高紫君，畢付提，蔣水星，劉博雅，史亞楠，王德培，3*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.山東日照金禾博源生化有限公司，山東 日照 276800；3.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

曲酸（kojic acid）的化學名稱為2-羥甲基-5-羥基-4-吡喃酮，是一種微生物好氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1]。曲酸具有抑制酪氨酸酶活性[2]、抑菌[3]、抗氧化[4]、螯合金屬離子[5]的性質(zhì)，是一種天然的弱酸性化合物，研究者普遍認為曲酸是一種安全無毒的添加劑[6]。曲酸現(xiàn)已廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、以及化學材料[7]等方面，曲酸全球需求量達到1 000 t左右，且我國為主要生產(chǎn)國[8]。目前曲酸的來源主要以微生物發(fā)酵為主，因此提高菌株發(fā)酵產(chǎn)曲酸能力成為研究重點。

提高曲酸發(fā)酵能力的研究集中在誘變篩選工作，并取得了不少成果。凌帥等[9]在紫外照射40 s、N+注入劑量為10×1014ions/（cm2·s）的復合誘變條件下篩選到米曲霉CICC-2336，篩選突變菌株最高產(chǎn)量可以達到24.12 g/L；謝光蓉[10]采用兩次紫外線、兩次60Co多重復合誘變米曲霉w-56，在紫外照射15 min～16 min、60Co誘變劑量500 Gy～600 Gy后最終獲得曲酸產(chǎn)量可以達到68 g/L的高產(chǎn)菌株；陳錫劍等[11]采用常壓室溫等離子體對米曲霉KA2308進行誘變，等離子體處理時間200 s后突變菌株最高產(chǎn)量可以達到47.28 g/L。

本研究以米曲霉3.042為出發(fā)菌株，以紫外和超聲波、微波復合多種物理誘變手段，探討復合誘變對米曲霉孢子的誘變效果，以上述方法復合誘變選育，篩選出產(chǎn)曲酸水平高的菌種，為米曲霉孢子誘變方法提高研究借鑒，并以此高產(chǎn)曲酸米曲霉為基礎，進一步提高其曲酸產(chǎn)量，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，為曲酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米曲霉（A.oryzae）3.042（CGMCC No.3.00951）菌株：中國普通微生物菌株保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[19]。

初篩培養(yǎng)基：葡萄糖10%、酵母提取物0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、瓊脂 2%、TritonX-100 7%、FeCl31%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精9%、胰蛋白胨0.4%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.14%。

1.2 儀器與設備

Mandela型多功能等離子體誘變系統(tǒng)：北京艾德豪克儀器生物有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；UV-3100PC型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；H1650-W臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；MQD-S3R振蕩培養(yǎng)箱：上海旻泉儀器有限公司；KM-23C型超聲波清洗機：廣州市科潔盟實驗儀器有限公司；ME204E型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米曲霉誘變孢子懸液的制備

將在斜面培養(yǎng)基上生長7 d的成熟孢子以無菌水洗下，經(jīng)小玻璃珠打散，分別以無菌去離子水，于30℃、180 r/min 下孵育 0.5、1、2、3、4、5 h，孢子吸水膨脹后，采用血球計數(shù)板計數(shù)，稀釋到濃度為107個/mL備用。

1.3.2 誘變方法

1.3.2.1 紫外誘變

取200 μL孵育后孢子懸液于誘變小皿中進行紫外照射，分別照射 1、2、3、4、5、7、9、11 min，未經(jīng)過紫外照射的孢子懸液作為對照，分別稀釋涂布于PDA培養(yǎng)基和初篩培養(yǎng)基平板。

1.3.2.2 超聲誘變

取200 μL孵育后孢子懸液于離心管中，在40 kHz的低頻率超聲下對孢子懸液進行處理。分別超聲1、2、3、4、5、6 min，未經(jīng)過超聲處理的孢子懸液作為對照。

1.3.2.3 超聲波-微波誘變

取200 μL孵育后孢子懸液于離心管中先進行超聲處理 4 min，取出后立即進行微波處理 4、5、6、7、8、10、12 min，未經(jīng)過任何處理的孢子懸液作為對照。微波處理每10 s取出進行冰浴降溫處理，避免熱效應。

1.3.3 突變株初篩方法

將紫外誘變及超聲波-微波誘變的孢子懸液適當稀釋后涂在初篩培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)3 d。（紫外誘變后的平板要注意避光培養(yǎng)）。

1.3.4 突變株搖瓶發(fā)酵方法

將初篩培養(yǎng)基上長出的紅色較深的單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d。裝液量為70/250 mL的三角瓶中接種培養(yǎng)7 d的待測試菌株，接種量為104個/mL，轉(zhuǎn)速250 r/min，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵6.5 d。

