鄧冬立 肖非凡 吳冰冰 孫衛(wèi)華 楊 琳 陸 煒 周文浩

甲基丙二酸血癥(MMA)又稱甲基丙二酸尿癥，是一種罕見的先天性有機酸代謝異常導致多系統損傷的疾病,為常染色體隱性遺傳病，于1968年被首次報道[1]。MMA是中國患兒最常見的先天性有機酸代謝性疾病, 發(fā)病率為1/250 000～1/48 000[2, 3]。甲基丙二酸正常情況下在甲基丙二酰輔酶A(MCM)及其輔酶鈷胺素(cbl，即維生素B12)的作用下轉化生成琥珀酸，參與三羧酸循環(huán)。MCM缺陷或cbl代謝異?？蓪е录谆岬却x物蓄積，引起神經系統、腎臟等多系統損傷。目前研究[4]顯示，嬰兒期發(fā)病的MMA起病癥狀多樣，預后較差，但及時診治可以改善預后。本文回顧性分析復旦大學附屬兒科醫(yī)院(我院)分子醫(yī)學中心通過基因檢測確診的嬰兒期發(fā)病的MMA的臨床資料和基因突變情況，促進早期診斷和干預。

1 方法

1.1 MMA的診斷標準 質譜檢測提示MMA，或基因檢測證實存在MMA相關基因致病變異。

1.2 病例納入標準 ①2016年6月至2019年6月在我院分子醫(yī)學中心行基因檢測，發(fā)現MMA已知致病基因(MUT、MMACHC、MMAA、MMAB、MCEE、MMADHC、LMBRD1、ABCD4、PRDX1、HCFC1)的致病或可疑致病變異；②診斷年齡<1歲。

1.3 高通量基因檢測 在取得患兒父母的知情同意后，采集患兒外周靜脈血。用mini blood全血試劑盒(QIAGEN公司，德國)提取基因組DNA，NanoDrop 2000(Thermofisher公司，美國)紫外分光光度儀測定其濃度?；贗llumina Hiseq 2000/2500 平臺進行序列檢測。測序覆蓋度>98%，平均測序深度>100×。根據我院高通量測序數據分析流程 (第2版)[5]對變異進行信息注釋和致病性分析。

1.4 資料截取 從我院病歷系統中獲取以下信息：①患兒的性別、胎齡、出生體重、發(fā)病年齡、分娩方式、家族史；②根據OMIM數據庫對MMA的表型記錄，重點收集整理就診時主要臨床表現：發(fā)育延遲、肌張力異常、喂養(yǎng)困難、肝損傷、嘔吐、神經影像學改變、驚厥、心肌受累、呼吸系統異常、低鉀、血液學異常、酸中毒、腎臟受累、骨骼異常；③高通量基因檢測結果。

1.5 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件。計數資料用卡方檢驗或Fisher確切概率法進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 41例嬰兒期起病的MMA患兒進入本文分析，男26例，女15例；中位起病時間為21日齡(3日齡至1歲)，男、女患兒中位起病時間分別為18和24日齡。新生兒期就診25例，～6月齡就診12例，～12月齡就診4例。主要就診原因包括：生后反應差24例，遺傳代謝病串聯質譜篩查疑似MMA 8例(其中2例同時有同型半胱氨酸增高)。發(fā)育遲緩3例，抽搐2例，氣促伴嘔吐、單純氣促、肺動脈高壓、四肢青紫各1例。

2.2 基因檢測結果 41例共檢出2個基因47種變異。

25例攜帶MUT基因致病/可疑致病變異，2例為純合變異，其余均為復合雜合變異。共檢測到31個不同的變異位點，變異類型為：移碼突變9個、錯義突變28個、剪接供體突變4個、終止突變7個。熱點致病變異為c.729_730insTT(5例)、c.323G>A(4例)、c.1677-1G>A(4例)。

16例攜帶MMACHC基因致病/可疑致病變異，均為復合雜合變異。檢測到16個不同的變異位點，變異類型：移碼突變8個、框內缺失突變3個、錯義突變6個、剪接供體突變1個、啟動子丟失突變1個、終止突變13個。熱點致病變異：c.609G>A(8例)、c.567dupT(5例)、c.80A>G(4例)。

2.3MUT和MMACHC基因缺陷導致MMA的臨床表型比較 8例為新生兒質譜篩查懷疑MMA，尚無臨床表型，不納入基因型-臨床表型比較分析。其余33例中，22例攜帶MUT基因變異(MUT組)，11例攜帶MMACHC變異(MMACHC組)。

MUT組，男16例、女6例；新生兒期就診17例，～6月齡就診2例，～12月齡就診3例；中位起病年齡為11日齡。MMACHC組，男7例，女4例；新生兒期就診5例，～6月齡就診5例，～12月齡就診1例；中位起病年齡為2月齡。

表1顯示，2組就診主要原因差異無統計學意義；2組最常見的表型均為肌張力異常、呼吸系統異常和喂養(yǎng)困難，差異無統計學意義。MUT組更易出現酸中毒(50.0%vs9.1%，P=0.027)，MMACHC組更易出現心肌受累表型(36.4%vs4.5%，P=0.037)。此外，MUT組6例患兒行MR檢查，結果提示1例正常、1例代謝性腦病、2例腦外隙增寬、2例皮下血腫；3例患兒行CT檢查，結果提示1例正常、2例腦白質密度減低。MMACHC組5例患兒行MR檢查，結果提示1例正常、1例腦積水、1例白質髓鞘化落后、2例腦外隙增寬；1例患兒行CT檢查，結果提示腦積水。

表1 MUT和MMACHC基因缺陷致MMA臨床表型比較[n(%)]

