過(guò)冬冬 孫芬 賀軒昂 羊東曄 黃來(lái)強(qiáng)

（1. 清華大學(xué)深圳國(guó)際研究生院，深圳 518055；2. 香港大學(xué)深圳醫(yī)院消化及肝臟科，深圳 518053；3. 清華大學(xué)化學(xué)系，北京 100084）

在過(guò)去的幾十年里人們對(duì)疾病的研究已逐步聚焦于分子水平的改變。自從1975年英國(guó)科學(xué)家Sanger發(fā)明第一代基因測(cè)序［1］以來(lái)，基因測(cè)序已發(fā)展成人們探索細(xì)胞遺傳物質(zhì)變化和疾病發(fā)展的有利工具。21世紀(jì)初期，人們宣布了人類基因組計(jì)劃［2］完成，這成為探索人類遺傳物質(zhì)的一個(gè)重要里程碑，而后人們發(fā)現(xiàn)器官水平的測(cè)序不能完全揭示機(jī)體變化的完整歷程和潛在原因。2009年，Tang等［3］首次在Nature Methods雜志上發(fā)表從單個(gè)細(xì)胞水平上的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文章，自此打開(kāi)了單細(xì)胞測(cè)序的大門。傳統(tǒng)的“塊樣”大面積測(cè)序的方法得到的結(jié)果可能是由于多個(gè)細(xì)胞“平均”后的宏觀結(jié)果，掩蓋了單個(gè)細(xì)胞之間存在的差異，致使人們?cè)谘芯肯嚓P(guān)疾病的時(shí)候往往聚焦在“面”上，而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)使得人們能夠看到具體的“點(diǎn)”。

肝臟作為人體中心免疫器官、血流豐富器官和再生能力超強(qiáng)的器官，具有復(fù)雜的細(xì)胞組成與分化程度不同的細(xì)胞階段。近年來(lái)研究表明，肝臟疾病的發(fā)生很大程度上是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞自身遺傳物質(zhì)、所處的微環(huán)境與外來(lái)影響因子（如病毒）共同作用的結(jié)果［4-5］。然而有關(guān)肝臟疾病的透徹認(rèn)識(shí)與精準(zhǔn)治療卻十分有限，原因之一在于傳統(tǒng)疾病分析方法往往不夠精準(zhǔn)且具有一定局限性。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)揭示肝臟疾病內(nèi)在發(fā)生機(jī)制有重要意義，它使得人們能夠從分子水平了解肝臟功能和肝臟有關(guān)疾病的生理與病理意義。早期診斷、精準(zhǔn)治療已成為肝臟疾病治療的終極目標(biāo)。本文簡(jiǎn)要介紹單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在肝臟疾病中的應(yīng)用發(fā)展，期望能為詮釋肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制、解析疾病發(fā)生的細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)提供參考。

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介

與傳統(tǒng)的測(cè)序方法不同，單細(xì)胞測(cè)序大體由3個(gè)步驟組成：?jiǎn)渭?xì)胞制備與捕獲、單細(xì)胞文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序及數(shù)據(jù)處理分析。

1.1 單細(xì)胞的制備與捕獲

高質(zhì)量的樣本是單細(xì)胞研究的關(guān)鍵所在。準(zhǔn)確的測(cè)序結(jié)果與細(xì)胞的狀態(tài)密不可分，有研究表明在不同的溫度下細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)水平不盡相同，有時(shí)相差高達(dá)上千倍［6］。待測(cè)組織先經(jīng)過(guò)機(jī)械剪切成小塊再經(jīng)酶消化使細(xì)胞相互分離。根據(jù)樣本選擇使用不同的酶配方，以肝組織為例，可選用終濃度為0.16 mg/mL膠原蛋白酶IV在37℃消化10 min；或用40 μg/mL的Liberase Blendzyme3消 化5-8 min。消化后的懸液要經(jīng)過(guò)濾網(wǎng)篩以除去較大的組織團(tuán)塊和細(xì)胞碎片，然后將細(xì)胞重懸在含有胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)基中，并及時(shí)進(jìn)行單細(xì)胞捕獲以防細(xì)胞沉降聚集或發(fā)生死亡［7］，因?yàn)榫奂募?xì)胞會(huì)使得單細(xì)胞捕獲過(guò)程中發(fā)生非單一細(xì)胞測(cè)序，死亡的細(xì)胞會(huì)由于自身組學(xué)發(fā)生改變?cè)斐蓽y(cè)序結(jié)果的偏差。

