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        超聲輔助低共熔溶劑提取甘草多糖的研究

        2021-01-28 02:47:18孫悅何蓮芝蘇卓文李志田劉婭
        食品研究與開發(fā) 2021年2期
        關(guān)鍵詞:氫鍵甘草溶劑

        孫悅,何蓮芝,蘇卓文,李志田,劉婭,2*

        (1.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆 石河子 832000;2.新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子832000)

        甘草為豆科、甘草屬多年生草本植物,全世界有13種甘草,主要分布于亞洲、美洲中部、北非等地。新疆是我國甘草的主要產(chǎn)地之一[1]。甘草作為藥食兩用資源,其中含有甘草多糖、甘草黃酮和甘草酸等多種生物活性成分[2],而多糖是人體內(nèi)的一種信息分子,廣泛存在于自然界和生物體中,具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用,還能降血脂,延緩衰老、抗疲勞[3-5],因此多糖的提取和性質(zhì)研究日益受到重視。

        傳統(tǒng)的多糖提取,以水為介質(zhì),存在費(fèi)時(shí)、生產(chǎn)能耗高、活性組分易損失、得率低等不足。而低共熔溶劑作為一種綠色、新型介質(zhì),由氫鍵受體和氫鍵供體按照一定比例混合構(gòu)成[6],二者通過氫鍵相互結(jié)合,能夠提供或接受外部電子或質(zhì)子形成氫鍵,使得它們可以溶解多種物質(zhì),包括多糖、蛋白質(zhì)、藥物活性物質(zhì)和鹽等,因此,可用于植物中極性或非極性組分的有效提取[7-8]。

        此外,低共熔溶劑不僅具有離子液體的良好性質(zhì),如熱穩(wěn)定性優(yōu)異,與水和有機(jī)溶劑混溶[9],對(duì)各種有機(jī)化合物具有優(yōu)異的溶解性和萃取性,而且原料易得,成本較低,制備簡(jiǎn)單,無污染[10]。

        國外已將低共熔溶劑成功應(yīng)用于多酚、多糖、異黃酮、花青素、白藜蘆醇、香草醛[11-16]等多種生物活性成分的提取,而國內(nèi)相關(guān)報(bào)道甚少。

        為了解低共熔溶劑提取多糖的規(guī)律,本研究以甘草為對(duì)象,以低共熔溶劑為提取劑,選取價(jià)廉易得的氯化膽堿為氫鍵受體,采用超聲輔助技術(shù)提取其中的多糖類化合物,優(yōu)化甘草多糖提取工藝,從而為甘草多糖的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù),并為后期多糖功能性研究奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        原料甘草(二級(jí)甘草):新疆和濟(jì)中藥飲片有限公司。

        氯化膽堿:上海源葉生物科技有限公司;丙三醇:天津市化學(xué)試劑三廠;異丙醇:天津市富宇精細(xì)化工有限公司;尿素、中性醋酸鉛:天津市永晟精細(xì)化工有限公司;草酸、葡萄糖:天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司;3,5-二硝基水楊酸:上海遠(yuǎn)帆試劑廠;氫氧化鈉:天津市福晨化學(xué)試劑廠;濃鹽酸:北京化工廠;酚酞:天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心;以上試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        BS 2000S天平(d=0.01 g):北京賽多利斯天平有限公司;78-1磁力加熱攪拌器:常州普天儀器制造有限公司;JP-1000B-2高速多功能粉碎機(jī):浙江永康市久品工貿(mào)有限公司;KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;B250智能數(shù)顯恒溫油水浴鍋:上海予卓?jī)x器有限公司;UVmini-1240紫外分光光度計(jì):上海元析儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 低共熔溶劑的制備

        將氯化膽堿與草酸(尿素、異丙醇、丙三醇)等按照一定的摩爾比混合置于錐形瓶中,在恒溫水浴鍋中,保持溫度60℃,攪拌至完全溶解后取出,冷卻至(20±2)℃后得到無色透明液體,裝入試劑瓶中,(20±2)℃下放置一周后仍為均勻透明的液體[17]。

        1.3.2 甘草多糖提取的工藝流程

        甘草→粉碎脫脂→加入低共熔溶劑攪拌→混勻靜置→超聲輔助提取→加入澄清劑→過濾→粗多糖[18-19]

