（上海健康醫(yī)學(xué)院，上海 201318）

重金屬難于生物降解，且容易在食物鏈和環(huán)境中富集，近些年隨著環(huán)境污染的加劇，逐漸成為危害極大的食品安全問(wèn)題[1]。食品被鎘污染后能對(duì)健康產(chǎn)生慢性或急性健康危害：骨折、腎功能紊亂、高血壓，甚至癌癥；砷可以與生物活性蛋白的硫醇基團(tuán)鍵合，對(duì)動(dòng)物的心肌、呼吸、生殖和免疫系統(tǒng)均有損傷[2-3]。火焰原子吸收法（flame atomic absorbption spectrometry，F(xiàn)AAS）、石墨爐原子吸收法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-AES）和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-OES）等均可用來(lái)檢測(cè)環(huán)境及食品中的重金屬，但幾乎所有的檢測(cè)手段都需要先將樣品處理為可溶液體才能做進(jìn)一步的檢測(cè)。前處理過(guò)程要花費(fèi)分析過(guò)程60%以上的時(shí)間[4]，目的是移除可能與重金屬絡(luò)合的有機(jī)物質(zhì)，釋放待測(cè)組分進(jìn)入消解液，消除基體干擾，濃縮待測(cè)組分，使處理后樣品能滿足分析方法要求[5]。選擇高效、準(zhǔn)確的樣品預(yù)處理方法是測(cè)定重金屬元素含量的關(guān)鍵步驟，直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可再現(xiàn)性。

目前常見(jiàn)的預(yù)處理方式有溶解法、熔融法、燒結(jié)法、干灰化法、濕法消解、微波消解、高壓密閉消解等[5]，主要是利用物理和化學(xué)處理的方式分解樣品，提取目標(biāo)物質(zhì)，達(dá)到檢測(cè)所需效果。消解方法的改進(jìn)主要集中在便利熱源和環(huán)保試劑的選擇上，尚未見(jiàn)報(bào)道低成本且高效的有效預(yù)處理方法。

在諸多研究物質(zhì)提取的報(bào)道中，酶法預(yù)處理作為一種樣品預(yù)處理方法，一直被認(rèn)為是一種溫和、方便、高效和環(huán)保的樣品處理方式[6]。與一般的樣品預(yù)處理方式相比，酶處理因?yàn)椴僮黛`活，使用有毒有害溶劑少，能量和資金上的投入低，是一種相比較而言更為安全、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的方法，被越來(lái)越多的應(yīng)用于樣品處理中[7-8]。本文對(duì)食品中鎘、砷的存在形態(tài)及酶處理工藝進(jìn)行了初步分析，并探討了酶法預(yù)處理在重金屬檢測(cè)中應(yīng)用的可能性。

1 鎘、砷在食品中的存在形態(tài)分析

鎘在谷物中主要與蛋白質(zhì)結(jié)合。比如稻米中的鎘主要與蛋白質(zhì)相結(jié)合，尤其是谷蛋白對(duì)米中鎘的結(jié)合起重要作用；香菇對(duì)鎘有較強(qiáng)的富集能力，研究證實(shí)其結(jié)合物的分子量為3萬(wàn)以上和3 000以下，兩種組分的比例為2∶1，其中低分子組分的紫外分析及茚三酮呈陽(yáng)性反應(yīng)的結(jié)果證實(shí)為肽；還有研究證明了大豆中的鎘是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形態(tài)存在，約占大豆總鎘的30%[9]。也有研究表明玉米中無(wú)機(jī)離子態(tài)鎘含量高于有機(jī)態(tài)鎘[10]。