現(xiàn)在手工分選細(xì)胞方法已不再使用，較為常見(jiàn)的單細(xì)胞捕獲方法為熒光激活細(xì)胞分選（Fluorescentactivated cell sorting，F(xiàn)ACS）和微流控（Microfluidics）技術(shù)。FACS利用熒光標(biāo)記細(xì)胞表面標(biāo)志物將目的細(xì)胞分選至微量滴定板中，其效率高、捕獲準(zhǔn)且可去除可能對(duì)測(cè)序產(chǎn)生影響的受損細(xì)胞和死亡細(xì)胞［8］。但FACS由于快速的流體分選過(guò)程會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷，所以為保證所得的數(shù)據(jù)量需要擴(kuò)大起始分選量，然而這對(duì)某些稀少組織來(lái)說(shuō)并不容易實(shí)現(xiàn)。而微流控技術(shù)［9］是依賴集成的微流控電路捕獲含細(xì)胞的液滴至納米孔中，可以同時(shí)處理上千個(gè)細(xì)胞，大大減少了試劑和材料的使用，在控制了成本的同時(shí)也保證了效率。激光捕獲顯微切割法（Laser capture microdissection，LCM）［10］不需要事先制備細(xì)胞懸液而是利用激光對(duì)組織進(jìn)行切割，其特點(diǎn)是可以從空間上反映出每個(gè)細(xì)胞所處的位置但是對(duì)細(xì)胞損傷較大，一般在特定情況下才會(huì)選用。

1.2 單細(xì)胞不同組學(xué)測(cè)序

1.2.1 單細(xì)胞基因組測(cè)序 細(xì)胞內(nèi)極少的DNA含量不能達(dá)到直接測(cè)序需求，所以在進(jìn)行單細(xì)胞基因組測(cè)序之前需先進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（Whole genome amplification，WGA）。其中基于PCR擴(kuò)增技術(shù)的有：簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR（Degenerate oligonucleotide primed-polymerase chain reaction，DOP-PCR）與擴(kuò)增前引物延伸PCR（Primer extension preamplification-PCR，PEP-PCR）［11］。這兩種方法都是在Taq聚合酶的作用下通過(guò)引物結(jié)合、延伸然后退火的過(guò)程執(zhí)行擴(kuò)增行為。因?yàn)樵跀U(kuò)增時(shí)，即便是小的擴(kuò)增條件改變（如引物、Taq聚合酶濃度或退火溫度等）也會(huì)因指數(shù)級(jí)擴(kuò)增造成結(jié)果出現(xiàn)巨大差異，以致基因組的某些區(qū)域擴(kuò)增過(guò)度而另一些區(qū)域擴(kuò)增不足，產(chǎn)生較大的擴(kuò)增后偏倚［12］。因此基于PCR擴(kuò)增的測(cè)序技術(shù)有很大的基因組覆蓋差異，其范圍可達(dá)到10%-90%之廣［12-13］，如單核測(cè)序（Single-nucleus sequencing，SNS）基因組覆蓋廣度只有約10%，而多次退火循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）［12，14］利用特異引物實(shí)現(xiàn)僅擴(kuò)增原始基因組的效果，使得基因組覆蓋廣度達(dá)到90%以上，從而減少因?yàn)镈NA被循環(huán)擴(kuò)增而產(chǎn)生的擴(kuò)增偏倚。多重置換擴(kuò)增（Multiple displacement amplification，MDA）［15］利用高保真聚合酶在恒溫下進(jìn)行鏈置換合成，由于該聚合酶具有DNA鏈3'-5'校正作用，所以相比于上述PCR型擴(kuò)增技術(shù)大約可將保真度提高一千倍。現(xiàn)在單細(xì)胞基因組擴(kuò)增還可采用PicoPLEX［16］擴(kuò)增技術(shù)，它具有相比于MALBAC更短的細(xì)胞裂解時(shí)間，重復(fù)性更高，對(duì)細(xì)胞拷貝數(shù)變異（Copy number variations，CNV）更加敏感等優(yōu)勢(shì)，因此逐漸受到人們青睞。擴(kuò)增后的基因組在傳統(tǒng)二代測(cè)序的基礎(chǔ)上進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序信息能直觀地反映出細(xì)胞間基因表達(dá)差異。現(xiàn)有的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序過(guò)程都是利用含有poly-T的寡核苷酸來(lái)捕獲含有poly-A尾部的RNA分子，之后轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的cDNA分子。現(xiàn)為了方便后續(xù)建庫(kù)［17］，用十幾個(gè)堿基組成的特殊barcodes對(duì)同一個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行標(biāo)記，使得在之后的細(xì)胞池中可以準(zhǔn)確區(qū)分每一個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞信息，避免不同細(xì)胞信息混合在一起難以區(qū)分彼此的情況，如STRT-seq、CEL-seq便采用此種方法。特殊分子標(biāo)記（Unique Molecular Identifier，UMI）的引入可以在很大程度上糾正擴(kuò)增造成的結(jié)果偏倚和降低背景噪音，如CELseq2、Drop-seq則是應(yīng)用UMI特殊標(biāo)記的建庫(kù)方法［18］。得到cDNA后再通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)（In vitrotranscription，IVT）進(jìn)行擴(kuò)增以滿足后續(xù)測(cè)序要求。測(cè)序過(guò)程可根據(jù)目的和條件選擇不同的測(cè)序手段，一般來(lái)說(shuō)有兩種轉(zhuǎn)錄本的測(cè)序方法：全長(zhǎng)測(cè)序和3'或5'端測(cè)序。全長(zhǎng)測(cè)序能夠完整的表達(dá)轉(zhuǎn)錄組序列信息并能識(shí)別出基因變異以及轉(zhuǎn)錄部分的基因改變，如單核苷酸變異和融合轉(zhuǎn)錄等。對(duì)于3'或5'端50-100 bp信息已經(jīng)能滿足實(shí)驗(yàn)的要求，考慮到成本和全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄的實(shí)際價(jià)值，末端測(cè)序的方法則會(huì)大幅降低成本。

