0.2ml接種于每只裸鼠腹腔內(nèi)。接種成功后于第5～7天內(nèi)觀察裸鼠腹腔內(nèi)成瘤情況，選取成瘤成功且符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的裸鼠20只；治療前裸鼠、精神、飲食、活動、排便等無異常。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 將成瘤成功且符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的20只裸鼠隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組,各10只，在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，每隔3d更換飼養(yǎng)籠及其飼料、飲用水等。以裸鼠成瘤成功為實(shí)驗(yàn)起點(diǎn)，對照組每隔7d(第1天、第8天、第15天，以此類推)利用1ml注射器從裸鼠腹腔注入0.4ml的0.9%氯化鈉溶液，注入前需碘伏消毒預(yù)防感染，成功注入藥物并拔出針頭后棉簽輕柔按壓注射點(diǎn)1min，最后按摩裸鼠腹腔使注入藥物在裸鼠腹腔均勻分布；實(shí)驗(yàn)組每隔7d以同樣的給藥方式注射0.4ml洛鉑溶液(洛鉑10mg/kg+5%GS)行腹腔灌注化療。

1.4 測量指標(biāo) 每天密切觀察裸鼠腹腔腫瘤的生長情況、裸鼠生活狀態(tài)并記錄兩組裸鼠存活情況，每隔4d稱量并記錄裸鼠重量，最后計(jì)算抑癌率；抑癌率=(m對照組-m實(shí)驗(yàn)組)/m對照組×100%(利用治療后兩組裸鼠腫瘤重量的數(shù)據(jù)計(jì)算抑癌率)；剝瘤稱重時(shí)為達(dá)到腫瘤精準(zhǔn)稱重，需觀察腫瘤有無轉(zhuǎn)移至其他器官和浸潤周圍組織。

2 結(jié)果

2.1 兩組裸鼠成瘤率及治療后各指標(biāo)比較 裸鼠接種成功后于第5～7天觀察裸鼠腹腔內(nèi)成瘤情況，腹腔內(nèi)均形成大小不等的腫瘤，接種點(diǎn)無紅腫破潰表現(xiàn)且實(shí)驗(yàn)裸鼠成瘤率100%。治療前兩組裸鼠重量、腹腔內(nèi)腫瘤大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后對照組腫瘤重量高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組抑癌率高于對照組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組裸鼠重量高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組治療前后實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比

2.2 兩組裸鼠存活情況比較 實(shí)驗(yàn)組平均生存時(shí)間為48.6d，高于對照組的34.3d(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組生存曲線

3 討論

腹腔種植轉(zhuǎn)移是治療結(jié)直腸癌失敗的一個重要原因[7]，7%～15%的患者在初始手術(shù)時(shí)便已發(fā)現(xiàn)存在腹腔種植轉(zhuǎn)移，另有4%～19%的患者在根治術(shù)后出現(xiàn)腹腔種植轉(zhuǎn)移[8]。由于洛鉑的藥代動力學(xué)特點(diǎn)及腹腔灌注化療的高選擇性靶向給藥方式，洛鉑腹腔灌注化療被認(rèn)為是預(yù)防結(jié)直腸癌術(shù)后腹腔種植轉(zhuǎn)移及治療結(jié)直腸癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的有效方式。蘇昊等[9]研究表明洛鉑術(shù)中腹腔灌洗化療并不增加術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，亦不影響腸道功能的正?；謴?fù)，同時(shí)也沒有明顯的化療藥物的毒副反應(yīng)，具有良好的安全性和可行性。

許多研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與腫瘤細(xì)胞的分化和細(xì)胞增殖過度有關(guān)，而且與細(xì)胞凋亡的減少有關(guān)。細(xì)胞凋亡可以通過多種凋亡相關(guān)蛋白來調(diào)控。最重要的一種凋亡相關(guān)蛋白是caspase家族，這是一種具有特定底物的高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族。在線粒體啟動的細(xì)胞凋亡途徑中，caspase的激活是由多聚體細(xì)胞色素C復(fù)合物的形成觸發(fā)的，該復(fù)合物在募集和激活 procaspase-9 中起著非常重要的作用。然后，活化的 caspase-9 會裂解并激活下游的 caspase，例如 caspase-3、-6 和-7。據(jù)報(bào)道，Caspase-8 在細(xì)胞色素 c 依賴性細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，而 caspase-8 激活與 Fas 受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，并可導(dǎo)致Bid(Bcl-2家族的促凋亡成員)的裂解和活化。截短的Bid從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，似乎起著拮抗抗凋亡Bcl-2的作用，從而引起細(xì)胞色素c從線粒體外移和下游caspase-9/3活化。有脫細(xì)胞和體外表達(dá)系統(tǒng)的證據(jù)表明，caspase-3可誘導(dǎo)上游啟動因子caspase-8的裂解和活化。有研究表明洛鉑在體外可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長，并呈濃度依賴性，可誘導(dǎo)LOVO細(xì)胞凋亡。這種凋亡可能發(fā)生在S期，且caspase-8和caspase-9的表達(dá)上調(diào)引起了caspase-3的表達(dá)上調(diào)是可能的機(jī)制之一[10]。

此外，近期研究發(fā)現(xiàn)洛鉑可通過細(xì)胞焦亡機(jī)制誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞死亡，洛鉑可誘導(dǎo)活性氧(ROS)升高和JNK磷酸化。ROS清除劑 NAC可完全逆轉(zhuǎn)洛鉑處理的HT-29和HCT116的焦亡及JNK磷酸化?；罨腏NK將Bax募集到線粒體，從而刺激細(xì)胞色素c釋放到胞質(zhì)中去，隨后是caspase-3/-9的裂解和焦亡的誘導(dǎo)。因此，洛鉑是通過 ROS/JNK信號通路和Bax-caspase-GSDME 途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞的焦亡[11]。

本實(shí)驗(yàn)成功進(jìn)行了洛鉑腹腔灌注化療對進(jìn)展期結(jié)直腸癌裸鼠動物模型的研究，分析了洛鉑腹腔灌注化療對裸鼠腹腔內(nèi)結(jié)直腸癌的抑制作用，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：對照組腫瘤重量高于實(shí)驗(yàn)組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(2.86±0.26)g、(1.49±0.15)g，P<0.05]、對照組和實(shí)驗(yàn)組的抑癌率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.0%、48.3%,P<0.05)，表明治療后實(shí)驗(yàn)組的裸鼠腹腔腫瘤生長受到一定程度上的抑制，而對照組腹腔腫瘤生長較快。治療后實(shí)驗(yàn)組裸鼠重量高于對照組[(14.35±0.21)g、(16.18±0.17)g，P<0.05]，可能與腫瘤大量消耗裸鼠營養(yǎng)有關(guān)。兩組的存活情況表明實(shí)驗(yàn)組裸鼠存活時(shí)間比對照組延長。

綜上所述，洛鉑腹腔灌注化療對裸鼠進(jìn)展期結(jié)直腸癌生長具有明顯抑制作用并延長成瘤裸鼠的存活時(shí)間。同時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)為進(jìn)展期結(jié)直腸癌的臨床多途徑治療及預(yù)后等提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。