以鎘在植物中可溶性來(lái)說(shuō)，植物根系中的鎘主要以乙醇提取態(tài)存在，葉片中鎘主要以去離子水提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)存在。鎘在甜高粱中其化學(xué)形態(tài)主要以醋酸提取態(tài)及鹽酸提取態(tài)為主[11]。鎘在玉米中主要以酸溶態(tài)鎘為最多[10]。此外，在一項(xiàng)以露天盆栽對(duì)試驗(yàn)對(duì)象的研究中發(fā)現(xiàn)，與乙醇提取態(tài)、水提取態(tài)、醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)相比較，鎘在蔬菜中主要以氯化鈉提取態(tài)的形式存在[12]。另有研究表明，海豚肝臟中，鎘以可溶態(tài)和不溶態(tài)形式存在，可溶態(tài)鎘占鎘總量的45﹪左右；可溶態(tài)鎘中沒(méi)有游離的鎘，全部都與蛋白質(zhì)相結(jié)合[13]。

在生物機(jī)體中，砷多以復(fù)雜的有機(jī)形態(tài)存在，如甲基砷酸（monomethylarsine acid，MMA）、二甲基砷酸（dimethylarsinic acid，DMA）、砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）、砷膽堿（arsenocholine，AsD）及砷糖[14]。大量研究表明，海產(chǎn)品中的砷主要是毒性較小的有機(jī)砷，且基本上是以砷甜菜堿和砷膽堿形式存在，另外還存在更復(fù)雜的砷化合物包括砷糖、砷脂類化合物等[15]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)小麥中存在的砷主要與相對(duì)分子質(zhì)量為54500和5500蛋白質(zhì)相結(jié)合[16]，此外，面粉、大米等農(nóng)產(chǎn)品中存在著極少量的亞砷酸[arsenious acid，As（Ⅲ）]、砷酸[arsenenic acid，As（V）]、二甲基砷酸（DMA）[14]。

2 酶法預(yù)處理在鎘、砷檢測(cè)中的應(yīng)用探討

酶處理是把生物大分子消化成為小分子，并利用溶劑將目標(biāo)物質(zhì)提取出來(lái)的過(guò)程。利用酶法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，從酶解液中提取目標(biāo)物質(zhì)以滿足重金屬檢測(cè)需求有著一定的理論及實(shí)際基礎(chǔ)。

2.1 酶處理對(duì)樣品中目標(biāo)物質(zhì)提取的促進(jìn)作用

研究酶處理對(duì)豆蔻出油率的影響，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)酶處理的出油率為6.73%，經(jīng)果膠酶、纖維素酶、戊聚糖復(fù)合酶、蛋白酶處理后，出油率為7.23%～7.83%，在95%置信區(qū)間上有顯著差異性。其中戊聚糖復(fù)合酶酶解效率最高[17]。使用纖維素酶對(duì)銀杏葉進(jìn)行預(yù)處理后，類黃酮的提取率與未經(jīng)酶處理的提取率相比較，提高了120%[7]。使用果膠酶和纖維素酶從番茄加工廢料（番茄皮/籽）中提取類胡蘿卜素和番茄紅素的提取率相比非酶處理的提取率分別高6倍和10倍[18]。經(jīng)蛋白酶預(yù)處理的玉米蛋白粉，與非酶處理的玉米蛋白粉相比，不但使葉黃素的提取量由非酶處理的165.3 μg/g提高到340.5 μg/g，而且浸提時(shí)間由5 h縮短為20 min[19]。使用胃蛋白酶處理乳酪，與傳統(tǒng)的氯仿提取方法相比較，黃曲霉毒素M1的提取率更高[20]。

使用掃描電鏡觀察經(jīng)果膠酶和纖維素酶處理過(guò)的豆蔻細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶處理的細(xì)胞壁化合物分解，而未經(jīng)酶處理的細(xì)胞壁僅有因物理處理而導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)上的破壞，兩者細(xì)胞壁存在明顯差異，證明了酶對(duì)細(xì)胞壁的裂解作用[17，21]。同樣用掃描電鏡對(duì)酶處理后的杜仲細(xì)胞壁的表面和縱切面進(jìn)行了形態(tài)學(xué)上的研究，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)酶處理的細(xì)胞壁較厚且結(jié)構(gòu)完整，有著清晰的組織邊緣；而酶處理后的細(xì)胞和細(xì)胞壁裂解，表面組織起皺，架構(gòu)坍塌，柵欄組織和薄壁組織已無(wú)明顯界限[22]。一方面，在后續(xù)的提取過(guò)程中，細(xì)胞組織物理結(jié)構(gòu)上的變化會(huì)促進(jìn)溶劑進(jìn)入細(xì)胞，加速目標(biāo)物質(zhì)的溶出[22]。另一方面，有研究認(rèn)為目標(biāo)物質(zhì)的提取率不高，大部分情況下是由于提取時(shí)溶劑分子難以滲透進(jìn)入組織而造成的。因?yàn)槊柑幚砜闪呀饧?xì)胞壁成分，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)暴露出來(lái)，從而更易提取[18]。并有研究表明細(xì)胞壁的降解程度與目標(biāo)物質(zhì)提取率之間有著顯著的正相關(guān)關(guān)系[23]。