1.2.3 單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)測(cè)序 近年來(lái)，表觀遺傳學(xué)的研究已成為人們從分子水平上了解細(xì)胞行為的重要生物學(xué)分支。表觀修飾為人們理解由基因組和轉(zhuǎn)錄組控制的細(xì)胞行為之外的行為提供了途徑。DNA甲基化在表觀遺傳中起著重要作用，而哺乳動(dòng)物中5-胞嘧啶甲基化（5mC）則在DNA甲基化中占主導(dǎo)地位，因此利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)測(cè)定DNA甲基化程度十分必要。當(dāng)前亞硫酸氫鹽測(cè)序的原理是利用亞硫酸氫鈉處理DNA后將未修飾的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，但不影響5mC［19］?；谶€原替代亞硫酸氫鹽測(cè)序（Reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）和全基因組重亞硫酸鹽處理后的接頭和引物擴(kuò)增（Post-bisulfite adaptor tagging，PBAT）測(cè)序策略，建立了單細(xì)胞DNA甲基化組譜分析方法，避免了DNA丟失，確保下一代基因測(cè)序（Next generation sequencing，NGS）中覆蓋整個(gè)基因組。亞硫酸氫鹽處理后的DNA再經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，至滿足后續(xù)測(cè)序要求再測(cè)序。如已普及的ATAC-seq技術(shù)［20］，通過(guò)識(shí)別開(kāi)放染色質(zhì)并引入引物在染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序達(dá)到對(duì)單細(xì)胞表觀遺傳修飾進(jìn)行測(cè)序的目的，這是一種集細(xì)胞捕獲、文庫(kù)建立與測(cè)序一體的技術(shù)，大大簡(jiǎn)化了測(cè)序的過(guò)程。