1.3.5 曲酸含量的測定方法

曲酸產(chǎn)量的測定采用硫酸鐵顯色法[20]。

1.3.5.1 標準曲線的繪制

制作標準曲線：稱取0.1 g的曲酸標準樣品溶于蒸餾水中，并將其定容至100 mL，得到1.0 mg/mL曲酸標準溶液。稱取7.40 g Fe2（SO4）3和7.37 mL 18.4 mol/L的濃硫酸溶于蒸餾水，并定容至1 000 mL，得到1%的Fe2（SO4）3-H2SO4顯色劑。分別吸取0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25 mL 共 9 個濃度梯度的曲酸標準溶液和1 mL顯色劑于比色管中，用蒸餾水定容至25 mL，反復搖勻使其充分反應，以水加顯色劑為空白對照組，在紫外可見分光光度計500 nm波長下測其吸光度值（OD值），以吸光度對曲酸濃度繪制標準曲線，OD500為縱坐標，曲酸含量（g/L）為橫坐標，繪制成曲酸標準曲線。

1.3.5.2 發(fā)酵液中曲酸含量的測定

離心除去發(fā)酵液中菌絲體，吸取50 μL無菌絲體發(fā)酵液于25 mL的比色管中，加入1 mL顯色劑，定容。在波長500 nm處測其吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩方法的建立

曲酸能與Fe3+發(fā)生絡合反應，因此有曲酸產(chǎn)生時，會與篩選培養(yǎng)基平板中FeCl3發(fā)生紅色反應，且曲酸產(chǎn)量越高，紅色越深，培養(yǎng)3 d的顯色反應如圖1所示。觀察平板變色情況，挑選出最先出現(xiàn)紅色與紅色較深的菌株保存于斜面培養(yǎng)基上。

圖1 培養(yǎng)3 d的顯色反應Fig.1 Color reaction in cultured for 3 days

2.2 曲酸的標準曲線

曲酸標準曲線如圖2所示。

圖2 曲酸的標準曲線Fig.2 Standard curve of kojic acid

線性方程為：y=7.081 5x+0.011 0，相關系數(shù)R2=0.999 1；其中 x為曲酸含量（g/L），y為 500 nm 吸光度值。

2.3 孢子孵育對誘變的影響

斜面培養(yǎng)基上生長7 d的成熟孢子用無菌去離子水洗下，考慮到物理誘變過程體系中無機離子的干擾，并減少離心操作等易染菌等因素，故只選擇在無菌去離子水中進行孢子孵育，沒有進行無菌生理鹽水和液體培養(yǎng)基的孵育試驗。將新鮮米曲霉孢子于無菌去離子水，30 ℃、180 r/min 下分別孵育 0.5、1、2、3、4、5 h，制片后在顯微鏡下觀察，將未經(jīng)過吸水膨脹的孢子在相同倍數(shù)的顯微鏡下觀察作對照。具體結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，在無菌去離子水中孵育4 h時孢子明顯吸水膨脹，在孵育5 h時，孢子開始出現(xiàn)芽管。

圖3 孵育不同時間孢子吸水膨脹狀況Fig.3 Spore water absorption expansion condition in different incubation time

分別將孵育1、2、3、4 h的孢子進行紫外誘變，通過對致死率測定發(fā)現(xiàn)，1、2、3 h孢子吸水膨脹不明顯，此時間孵育的米曲霉孢子經(jīng)紫外線照射4 min致死率僅為35%～50%，而孢子孵育4 h后經(jīng)紫外線照射后致死率達到80%。分析原因，孢子吸水膨脹開始萌發(fā)時，高度螺旋化的染色體開始解螺旋成為細絲狀染色質(zhì)，DNA開始復制，堿基暴露在外面。此時進行誘變，低能量劑量即可以打破堿基配對氫鍵，誘變效果更為顯著。5 h時孢子已開始出現(xiàn)芽管，因此選擇4 h作為孵育時間。

2.4 紫外線誘變對菌株致死率及正突變率的影響

吸取200 μL濃度為107個/mL孵育后孢子懸浮液置于誘變小皿中，在15 W紫外燈下距離30 cm，分別照射 1、2、3、4、5、7、9、11 min。將誘變后的孢子懸液進行適當稀釋，涂布在PDA培養(yǎng)基和初篩培養(yǎng)基平板，將未誘變的孢子懸液采用相同的操作做對照。在30℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3 d，根據(jù)PDA平板菌落數(shù)計算出致死率，根據(jù)初篩板顏色變化計算出正突變率，具體結(jié)果見圖4。

圖4 紫外誘變對菌株致死率和正突變率的影響Fig.4 Effects of ultraviolet mutagenesis on the lethality and positive mutation rate of the strain