        1.3.3 甘草多糖含量測(cè)定

        采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定多糖含量[20]。分別吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄溶液(100 μg/mL)置于干燥具塞的試管中,分別加蒸餾水至4.0 mL,加入2 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑,沸水浴中10 min,取出,流水冷卻后,510 nm處測(cè)定吸光值。以多糖濃度為橫坐標(biāo)x,測(cè)出的吸光度為縱坐標(biāo)y,繪制多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:y=0.014 4x-0.009 2(R2=0.991 4)。

        1.3.4 甘草多糖提取率的計(jì)算

        式中:C為回歸方程計(jì)算得到甘草多糖的濃度,mg/mL;V為定容的體積,mL;M為原材料的質(zhì)量,g。

        1.3.5 確定低共熔溶劑體系

        根據(jù)計(jì)算數(shù)值精確稱取一定量的氯化膽堿與丙三醇、異丙醇和尿素,按照摩爾比 1∶1、1 ∶2、1 ∶3、2 ∶1、3∶1混合,加入適量的水,進(jìn)行加熱攪拌至完全溶解,直至形成均勻透明的無色液體[22],低共熔溶劑的種類及摩爾比見表1。

        表1 低共熔溶劑的種類及摩爾比Table 1 Types and molar ratios of eutectic solvents

        1.3.6 甘草多糖提取單因素試驗(yàn)

        在提取溫度分別為 20、30、40、50、60 ℃,料液比分別為 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60(g/mL),超聲時(shí)間分別為 15、20、25、30、35 min,超聲功率分別為 100、150、200、250、300 W的條件下,按照1.3.2的方法,進(jìn)行提取溫度、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率4個(gè)因素的單因素試驗(yàn)[23-25],考察各因素對(duì)甘草多糖提取率的影響。

        1.3.7 甘草多糖超聲提取的響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方法,對(duì)超聲輔助低共熔溶劑提取甘草多糖的影響因素進(jìn)行研究和條件優(yōu)化,做出響應(yīng)面圖,建模并分析各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        采用origin軟件和Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 低共熔溶劑體系對(duì)甘草多糖提取率的影響

        低共熔溶劑是由氫鍵供體和氫鍵受體按照一定摩爾比混合而構(gòu)成,其中氫鍵受體、氫鍵供體種類繁多,二者摩爾比不同、體系含水量不同都會(huì)影響多糖提取率。本研究以氯化膽堿為氫鍵受體,考察常見的幾種氫鍵供體對(duì)甘草多糖提取率的影響見如圖1~圖3。

        圖1 氯化膽堿-丙三醇體系中不同摩爾比對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of different mole ratio in choline chloride-glycerol system on polysaccharide extraction rate

        圖2 氯化膽堿-異丙醇體系中不同摩爾比對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of different mole ratio in choline chloride-isopropanol system on polysaccharide extraction rate

        圖3 氯化膽堿-尿素體系中不同摩爾比對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of different mole ratio in choline chloride-urea system on polysaccharide extraction rate

        從圖1~圖3可知,氫鍵供體為氯化膽堿,氫鍵受體為異丙醇,二者摩爾比為1∶3,含水量為40%時(shí)的低共熔溶劑體系的多糖提取率最高。這可能是因?yàn)槎嗵菫闃O性大分子,低共熔溶劑極性也相對(duì)較大,根據(jù)相似相溶原理,可溶解的多糖相應(yīng)較多;另一方面可能是因?yàn)榇碱惔罅苛u基的存在,也能加強(qiáng)與多糖的相互作用力,提高多糖提取率,然而,低共熔溶劑黏度會(huì)影響多糖的提取率,加入適量水使得溶劑體系黏度降低,溶液流動(dòng)性增大,可高效快速溶解更多的多糖,提高多糖的提取率[26]。因此選用氫鍵供體為氯化膽堿,氫鍵受體為異丙醇,二者摩爾比為1∶3,含水量為40%時(shí)的低共熔溶劑體系最適宜。

        2.2 甘草多糖提取單因素試驗(yàn)

        選取料液比、提取溫度、超聲時(shí)間以及超聲功率4個(gè)因素做單因素試驗(yàn),考察各因素對(duì)甘草多糖提取效果的影響。

        2.2.1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

        提取溫度對(duì)多糖提取率的影響見圖4。

        圖4 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on polysaccharide extraction rate