1.2.4 單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序 對(duì)于某些單細(xì)胞樣本獲取并不容易，并且在制備單細(xì)胞懸液的過(guò)程中不可避免地造成細(xì)胞損失，這使得期望利用某一樣本進(jìn)行復(fù)雜的多組學(xué)分析變得異常困難。然而對(duì)多組學(xué)的平行測(cè)序是幫助我們?nèi)婢C合分析細(xì)胞行為的重要一步。現(xiàn)已有多個(gè)課題組開(kāi)發(fā)了兩組學(xué)甚至多組學(xué)同時(shí)測(cè)序的方法，如由Dey等［21］報(bào)道的DRseq技術(shù)，在裂解單細(xì)胞后同時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的基因組與轉(zhuǎn)錄組，然后將裂解物分成兩個(gè)部分，分別用于基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。該課題組利用DR-seq分別對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞系（E14）和乳腺癌細(xì)胞系（SK-BR-3）進(jìn)行了測(cè)序發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞到細(xì)胞之間基因的變化程度與拷貝數(shù)變異呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，表明拷貝數(shù)變異可能驅(qū)動(dòng)個(gè)體細(xì)胞的基因表達(dá)。但這個(gè)方法存在不能完全隔離開(kāi)DNA和RNA的問(wèn)題，無(wú)法避免相互干擾的風(fēng)險(xiǎn)。另一種基因組與轉(zhuǎn)錄組同時(shí)測(cè)序的G&T-seq技術(shù)由Macaulay等［16］報(bào)道，該課題組利用G&T-seq技術(shù)對(duì)已經(jīng)基因組測(cè)序的乳腺癌細(xì)胞和B淋巴母細(xì)胞系再次測(cè)序發(fā)現(xiàn)，B淋巴母細(xì)胞中存在11號(hào)染色體三體的細(xì)胞亞群。同時(shí)對(duì)分裂期的小鼠胚胎細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，明確了細(xì)胞分裂中染色體的錯(cuò)配與染色體表達(dá)量的關(guān)系，表明該測(cè)序方法可獲得的信息遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)之前的測(cè)序方法。隨著技術(shù)的不斷成熟，單細(xì)胞三組學(xué)測(cè)序（scTrio-seq）也逐漸為人們所用，它是將細(xì)胞裂解液的上清液進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，而對(duì)裂解物沉淀進(jìn)行基因組和DNA甲基化測(cè)序的方法，Hou等［22］利用其對(duì)25個(gè)來(lái)源于人肝細(xì)胞癌組織的單細(xì)胞進(jìn)行基因組、甲基化組和轉(zhuǎn)錄組同時(shí)測(cè)序，跟據(jù)CNVs，DNA甲基化和單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組確定了肝細(xì)胞癌的兩個(gè)細(xì)胞亞群，揭開(kāi)了每個(gè)細(xì)胞亞群之間存在的異質(zhì)性差異。另外，Bian等［23］在結(jié)直腸腫瘤病人原發(fā)瘤、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤的多部位取樣，運(yùn)用優(yōu)化的單細(xì)胞多組測(cè)序方法（scTrio-seq2），進(jìn)一步了解結(jié)直腸腫瘤的內(nèi)部異質(zhì)性。因此多組學(xué)同時(shí)測(cè)序的方法能為人們提供更加全面綜合的視野。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

單細(xì)胞測(cè)序后的原始數(shù)據(jù)需要經(jīng)過(guò)一系列步驟轉(zhuǎn)換為可讀的基因表達(dá)矩陣。在生成FASTQ讀數(shù)后要通過(guò)質(zhì)量控制步驟，篩選掉不符合要求的數(shù)據(jù)然后用barcodes進(jìn)行復(fù)讀，再由計(jì)算機(jī)對(duì)映射讀數(shù)進(jìn)行量化，以創(chuàng)建一個(gè)表達(dá)矩陣［24］。標(biāo)準(zhǔn)化的原始數(shù)據(jù)處理流程和計(jì)算機(jī)處理所用的數(shù)據(jù)處理包都可在公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)下載。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理［25］，以去除非生物技術(shù)效應(yīng)相關(guān)的高水平的噪音和差異性，包括在樣品制備過(guò)程中由于隨機(jī)RNA丟失、偏倚擴(kuò)增和文庫(kù)測(cè)序不完整而導(dǎo)致的非準(zhǔn)確情形。其他不穩(wěn)定性也可能來(lái)自于對(duì)加工單元（如板或陣列）、時(shí)間點(diǎn)、設(shè)備和其他來(lái)源的批量影響。因此，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化成為單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析的重要步驟。