對(duì)植物性樣品而言，植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠等。為提高提取率，纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶經(jīng)常被用來(lái)裂解植物細(xì)胞壁組分，以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)成分的釋放[8，22]。且有研究發(fā)現(xiàn)，鎘主要富集在甜高粱及擬南芥等植物細(xì)胞的細(xì)胞壁上[11，24]。

對(duì)動(dòng)物性樣品而言，酶法預(yù)處理也可瓦解樣品組織，促進(jìn)目標(biāo)物質(zhì)溶出。利用胃蛋白酶處理魚肉組織3 h后，成功使得囊幼蟲脫離組織包裹，從酶解溶液中浮出[25]。

2.2 酶處理在鎘、砷檢測(cè)中的應(yīng)用

對(duì)樣品中鎘、砷存在形態(tài)的了解可幫助選擇適合的酶類和提取劑。研究發(fā)現(xiàn)小麥中相對(duì)分子質(zhì)量為54 500的蛋白質(zhì)與砷的結(jié)合體易被胃蛋白酶和胰蛋白酶分解[16]。使用堿性蛋白水解酶處理海豚肝臟，平均有45%的鎘溶出[13]。選取胰蛋白酶與堿性蛋白酶，對(duì)翡翠貽貝進(jìn)行酶法預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶處理后樣品中砷含量的檢測(cè)結(jié)果有所提升，提取率為98.21%與103.59%，而酶處理前的提取率為88.26%[14]。

另有報(bào)道稱，糙米中重金屬主要以蛋白、纖維、植酸結(jié)合態(tài)存在，在糙米發(fā)芽過(guò)程中，蛋白、纖維素、植酸在蛋白酶、纖維素酶、植酸酶作用下部分降解；并認(rèn)為結(jié)合態(tài)重金屬可能轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，從糙米內(nèi)部遷移而出[26]。使用酶法預(yù)處理從樣品中提取鎘、砷化合物以滿足檢測(cè)要求，需要選擇合適的酶處理工藝。

3 酶法預(yù)處理的工藝研究分析

分析現(xiàn)有的研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)[7，17-20，22，27-28]，樣品的酶法預(yù)處理工藝流程一般有3種，詳見(jiàn)圖1。酶解過(guò)程一般進(jìn)行磁力攪拌，或?qū)⒒旌弦褐糜诤銣負(fù)u床上進(jìn)行處理。

圖1 酶法預(yù)處理工藝流程Fig.1 Process flow sheet of enzyme pre-treatment

樣品的酶法預(yù)處理包含兩個(gè)重要步驟：水中或緩沖溶液中的酶反應(yīng)（酶解）和利用有機(jī)溶劑提取[22]。以下對(duì)這兩個(gè)重要步驟的影響因素進(jìn)行分析。

3.1 酶反應(yīng)過(guò)程的影響因素分析

3.1.1 樣品粒度

樣品粒度是影響酶功能和出油率的一個(gè)重要因素。從理論上來(lái)看，粉碎后細(xì)胞壁被破壞，酶與細(xì)胞組分之間的距離變短。一般來(lái)說(shuō)，樣品粒度越小，目標(biāo)物質(zhì)的浸出越好。將葡萄籽按粒度大?。╩m）進(jìn)行分組：＜0.50、0.50～0.60、0.60～0.71、0.71～1.0、1.0～1.4、1.4～2.0、大于2.0，發(fā)現(xiàn)粒度較小的樣品出油率較高。與未粉碎樣品相比較，粒度＜0.50 mm的出油率增加了130%[29]。使用酶法預(yù)處理姜黃根粉提取姜黃素時(shí)也發(fā)現(xiàn)，隨著粒度的減?。?.425 mm～0.180 mm），提取率由2.64%升高到3.84%[28]。

