李偉，李雙霞，孟元華，李鳳玉，張奇芳，黃勇，牛曉東，朱利利

(1.陸軍第八十一集團軍醫(yī)院 a.病理科，b.檢驗科，c.腫瘤科，d.麻醉科，河北 張家口 075000； 2.張家口市第一人民醫(yī)院超聲科，河北 張家口 075000； 3.解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學中心婦科，北京 100700)

乳腺惡性葉狀腫瘤是源自小葉內或導管周圍間質的惡性改變，發(fā)生率雖然低于乳腺癌，但卻是乳腺惡性間葉性腫瘤中最常見的腫瘤。目前，乳腺惡性葉狀腫瘤的具體病因尚不明確，有資料顯示其發(fā)病不僅與種族、年齡以及地域等因素有關，可能還與生育哺乳、內分泌變化及多基因變異等有關[1-2]。Piwil2(P-element-induced wimpy testis like 2)蛋白正常僅表達于胚胎干細胞和生殖干細胞，在各種腫瘤組織和腫瘤細胞系也可見Piwil2的表達，其已被認為是腫瘤干細胞的分子標志物[3]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展緊密相關。細胞增生離不開細胞周期的調控，而細胞周期調控的失衡或紊亂則會引起細胞的異常增生甚至瘤變。目前，細胞周期蛋白D1(CyclinD1蛋白)被認為是調控細胞周期的重要蛋白之一，其主要功能是調控細胞周期由G1期進入S期，促進細胞增殖[4]，而其持續(xù)異常表達常與細胞的異常增殖及腫瘤形成有關[5]。查閱資料未發(fā)現(xiàn)有關于Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白與乳腺惡性葉狀腫瘤相關的報道。鑒于此，本研究主要探討Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中的表達及其與臨床病理因素之間的關系，并分析兩種蛋白之間的相關性，為闡述乳腺惡性葉狀腫瘤發(fā)生機制提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集1990年1月至2015年2月在陸軍第八十一集團軍醫(yī)院病理科和解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學中心病理科存檔的60例女性乳腺惡性葉狀腫瘤患者的資料，納入標準：①均為手術標本，且病理診斷明確；②均為首次治療，未進行過放化療等；③均未發(fā)生淋巴結轉移。排除標準：①非首次手術患者(復發(fā))；②病理診斷不明確者。患者年齡32～76歲，平均(52±4)歲；腫瘤直徑7～15 cm，平均(9±1) cm；Ki-67≥25%者49例，<25%者11例；瘤細胞異型性顯著者48例，不顯著者12例；術后復發(fā)10例，無復發(fā)50例；核分裂象≥15個/10個高倍鏡視野者29例，<15個/10個高倍鏡視野者31例；所有患者均未發(fā)生淋巴結轉移，均為首次接受根治性手術治療。同期選取60例正常乳腺組織為對照組，患者年齡25～38歲，平均(30±2)歲。兩組研究對象年齡等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經陸軍第八十一集團軍醫(yī)院和解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學中心醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2主要試劑和方法 濃縮型鼠抗人單克隆抗體Piwil2購自武漢博士德生物技術有限公司，按1∶200稀釋濃度滴加標本；即用型兔抗人單克隆抗體CyclinD1蛋白購自福州邁新生物技術有限公司；采用羅氏全自動免疫組化機(美國)及配套試劑進行染色操作。具體操作步驟如下：石蠟防脫片切片(4 μm)，組織漂烘儀(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司)65 ℃烤片1 h，雀巢全脂牛奶浸泡15 min，放入羅氏全自動免疫組化機，99 ℃修復1 h，再將預先配置好的Piwil2(1∶200)、CyclinD1 一抗滴入標本，30 min，加標記過的二抗，9 min，顯色 8 min，洗潔精洗片，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。采用朗珈圖像分析系統(tǒng)分析(Ver1.0)，奧林巴斯BX53顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)下觀察和分析免疫組織化學(En VisionTM)染色結果。

1.3結果判斷 Piwil2蛋白表達結果判斷標準[6]：每張切片隨機觀察10個高倍鏡視野，并依據(jù)以下標準評分。①胞膜和胞質染色呈棕黃色或棕褐色，按基本不著色、著色淡、著色適中、著色深分別為記為0、1、2、3分；②染色細胞百分率評分按著色細胞計數(shù)≤5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、≥51%為3分；③上述兩項得分相乘為其最后得分，即：0～1分為陰性，≥2分為陽性。CyclinD1蛋白表達結果判斷：胞核染色為棕黃色或褐色為陽性表達，陽性細胞≥10%為陽性，無染色細胞或陽性細胞<10%為陰性[7]。

1.4觀察指標 ①Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織及正常乳腺組織中的陽性表達情況；②Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白的陽性表達與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理因素的關系；③乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2蛋白的表達與CyclinD1蛋白表達的相關性。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPPS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織和正常乳腺組織中的表達情況 染色結果顯示，Piwil2蛋白著色于細胞質。在60例乳腺惡性葉狀腫瘤組織中有53例Piwil2蛋白呈陽性表達，陽性率為88.33%；在正常乳腺組織中不表達Piwil2蛋白，見圖1。CyclinD1蛋白著色于細胞核。在60例乳腺惡性葉狀腫瘤組織中46例CyclinD1蛋白陽性表達，陽性率為76.67%；在正常乳腺組織中不表達CyclinD1蛋白，見圖2。