單細(xì)胞的數(shù)據(jù)分析要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)要求設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。以scRNA-seq為例，主要是對(duì)測(cè)試樣本進(jìn)行異質(zhì)性分析，評(píng)估新的細(xì)胞類型或分析細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的基因變化。通過(guò)已知的特定基因?qū)?xì)胞進(jìn)行分群，而后常見(jiàn)的可視化分析是降維處理并把各個(gè)群的細(xì)胞投影到二維或者三維坐標(biāo)空間中去。普遍被人們采用的數(shù)據(jù)處理方法是主成分分析（Principal components analysis，PCA）和t-分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）算法。盡管種群標(biāo)記時(shí)允許監(jiān)督聚類，但在大多數(shù)情況下，無(wú)假設(shè)的非監(jiān)督聚類是首選的［26］。不同實(shí)驗(yàn)間的測(cè)試數(shù)據(jù)已經(jīng)被上傳至公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)，允許科研人員免費(fèi)訪問(wèn)。

2 單細(xì)胞測(cè)序在肝臟疾病中的研究

單細(xì)胞測(cè)序現(xiàn)已應(yīng)用于肝臟疾病研究中，并已取得一定成果?，F(xiàn)有研究主要集中在對(duì)肝組織中所含有的各類細(xì)胞進(jìn)行分群探索，期望揭示各細(xì)胞間的相互聯(lián)系。在肝病方面，肝癌和肝硬化則是人們探索的重點(diǎn)，通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)疾病的起因、發(fā)展和治療奠定理論基礎(chǔ)和提供治療依據(jù)。

2.1 單細(xì)胞測(cè)序描繪肝細(xì)胞類型圖譜

肝臟內(nèi)含有豐富細(xì)胞群、細(xì)胞亞群、并且各群細(xì)胞之間相互作用，共同構(gòu)建平衡的肝內(nèi)環(huán)境，細(xì)胞的異質(zhì)性和強(qiáng)大再生能力是其主要特點(diǎn)。在探索肝內(nèi)異質(zhì)性方面，Aizarani等［27］通過(guò)對(duì)9個(gè)人的近10000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序，構(gòu)建了一幅人類肝臟圖譜。該課題組基于mCEL-seq2技術(shù)對(duì)肝臟中所有細(xì)胞類型進(jìn)行確定，并發(fā)現(xiàn)一種具有祖細(xì)胞特征的EPCAM+TROP2int細(xì)胞群，它對(duì)肝臟內(nèi)平衡的維持，肝再生和疾病發(fā)生發(fā)展十分關(guān)鍵。這次測(cè)序結(jié)果幫助人們尋找到此前從未發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞亞群，并對(duì)找到正常肝臟和癌變肝臟之間的變化起到重要作用。這個(gè)肝臟全細(xì)胞群圖譜的描繪，有助于人們從宏觀逐步走向微觀了解肝臟。同時(shí)，新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞群也表明，以往分析組織病變的方法可能忽略了某些數(shù)量稀少的細(xì)胞群，因?yàn)檫@些細(xì)胞被其他數(shù)量龐大的細(xì)胞所掩蓋，而這些少數(shù)細(xì)胞很可能是決定組織正?；虿∽兊膱?zhí)牛耳者。肝臟作為人體免疫過(guò)程中的重要器官，也需要揭示其所包含的免疫細(xì)胞特征。MacParland等［28］首次利用單細(xì)胞測(cè)序確定了肝細(xì)胞內(nèi)獨(dú)特的巨噬細(xì)胞群并明確了其功能通路。而此前由于肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的分離難度和復(fù)雜的個(gè)體基因?qū)е氯藗儗?duì)其知之甚少。作者發(fā)現(xiàn)了兩類不同的CD68+巨噬細(xì)胞群，其中表達(dá)豐富的LYZ，CSTA，CD74的一群被定義為肝內(nèi)的一種炎性巨噬細(xì)胞，然而以前僅憑借細(xì)胞表面標(biāo)志物區(qū)分調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞或炎性巨噬細(xì)胞的方法并不能準(zhǔn)確區(qū)分同種標(biāo)志物下的不同亞群細(xì)胞。對(duì)肝內(nèi)免疫細(xì)胞群的精確劃分將有助于人們構(gòu)建肝內(nèi)免疫系統(tǒng)圖譜，幫助人們更為深刻的認(rèn)識(shí)正常與異常肝臟之間的差異。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)除了幫助人們識(shí)別不同的細(xì)胞群，還可以幫助了解各類細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中的變化，評(píng)估微環(huán)境與組織生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系。肝臟作為在發(fā)育成熟過(guò)程中生理功能變化的一個(gè)典型代表器官，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在發(fā)育中出現(xiàn)造血功能的改變，而其內(nèi)在的原因并不清楚。因此，Popescu等［29］通過(guò)對(duì)大約140000個(gè)肝臟和74000個(gè)皮膚、腎臟和卵黃囊細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，確定了人類血液和免疫細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中的全部功能。并從造血干細(xì)胞/多能祖細(xì)胞（Haematopoietic stem cells and multipotent progenitors，HSC/MPPs）中推斷出分化軌跡，以及評(píng)估了組織微環(huán)境對(duì)血液和免疫細(xì)胞發(fā)育的影響。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在妊娠期間胎兒肝臟的造血成分發(fā)生了變化，不再以紅細(xì)胞為主，而是伴有造血干細(xì)胞和多能干細(xì)胞平行分化。胎齡對(duì)HSC/MPPs分化潛能的調(diào)節(jié)提示這可能是在妊娠第一和第二階段調(diào)節(jié)胎兒肝臟造血功能輸出的一種額外的功能機(jī)制。而機(jī)體也是處于不斷變化過(guò)程中的，揭示各個(gè)器官以及血液細(xì)胞發(fā)育時(shí)的動(dòng)態(tài)信息對(duì)了解和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)人體動(dòng)態(tài)變化十分關(guān)鍵，同時(shí)也對(duì)解密肝臟造血機(jī)制和勾畫兒科肝臟、血液與免疫疾病的關(guān)系藍(lán)圖起重要作用。