3.1.2 酶的種類

不同的酶降解不同的成分，植物中的酶處理見(jiàn)報(bào)道的酶包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白質(zhì)水解酶、淀粉酶和聚半乳糖醛縮酶[8]。就目前的研究而言，蛋白酶經(jīng)常被用來(lái)去除高蛋白樣品中的蛋白質(zhì)，以提取目標(biāo)物質(zhì)[6]。選擇合適的復(fù)合酶，由于酶之間的協(xié)同效應(yīng)，可以增高目標(biāo)物質(zhì)的提取率[8]。使用果膠酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶的4∶1∶1（體積比）復(fù)合酶被報(bào)道從脫殼油菜籽中得到了91.6%的乳化油出油率[30]。用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶的不同組合酶，從忽地笑中提取加蘭他敏，發(fā)現(xiàn)纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶有最高的提取率[27]。用細(xì)胞壁多糖酶（聚糖酶+果膠酶）與蛋白酶先后作用于菜籽，油脂提取率最高，達(dá)到90.99%[31]。

3.1.3 酶濃度

提取率一般隨著酶濃度的增加而升高[8]。纖維素酶可破壞植物細(xì)胞壁與細(xì)胞間質(zhì)，促使胞內(nèi)物質(zhì)快速擴(kuò)散溶出，提高目標(biāo)成分的提取率，但當(dāng)酶解反應(yīng)完全，繼續(xù)增加酶量，對(duì)提取率的影響不大。另一方面，在較低的酶濃度下，酶與底物尚可較充分地結(jié)合；隨著酶濃度的升高，底物濃度不能對(duì)酶達(dá)到飽和，導(dǎo)致酶的作用受到抑制，所以對(duì)一定的底物濃度均存在一個(gè)最佳酶用量，并非酶越多酶解效果就越好[32]。商業(yè)用酶的濃度一般被限制在1%左右，酶活力100 000 U/g以上。

3.1.4 pH值

不同的酶有著不同的最適pH值。pH值不僅影響酶活力，還會(huì)影響目標(biāo)物質(zhì)的分離。酶可同時(shí)溶解和水解蛋白質(zhì)，并且裂解多糖，從而促進(jìn)物質(zhì)浸出[8]。用堿性蛋白酶和纖維素酶的復(fù)合酶提取大豆油，pH值經(jīng)優(yōu)化后的出油（26.8%）高于在未經(jīng)調(diào)節(jié)的pH值下的出油率（20.63%）[33]。

3.1.5 溫度

溫度是酶處理過(guò)程中不可忽視的一個(gè)工藝參數(shù)。不同樣品及所用酶類均對(duì)溫度有不同的要求。在用酶輔助提取植物油時(shí)，除了出油率，在選擇最佳溫度時(shí)，還要考慮油和蛋白質(zhì)的質(zhì)量特性。高溫不僅導(dǎo)致酶活力的喪失，同時(shí)還會(huì)使油的顏色加深，使蛋白質(zhì)變性。然而，相對(duì)的低溫又會(huì)導(dǎo)致酶反應(yīng)速率下降，以及出油率的降低。酶法水解的最適溫度為45℃～55℃[8]。

3.1.6 液固比

低液固比有利于酶與底物之間的反應(yīng)但會(huì)增加反應(yīng)液的粘度，不利于目標(biāo)物質(zhì)的浸出[27]。還有研究認(rèn)為，粘稠懸浮液不利于酶的滲透，從而有效地與底物接觸[30]。高液固比降低了反應(yīng)液的粘度，加快物質(zhì)轉(zhuǎn)移過(guò)程和酶解速度，相同時(shí)間內(nèi)使更多的處于絡(luò)合狀態(tài)的目標(biāo)物質(zhì)被釋放出來(lái)，提取量也隨之增大。但當(dāng)液固比增大到一定程度時(shí)，再增加液固比對(duì)酶解影響不大，反而會(huì)增加生產(chǎn)成本，且會(huì)導(dǎo)致廢液的增多和增加之后的反乳化的難度[8，19，27，33]。因此，酶處理樣品時(shí)需選擇合適的液固比。