        從圖4可知,當(dāng)提取溫度較低時(shí),甘草多糖的提取率隨著溫度的升高而增大;40℃時(shí)多糖提取率最高;之后隨著溫度的升高,多糖提取率降低。多糖提取率隨著溫度升高先增加后減少可能是因?yàn)殡S著溫度的升高,整個(gè)反應(yīng)體系的反應(yīng)速度加快,利于多糖物質(zhì)的溶出,溫度進(jìn)一步升高,使得多糖在低共熔溶劑中的穩(wěn)定性不高,發(fā)生降解而減少。因此提取溫度選擇40℃。

        2.2.2 料液比對(duì)多糖提取率的影響

        料液比對(duì)多糖提取率的影響見圖5。

        從圖5可知,當(dāng)料液比為1∶50(g/mL)時(shí),多糖提取率最大,之后趨于平穩(wěn)??赡苁且?yàn)榈凸踩廴軇┍旧頌轲こ硪后w,在一定范圍內(nèi),隨著料液比降低,溶劑與甘草的接觸面積增多,超聲還起到一定的攪拌作用,多糖的溶出增多,使得多糖提取率增加;而當(dāng)溶劑過高時(shí),黏稠的低共熔溶劑阻礙了超聲波的作用,使超聲波不能充分作用于甘草,亦或是提取出的多糖受到過多溶劑的稀釋,而使提取率降低。因而,從提取率及成本等方面考慮,料液比以1∶50(g/mL)為宜。

        圖5 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate

        2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

        超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見圖6。

        圖6 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on polysaccharide extraction rate

        從圖6可以看出,提取率隨著超聲時(shí)間的增加先緩慢升高后下降,30 min時(shí)多糖提取率達(dá)到最高。這可能是因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間范圍內(nèi),隨著超聲時(shí)間的增加,超聲波能充分作用于甘草粉末,破壞其細(xì)胞壁,使多糖溶出;但是隨著超聲時(shí)間的進(jìn)一步增加,超聲波使得部分多糖水解,從而使提取率降低。因此,超聲時(shí)間以30 min為宜。

        2.2.4 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響

        超聲功率對(duì)多糖提取率的影響見圖7。

        由圖7可知,多糖的提取率隨著超聲功率的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),功率250 W時(shí)的多糖提取率最高。這可能是因?yàn)殡S著功率增加,超聲波的強(qiáng)度增加,使得甘草與溶劑充分反應(yīng),從而使多糖溶出增加,而功率過高時(shí),可能對(duì)多糖類化合物具有破壞作用,使提取率下降。因此,超聲功率選擇250 W為宜。

        圖7 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharides

        2.3 甘草多糖提取的響應(yīng)面試驗(yàn)

        2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

        在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取料液比、提取溫度、超聲時(shí)間、超聲功率進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。以Box-Benhnken設(shè)計(jì)的組合變量為自變量,以多糖提取率為響應(yīng)值,進(jìn)行多糖提取條件的優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表2,響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表3。

        表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平表Table 2 Box-Behnken experimental factors and level table

        表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface experimental results

        續(xù)表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Response surface experimental results

        利用Design-Expert8.06軟件,對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸模型擬合,獲得甘草多糖提取率(Y)對(duì)應(yīng)編碼自變量的二次多項(xiàng)式回歸方程:Y=8.23-1.04A-0.15B-0.9C+0.14D+0.27AB-1.16AC-0.14AD-0.16BC-0.083BD-0.44CD-2.01A2-2.72B2-3.57C2-1.99D2

        響應(yīng)面二次模型方差分析見表4。

        表4 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface quadratic model

        由表 4可知:一次項(xiàng) A、C 影響極顯著(P<0.01);二次項(xiàng) AC 影響極顯著(P<0.01);A2、B2、C2、D2影響極顯著(P<0.01);失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)。模型 R2=0.982 0,R2Adj=0.963 9,說明該方程與實(shí)際情況擬合良好,可以用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。根據(jù)F值可知各因素對(duì)多糖提取率影響程度大小順序?yàn)椋撼暪β剩咎崛囟龋境晻r(shí)間>料液比。

        2.3.2 各個(gè)因素相互作用的響應(yīng)曲面圖

        響應(yīng)曲面圖可直觀地看出各因素交互作用對(duì)甘草多糖提取率的影響,若曲線越陡峭,則表明該因素對(duì)多糖提取率的影響越大,相應(yīng)表現(xiàn)為響應(yīng)值變化的大小。

        2.3.2.1 超聲功率與超聲時(shí)間的交互作用

        超聲功率與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率影響見圖8。

        圖8 超聲功率與超聲時(shí)間的交互作用Fig.8 Interaction between ultrasonic power and ultrasonic time