2.2 單細(xì)胞測(cè)序在肝硬化中的研究

肝硬化是肝臟疾病中致死率較高的一類疾病，其主要特征是肝臟的大范圍纖維化。目前，人們對(duì)肝纖維化的治療并無(wú)十分有效的手段，對(duì)其背后的機(jī)理也缺乏深入的理解。然而近期一篇發(fā)表在Nature上的單細(xì)胞測(cè)序工作［30］幫助人們了解肝纖維化背后的細(xì)胞互作情況。Ramachandran等［30］通過(guò)對(duì)超過(guò)100000個(gè)人類細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq后發(fā)現(xiàn)一個(gè)與疤痕形成有關(guān)的TREM2+CD9+巨噬細(xì)胞亞群，這是一類在肝纖維化過(guò)程中顯著促進(jìn)纖維化的細(xì)胞亞群。同時(shí)定義了一種在纖維化微環(huán)境下才存在的ACKR1+和PLVAP+內(nèi)皮細(xì)胞，研究表明它能夠擴(kuò)大肝纖維化的面積并促進(jìn)白細(xì)胞遷移。另外，該文章還揭示了細(xì)胞背后的促纖維化信號(hào)通路，如TNFRSF12A，PDGFR和NOTCH信號(hào)。據(jù)此我們可以深入了解到參與肝纖維化細(xì)胞和背后的分子機(jī)理，為尋找合適的治療靶點(diǎn)提供參考。以上兩篇文獻(xiàn)表明，肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞與多種生理狀態(tài)相關(guān)，是一個(gè)不可忽略的細(xì)胞群體。Krenkel等［31］和Dobie等［32］兩個(gè)課題組的工作表明肝纖維化還與肝星狀細(xì)胞有關(guān)。前者單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，在肝損傷之后，肝星狀細(xì)胞向膠原分泌型肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化會(huì)促進(jìn)肝纖維化過(guò)程。數(shù)據(jù)顯示了肝星狀細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性，表明肝纖維化中存在功能相關(guān)的亞群。而Dobie課題組發(fā)現(xiàn)中心靜脈相關(guān)的肝星狀細(xì)胞（Central vein-associated HSCs，CaHSCs）作為膠原生成細(xì)胞是肝小葉中心纖維化的主要控制因素，并且鑒定出LPAR1是其治療靶點(diǎn)，為肝纖維化的治療提供了新方向。肝纖維化的研究已經(jīng)因單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)而加快了腳步，但是內(nèi)在機(jī)制和治療靶點(diǎn)的尋找仍需要不斷深入。