2.4 死亡患兒分析 5例患兒放棄治療后死亡，包括多臟器功能衰竭3例，腦疝和嚴重腦積水各1例。2例攜帶MUT基因的c.626dupC/c.787G>A和c. 729_730insTT/c.1679G>A，2例攜帶MMACHC基因的c.609G>A/c.658_660delAAG變異，1例攜帶MMACHC基因的c.80A>G/c.567dupT變異。

3 討論

MMA常見于新生兒和嬰幼兒，因其臨床表現缺乏特異性而容易誤診，得到及時診治者預后較好。本研究41例<1歲起病的MMA患兒中，僅8例(19.5%)為新生兒期尚無臨床表現前，串聯質譜篩查提示MMA；其余33例因有臨床表現就診的患兒中，最主要的就診原因為反應差。如就診時合并肌張力異常、喂養(yǎng)困難，應高度懷疑MMA可能性。但上述癥狀在嬰幼兒期特異性差，而高通量測序技術的發(fā)展為MMA的早期診斷提供了極大的便利。有研究報道，中國MMA患兒最常見的變異基因為MMACHC基因和MUT基因[6]。本文對41例嬰兒期起病的MMA患兒的基因檢測結果與之一致， 25例為MUT基因變異，16例為MMACHC基因變異。

MUT基因位于染色體6p12.3區(qū)域，包含13個外顯子，全長約35 kb，其編碼的MCM酶主要有2個功能結構域[7]，N-末端的結構域(第88～422位氨基酸)為底物結合區(qū)，C-末端的結構域(第578～750位氨基酸)屬于cbl結合區(qū)。本文中MUT基因變異位點主要位于N-末端結構域的第2、3、6外顯子，可引起蛋白質二級結構的改變，從而影響MCM酶活性。Liu等[8]報告，37.5%的MUT基因突變位點位于第3、6外顯子。因此，MUT基因的第3、6外顯子為突變的熱點區(qū)域，機制尚不明確。MMACHC基因位于染色體1p34區(qū)域，含4個外顯子，編碼cblc蛋白。該基因發(fā)生突變導致cblc蛋白缺陷，破壞了正常的氰鈷胺的還原脫氰反應，引起機體甲基丙二酸及同型半胱氨酸蓄積。本文MMACHC變異多聚集在外顯子4區(qū)域，與此前報道[9]一致，提示該區(qū)域為MMACHC變異熱點區(qū)域。

目前已知的中國MMA患者MUT基因熱點變異主要為c.729_730insTT、c.1106G>A、c.914T>C和c.2080C>T[10]，MMACHC基因熱點變異主要為c.609G>A、c.80A>G和c.658_660 delAAG[9, 11]。本文MUT基因常見熱點變異為c.729_730insTT、c.323G>A和c.1677-1G>A，MMACHC基因常見熱點變異為c.609G>A、c.567dupT和c.80A>G。本文與文獻報道的熱點變異不完全一致，可能與患兒來源不同有關。文獻[9～11]以中國北方人群為主，本文患兒主要來自中國南方地區(qū)。本研究中檢測到的最常見的MMACHC基因突變位點為c.609G>A，該突變?yōu)闊o義突變，可導致色氨酸編碼提前終止，從而引起cblc蛋白缺陷，也是我國MMACHC基因的熱點突變[12]。

MMA患兒常見的臨床表現包括嘔吐、喂養(yǎng)困難、驚厥和發(fā)育遲緩等，本文患兒就診主要原因與之較一致。本文病例中，攜帶MUT基因突變的患兒較攜帶MMACHC基因突變者更易出現酸中毒癥狀，與Kang等[13]的報告一致。有研究[14]顯示，出現酸中毒表現的MMA患兒后期易出現神經系統異常及其他長期并發(fā)癥。本文還發(fā)現，攜帶MMACHC基因變異的患兒更易有心肌受累的表現。心肌病是MMA較為罕見的癥狀，Kang等[13]報告的301例MMA患者中7例(2.3%)有心肌病表現，He 等[15]報告的132例攜帶純合MMACHCc.609G>A變異的患兒均無心肌病表現，白薇等[16]報告10例有心血管系統受累的MMA患兒，9例有MMACHCc.80A>G純合/雜合變異。本文中攜帶MMACHC基因變異的患兒36.4%有心肌受累表現，均為c.80A>G雜合變異。推測MMA患兒心肌受累表型可能與c.80A>G雜合/純合變異相關。Tanpaiboon等[17]提出，宮內MMACHC酶缺乏可能是引起患兒心臟發(fā)育異常的原因。分子機制研究[18,19]也表明，MMACHC基因表達異?？梢鸺毎⒔Y構改變和線粒體功能障礙，進而誘發(fā)心臟發(fā)育異常。此外，本文發(fā)現1例攜帶MUT基因c.1208G>A/c.1286A>G變異的患兒存在心肌受累的表型。但是MUT基因變異導致心肌受累的文獻報道較少，仍需進一步的分子機制研究。

本文2例攜帶復雜MUT基因變異的死亡患兒均攜帶移碼突變。MUT基因的c.626dupC變異和c. 729_730insTT變異均位于C-末端的結構域上，可影響鈷胺素結合，從而引起蛋白質構象改變。先前研究報道中國攜帶MMACHC基因的c.609G>A/c.658_660delAAG突變位點的患兒均發(fā)病早、癥狀重、預后差[20]。本文3例死亡患兒中，2例攜帶MMACHC基因c.609G>A/c.658_660delAAG變異，1例攜帶MMACHC基因c.80A>G/c.567dupT變異。推測c.609G>A突變結合移碼變異可導致較為嚴重的臨床表型。