2.2Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白表達與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理因素的關系 腫瘤直徑≥9 cm、Ki-67≥25%、瘤細胞異型顯著以及核分裂象≥15個/10個高倍鏡視野的患者Piwil2蛋白的表達水平高于腫瘤直徑<9 cm、Ki-67<25%、瘤細胞異型不顯著以及核分裂象<15個/10個高倍鏡視野者(P<0.05)，不同年齡、術后是否復發(fā)患者的Piwil2蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Ki-67≥25%、瘤細胞異型性顯著及核分裂象≥15個/10個高倍鏡視野者CyclinD1蛋白的表達水平高于Ki-67<25%、瘤細胞異型不顯著以及核分裂象<15個/10個高倍鏡視野者(P<0.05)，不同年齡、腫瘤直徑及術后是否復發(fā)患者的CyclinD1蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)學意義(P>0.05)。見表1。

2.3乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2蛋白的表達與CyclinD1蛋白的表達的相關性 經Spearman分析顯示，在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中，Piwil2蛋白的表達與CyclinD1蛋白的表達呈正相關(r= 0.413，P<0.01)。

3 討 論

乳腺惡性葉狀腫瘤是由良性的上皮成分和惡性的間質成分構成，其診斷標準包括細胞浸潤性生長，細胞密集增生、異型性，核分裂象≥10個/10個高倍鏡視野，可有壞死或出血[8]。目前，部分學者認為乳腺惡性葉狀腫瘤來自原始間葉細胞，但也有學者認為是成纖維細胞和肌成纖維細胞[9]。乳腺惡性葉狀腫瘤的組織病理學通常表現(xiàn)為纖維肉瘤改變，但也可有異源性分化，如脂肪肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤等，提示瘤細胞具有腫瘤干細胞多向分化的潛能。

1a:乳腺惡性葉狀腫瘤組織，陽性表達；1b：正常乳腺組織，陰性表達

2a:乳腺惡性葉狀腫瘤組織，陽性表達；2b：正常乳腺組織，陰性表達

表1 Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白陽性表達與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理因素的關系 [例(%)]

Piwil蛋白在多種細胞進程中起重要作用，如干細胞自我更新、RNA沉默、精子發(fā)生、翻譯調節(jié)、染色質重塑等。到目前為止，人類Piwil家族中4個成員已被識別，分別為Piwil1、Piwil2、Piwil3、Piwil4[10]，其中Piwil2僅表達于正常人體的睪丸和造血干細胞[11]。何朝輝等[6]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱尿路上皮癌組織中Piwil2蛋白的表達明顯高于正常組織，與臨床分期相關，并影響膀胱尿路上皮癌的生物學行為，且有可能成為高風險膀胱癌患者的預后指標[12]。也有研究顯示，Piwil2蛋白參與了乳腺癌、肝癌、前列腺癌等多種腫瘤的形成、發(fā)展[13-15]，其通過激活內源性RNA干擾，活化信號轉導及轉錄激活因子3/Bcl-XL和信號轉導及轉錄激活因子3/CyclinD1蛋白兩個重要的細胞信號通路，調控細胞周期，抑制細胞凋亡及誘導擴增[16]。

瘤細胞的分裂、增殖離不開細胞周期的調控，作為G1期細胞增殖信號的關鍵蛋白——CyclinD1蛋白，通過與周期素依賴蛋白激酶4/6形成復合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白，然后后者釋放轉錄因子E2Fs，從而縮短由G1期進入S期的時間，參與細胞周期的調節(jié)、促進細胞增殖[17]。如果CyclinD1蛋白過表達，細胞增殖異常則會導致細胞失控性增殖，進而引起腫瘤的發(fā)生[18]。在胃癌、食管鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌等[19-21]組織中均發(fā)現(xiàn)CyclinD1蛋白的表達高于相應的正常黏膜組織。吳曉明等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CyclinD1蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的陽性表達顯著高于正常組織，且表達與病理學分級有關，分化越低表達越高，但與TNM分期及淋巴結轉移無關。本研究結果顯示，Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中呈陽性表達，而在正常乳腺組織無表達，這表明Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織存在異常表達，可能參與了乳腺惡性葉狀腫瘤的形成。

Ki-67是一種較為肯定的細胞增殖相關核抗原，其功能與細胞有絲分裂、細胞增殖有關，其高表達提示細胞分裂和增殖能力強。權明吉等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67在胃癌組織中的陽性表達與Borrmann分型、組織分化、TNM分期及淋巴結轉移有關，其表達水平有助于判斷胃癌的惡性程度及侵襲和轉移能力。在非小細胞肺癌中，Ki-67表達越低，患者的中位生存期越高[23]。本研究結果顯示，乳腺惡性葉狀腫瘤中Ki-67≥25%、瘤細胞異型顯著以及核分裂象≥15個/10個高倍鏡視野的患者Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白的陽性表達率高，提示Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白陽性表達的瘤細胞可能具有更強的分裂、增殖能力，更有利于瘤細胞的生長及侵襲。乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2蛋白的表達與CyclinD1蛋白的表達呈正相關，提示Piwil2蛋白的表達可能通過激活某種信號通路，進而活化CyclinD1蛋白，共同實現(xiàn)了瘤細胞的增殖。

綜上所述，Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白的過表達參與了乳腺惡性葉狀腫瘤的形成，其表達水平可作為評判瘤細胞分裂、增殖的參考指標。有研究顯示，通過沉默Piwil2的表達后，宮頸癌細胞的增殖和集落形成能力均降低，細胞衰老數(shù)量也明顯增多[24]。沉默CyclinD1蛋白的表達后，肝癌細胞生長速度減慢，凋亡率上升[25]。推測Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白有可能成為乳腺惡性葉狀腫瘤靶向治療的潛在靶點，待今后需進一步深入研究。