        由圖8可知,隨著超聲功率和超聲時(shí)間的增加,多糖提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),等高線近似圓形。說明超聲功率和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率影響不顯著。這是因?yàn)殡S著超聲功率與時(shí)間的增加,超聲波的作用越明顯,甘草粉末與溶劑混合的越均勻,接觸越多,甘草多糖越快溶出。

        2.3.2.2 超聲功率與提取溫度的交互作用

        超聲功率與提取溫度的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率影響見圖9。

        圖9 超聲功率與提取溫度的交互作用Fig.9 Interaction between ultrasonic power and temperature

        由圖9可知隨著超聲功率和提取溫度的增加,多糖提取率先增加后減少,等高線呈橢圓形,說明超聲功率和溫度的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率影響極顯著。

        2.3.2.3 超聲功率與料液比的交互作用

        超聲功率與料液比的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率影響見圖10。

        由圖10可知,隨著超聲功率和溶劑體積的增加,多糖提取率先增加后減少,等高線近似圓形,說明超聲功率和料液比的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率影響不顯著。這是因?yàn)殡S著溶劑體積與超聲功率的增加,甘草粉末與溶劑充分接觸,使多糖溶出加快,提取率升高;當(dāng)超聲功率過高時(shí),可能對(duì)多糖類化合物具有破壞作用,故導(dǎo)致了多糖得率下降。因此,選擇超聲功率為250 W為宜。

        圖10 超聲功率與料液比的交互作用Fig.10 Interaction between ultrasonic power and material-liquid ratio

        2.3.2.4 提取溫度與超聲時(shí)間的交互作用

        提取溫度與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率影響見圖11。

        圖11 超聲時(shí)間與提取溫度的交互作用Fig.11 Interaction between ultrasound time and extraction temperature

        由圖11可知,隨著超聲時(shí)間和提取溫度的增加,多糖提取率先增加后減少。等高線近似圓形,說明超聲時(shí)間和溫度的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率影響不顯著。

        2.3.2.5 超聲時(shí)間和料液比的交互作用

        超聲時(shí)間和料液比的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率影響見圖12。

        圖12 超聲時(shí)間與料液比的交互作用Fig.12 Interaction of ultrasonic time and material-liquid ratio

        由圖12可知,隨著超聲時(shí)間和溶劑體積的增加,多糖提取率先增加后減少,等高線近似圓形。說明超聲時(shí)間和料液比的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率影響不顯著。

        2.3.2.6 提取溫度和料液比的交互作用

        提取溫度和料液比的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率影響見圖13。

        由圖13可知,隨著溫度和溶劑體積的增加,多糖提取率先增加后減少,等高線近似圓形。說明提取溫度和料液比的交互作用對(duì)甘草多糖的提取率有影響但不顯著。

        圖13 提取溫度與料液比的交互作用Fig.13 Interaction between extraction temperature and materialliquid ratio

        2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

        根據(jù)回歸方程得出提取率最高的組合為超聲功率249.36 W、時(shí)間29.81 min、溫度39.10℃、料液比1∶50.55(g/mL)時(shí),甘草多糖的理論最高提取率為8.40%。考慮到實(shí)際操作的可行性,將提取條件調(diào)整為超聲功率250 W、時(shí)間30 min、溫度39℃、料液比1∶50(g/mL)。此時(shí)的提取率為8.31%,該值與理論值接近,說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化甘草多糖提取工藝可行。

        3 結(jié)論

        本研究以甘草為研究對(duì)象,以低共熔溶劑作為提取劑,低共熔溶劑體系氫鍵供體為氯化膽堿,氫鍵受體為異丙醇,二者摩爾比為1∶3,含水量為40%時(shí),多糖提取率最高。采用超聲輔助低共熔溶劑提取其中的多糖,料液比、提取溫度、超聲溫度、超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)甘草多糖的提取率均有影響。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)得出甘草多糖提取的最優(yōu)條件:超聲功率250 W、時(shí)間 30 min、溫度 39℃、料液比 1∶50(g/mL),此時(shí)的提取率為8.31%,此法工藝條件溫和,不需要高溫高壓,多糖的提取率較高,水解和生物分解損失率低。此外,低共熔溶劑是綠色環(huán)保天然溶劑,無毒無污染,提取物可以應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域,體現(xiàn)了低共熔溶劑提取多糖的優(yōu)勢(shì)。

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