由圖4可以看出，隨著紫外照射時間的增加，菌株的致死率逐漸上升，照射時間為11 min時，菌株的致死率達到96.7%。當紫外線誘變處理5 min時正突變率最高，為56.3%，此時致死率為80.5%。紫外誘變突變株曲酸產(chǎn)量見圖5。

圖5 紫外誘變突變株曲酸產(chǎn)量Fig.5 Yield of kojic acid from mutants induced by ultraviolet radiation

經(jīng)搖瓶復篩，獲得一株編號為UV-4的突變菌株，產(chǎn)酸量達26.54 g/L，比出發(fā)菌株3.042提高了129.8%。紫外照射5 min進行誘變處理，經(jīng)復篩后，獲得一株編號為UV15的突變菌株，產(chǎn)酸量最高達28.76 g/L，比出發(fā)菌株UV-7提高了8.36%。

兩輪紫外線照射誘變中第一輪的效果比較理想，誘變后產(chǎn)酸提高率較高。第二輪的誘變效果較低，產(chǎn)量提高的不明顯。原因可能是經(jīng)過第一輪誘變后，突變株對紫外線的敏感性降低，故應考慮采用其它誘變因子，以進一步提高誘變效應。

2.5 超聲對菌株致死率的影響

將誘變后的孢子懸浮液涂布在初篩培養(yǎng)基平板上，于30℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3 d，根據(jù)菌落數(shù)計數(shù)出致死率。

圖6 超聲對菌株致死率的影響Fig.6 The effect of ultrasound on the lethality of strain

由圖6可以看出，隨著超聲處理時間的增加，菌株的致死率逐漸上升，超聲時間為6 min時，菌株的致死率達到62.8%，超聲時間為4 min時，菌株的致死率為42%。本試驗選用40 kHz的低頻率超聲對孢子懸液進行處理，旨在加強細胞膜通透性，因此選擇致死率為40%左右的4 min作為超聲處理時間。

2.6 超聲微波誘變致死率及誘變篩選

以UV15作出發(fā)菌株對其孢子懸液進行超聲微波誘變，將誘變后的孢子懸浮液涂布在初篩培養(yǎng)基平板上，于30℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3 d，根據(jù)菌落數(shù)計數(shù)出致死率。

圖7 超聲微波復合誘變對菌株致死率的影響Fig.7 Effect of combined ultrasonic and microwave mutagenesis on the lethality of bacterial strain

由圖7可以得出，隨著微波輻射時間的增加，菌株的致死率逐漸上升，照射時間為13 min時，菌株的致死率達到96.8%。經(jīng)過搖瓶篩選，曲酸產(chǎn)量見圖8。

由圖8可知，編號M22的突變菌株，其產(chǎn)酸量為34.28g/L。與UV15相比產(chǎn)酸量提高19.2%，與菌株3.042相比提高197%。

2.7 突變株的遺傳穩(wěn)定性

為檢驗突變株的遺傳穩(wěn)定性，將M22菌株在斜面培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)10代，并將每兩代菌體分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)6.5 d，通過硫酸鐵顯色法測定曲酸產(chǎn)量。

由圖9可知，經(jīng)過傳代試驗后，M22的產(chǎn)量基本保持在30 g/L～33 g/L。因此證明本復合誘變是一種較有效的誘變方法，對提高菌種產(chǎn)曲酸有非常好的效果。

圖8 超聲微波復合誘變突變株曲酸產(chǎn)量Fig.8 Yield of kojic acid from ultrasonic-microwave mutagenesis

圖9 突變株的遺傳穩(wěn)定性試驗Fig.9 Genetic stability experiment of the mutant strains

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，孢子吸水膨脹對米曲霉3.042孢子誘變的影響較大，由顯微鏡觀察和紫外誘變結(jié)果可知，孢子孵育4 h時吸水膨脹明顯，與未孵育孢子相比，紫外照射4 min時致死率由35%提高到80%。因此米曲霉孢子在去離子水中孵育4 h最適宜誘變。

通過紫外誘變、超聲波微波復合誘變篩選曲酸高產(chǎn)菌株。從結(jié)果得出，紫外誘變5 min時正突變率最高，為56.3%，復篩后獲得菌株UV15，產(chǎn)量達28.76 g/L。在此基礎上進行超聲波微波復合誘變，復篩后獲得菌株M22，產(chǎn)量達34.28 g/L，與出發(fā)菌株3.042相比曲酸產(chǎn)量提高了197%，與UV15相比曲酸產(chǎn)量提高了19.2%。傳10代發(fā)現(xiàn)生長性能和產(chǎn)酸能力均穩(wěn)定。通過系列復合誘變能顯著提高出發(fā)菌株產(chǎn)曲酸能力，可以作為曲霉屬微生物誘變育種的參考方法。