2.3 單細(xì)胞測(cè)序在肝癌中的研究

肝癌是全球第六大癌癥，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因，僅中國(guó)就占新發(fā)病例和死亡病例的一半以上。在中國(guó)所有的癌癥中，肝癌是存活率最低的腫瘤之一，5年相對(duì)生存率僅為10.1%［33］。為揭示免疫細(xì)胞在肝細(xì)胞癌中的動(dòng)態(tài)變化，Zhang等［34］用商業(yè)成熟的SMART-seq2和10× Genomics Chromium3技術(shù)對(duì)肝癌患者身體多個(gè)部位的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，通過(guò)描繪不同組織中細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化構(gòu)建出更加廣泛的細(xì)胞聯(lián)系。他們發(fā)現(xiàn)不同組織的免疫細(xì)胞組成差別巨大，來(lái)自于患者腹水的細(xì)胞有很強(qiáng)的組織特異性，并通過(guò)生物學(xué)分析得出存在巨噬細(xì)胞從腫瘤遷移到腹水的過(guò)程。除此之外，與患者不良預(yù)后有關(guān)的基因SLC40A1和GPNMB也在肝臟腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中顯著表達(dá)，基因敲除驗(yàn)證表明這兩個(gè)基因與腫瘤內(nèi)炎癥反應(yīng)息息相關(guān)。這是人們首次對(duì)人體不同組織之間細(xì)胞狀態(tài)關(guān)聯(lián)性探究。人體是一個(gè)有機(jī)的整體，割裂某一部分必不能觀察到全貌，因此這也為研究腫瘤發(fā)生時(shí)對(duì)整體產(chǎn)生的影響提供了范例。值得注意的是，肝臟作為一個(gè)功能復(fù)雜的器官，其組成成分的復(fù)雜造成了發(fā)生腫瘤病變時(shí)肝臟內(nèi)并非只有肝細(xì)胞癌的發(fā)生。Xue等［35］利用單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段分析鑒別了133例肝癌合并肝內(nèi)膽管癌（Combined hepatocellular and intrahepatic cholangiocarcinomac，HCC-ICC）患者的組織樣本發(fā)現(xiàn)，包括分離、合并和混合亞型。將cHCC-ICC與肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌進(jìn)行綜合比較發(fā)現(xiàn)，合并型和混合型cHCC-ICCs是不同的亞型，具有不同的臨床和分子特征，并從分析數(shù)據(jù)中得出可以Nestin可作為cHCC-ICCs生物標(biāo)志物的結(jié)論，為臨床上治療cHCC-ICCs提供了潛在靶點(diǎn)。近年來(lái)腫瘤干細(xì)胞愈發(fā)受到人們關(guān)注，作為腫瘤頑固且難以治愈的罪魁禍?zhǔn)?，人們期望?duì)腫瘤干細(xì)胞加以分析，以找到精確有效的腫瘤干細(xì)胞靶點(diǎn)。Zheng等［36］通過(guò)對(duì)腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析發(fā)現(xiàn)肝腫瘤干細(xì)胞在肝內(nèi)是獨(dú)特的存在，其異質(zhì)性高于普通肝癌細(xì)胞。研究表明不同標(biāo)志物的肝癌干細(xì)胞可能受到不同的腫瘤驅(qū)動(dòng)因子驅(qū)動(dòng)，同時(shí)單細(xì)胞水平的肝癌干細(xì)胞具有表型、功能和轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性。不同的腫瘤干細(xì)胞可能給腫瘤帶來(lái)不同的異質(zhì)性，這就解釋肝癌治療效果因個(gè)體而異的原因。這個(gè)工作為研究腫瘤細(xì)胞亞群和腫瘤發(fā)生發(fā)展提供了獨(dú)特的視角，提示對(duì)腫瘤的治療應(yīng)該由普遍化走向個(gè)體化，找到適合每一個(gè)人的精準(zhǔn)治療方法才是腫瘤治療的未來(lái)之路。