3.1.7 酶反應(yīng)時(shí)間

酶與底物需要一定的接觸時(shí)間。一般而言，在最初的1 h～3 h間，隨著酶處理時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率會(huì)急劇升高，但之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，提取率變化不大甚至反而下降[22，27，30]。比如：在 40 ℃、pH 值為 5.0 的情況下，用纖維素酶從杜仲葉中提取綠原酸，發(fā)現(xiàn)2 h～24 h之間，提取率幾乎沒(méi)有變化[22]；利用纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶從蒜中提取加蘭他敏發(fā)現(xiàn)，提取率在1.5 h達(dá)到最高，之后隨著提取時(shí)間的嚴(yán)懲，提取率反而下降[27]；用堿性蛋白酶從油菜籽中提取脂肪和蛋白水解物發(fā)現(xiàn)最佳提取時(shí)間為2.5 h～3 h[30]。也有試驗(yàn)表明，若增加酶處理時(shí)間（120 h），出油率可由原優(yōu)化時(shí)間（16 h）的13.7%增加至17.5%[29]。

3.2 鎘、砷化合物常用提取試劑分析

樣品中鎘、砷化合物的溶解性無(wú)意是影響提取率的決定性因素。低溶解度意味著低提取率和提取溶劑的大量使用[7]。

由于不同試劑有不同的滲透能力和溶解能力，所以選擇合適的提取試劑在提取時(shí)至關(guān)重要[18]。果蔬等農(nóng)作物中砷大多以無(wú)機(jī)形態(tài)存在，因此常采用酸作為提取劑。此外甲醇也常被用作有機(jī)砷化合物的提取劑。需要特別注意的是，檢測(cè)動(dòng)植物組織和海產(chǎn)品中砷時(shí)，分析步驟的第一步通常是用丙酮、乙醚或輕石油浸取以除去油脂。甲醇對(duì)于去脂的樣品的提取率要高于未去脂的樣品[14]。提取鎘的有機(jī)溶劑有水、乙醇、氯化鈉、醋酸、鹽酸[11-12，24]。

可通過(guò)化學(xué)基團(tuán)的修飾提高目標(biāo)物質(zhì)的在提取試劑中的溶解性。使用纖維素酶在裂解植物細(xì)胞壁的同時(shí)，以麥芽糖作為糖基供體，通過(guò)轉(zhuǎn)糖苷作用提高類黃酮在提取液中的溶解性，以提高提取率[7]。此外，超聲、離心、微波輔助（microwave assisted，MAE）、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）等提取技術(shù)也廣泛應(yīng)用于樣品前處理中[14]。

4 結(jié)語(yǔ)

根據(jù)儀器分析方法要求，以及空白值大小選擇合適的樣品預(yù)處理方法是確保重金屬痕量分析準(zhǔn)確性的重要保障。預(yù)處理技術(shù)的深入研究將對(duì)重金屬分析的發(fā)展起到積極的推動(dòng)作用。

本文總結(jié)了3種重金屬檢測(cè)前的酶法預(yù)處理樣品的工藝流程；并認(rèn)為鎘在食品中主要與蛋白質(zhì)結(jié)合，在葉菜類食品中主要以氯化鈉提取態(tài)形式存在，在玉米、高粱等作物中主要以酸提取態(tài)最多；砷在動(dòng)物性食品及谷物類中主要以有機(jī)態(tài)存在，一般用甲醇作為提取劑；蔬菜中砷以無(wú)機(jī)砷形態(tài)存在，以酸作為提取劑；酶法預(yù)處理的影響因素包括樣品粒度、酶的種類、酶濃度、pH值、溫度、液固比和酶處理時(shí)間。