3 總結(jié)與展望

自從單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)面世以來(lái)，已逐漸揭開(kāi)多種疾病的神秘面紗，尤其在胚胎發(fā)育和腫瘤機(jī)制及治療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。目前在其腫瘤領(lǐng)域已有很多優(yōu)秀的工作，如人們利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)深入了解肺癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌微環(huán)境特征［37-38］、乳腺癌細(xì)胞微環(huán)境的免疫細(xì)胞表型［39］、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌［40］、腎癌細(xì)胞特征［41］及卵巢癌［42］等。此外，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在其他疾病上的應(yīng)用也體現(xiàn)出巨大的價(jià)值，如對(duì)腦細(xì)胞圖譜的繪制幫助人們理解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生原因以及奧爾默茲海默癥相關(guān)的疾病線索［43-44］，高分辨率小腸上皮細(xì)胞表達(dá)圖譜的繪制為腸道如何防止病原體入侵提供了線索［45］以及通過(guò)分析細(xì)胞組成和基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化剖析了糖尿病的發(fā)生與發(fā)展［46］。但是目前單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)還有待進(jìn)一步提升，如單細(xì)胞懸液的制備。由于某些樣本十分稀少且難以獲得，細(xì)胞懸液制備過(guò)程中操作復(fù)雜、條件苛刻，稍有不慎會(huì)造成樣本的細(xì)胞死亡率過(guò)高，或被污染致使在后期數(shù)據(jù)處理過(guò)程中達(dá)不到質(zhì)控要求，造成數(shù)據(jù)失真或損失。再者由于單個(gè)細(xì)胞的DNA含量極少，需要擴(kuò)增至可測(cè)序的數(shù)量，盡管人們?cè)诟鱾€(gè)階段都采取措施（如采用高保真酶、特殊引物、數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)化等），但全基因組擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增偏倚仍難以避免，且較為微弱的拷貝數(shù)變異仍然可能在背景噪音中掩蓋。這就不單單需要單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展，也需要輔助測(cè)序手段，如捕獲、擴(kuò)增技術(shù)的共同進(jìn)步。另外，現(xiàn)有的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是針對(duì)含有poly-A尾的mRNA，對(duì)于其他可能有重要功能卻沒(méi)有該特點(diǎn)的microRNA，lncRNA等尚未建立完善的測(cè)序手段，這可能是單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)未來(lái)需要克服的困難之一。

現(xiàn)有文獻(xiàn)表明肝臟是個(gè)龐雜的細(xì)胞群體，多種肝疾病（如肝硬化、肝癌等）發(fā)生發(fā)展也是細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與微環(huán)境共同作用的結(jié)果。雖然已有相關(guān)工作［28，34］表明肝臟中的免疫細(xì)胞之間聯(lián)系和功能復(fù)雜，但更有意義的是進(jìn)一步描繪其在疾病發(fā)展全過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化。利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)肝臟中的免疫細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)的分群也能幫人們進(jìn)一步了解肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制。當(dāng)下成熟的單細(xì)胞測(cè)序在數(shù)據(jù)處理上多用t-SNE降維方法將細(xì)胞群投影到二維空間中，但實(shí)際上這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的某個(gè)方向上的空間信息的丟失，因此將細(xì)胞一一映射到三維空間是單細(xì)胞測(cè)序未來(lái)需要完善的。保存完整的空間信息對(duì)分析很多器官細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化至關(guān)重要，近期Yu等［47］通過(guò)分析來(lái)自13位中國(guó)人的神經(jīng)膠質(zhì)瘤表達(dá)圖譜，生成了膠質(zhì)瘤的時(shí)空景觀，揭示了膠質(zhì)瘤不同子區(qū)域之間的侵襲模式，這是單細(xì)胞測(cè)序在腫瘤空間信息方面的又一次探索，雖然已有部分科研人員對(duì)肝臟細(xì)胞的空間信息作出了初步嘗試［48-49］，但仍然不夠深入，也許對(duì)肝內(nèi)多種細(xì)胞群的空間解析會(huì)帶來(lái)更加有趣的結(jié)果。