馬俊鵬，周美霞，李曉倩，王曉梅△，王新玲，胡君萍，依明·尕哈甫

（1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000； 2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

鐵力木MesuaferreaL.為藤黃科鐵力木屬常綠喬木，主要分布于印度、斯里蘭卡及中國云南、廣東、廣西等地［1］。鐵力木的樹皮、葉子、花和果實均有藥用價值，在民間主要用于治療蛇毒咬傷、出血和腳部灼傷等［2］，具有抗炎、抗抑郁、抗腫瘤等多種藥理活性［3-6］。鐵力木花蕾作為新疆常用藥材收錄于《中華本草》等醫(yī)藥著作［7］，具有抗腫瘤、抗菌、抑制血小板聚集等作用［8-10］，主要化學(xué)成分有香豆素類、黃酮類、三萜類、莽草酸類等［11-14］。鐵力木花蕾，且含有較豐富的黃酮類成分，不同極性部位的黃酮含量不同［15］。本研究中在單因素試驗基礎(chǔ)上采用正交試驗優(yōu)化了鐵力木花蕾總黃酮的提取工藝。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

T6型紫外可見分光光度儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；AB104-N型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）；EYELA N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；KQ-700DV型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試藥

蘆丁對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為B20771，純度＞98%）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

鐵力木花蕾購自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院藥劑科，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院王曉梅副教授鑒定為正品。將藥材粉碎，過40目篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 溶液制備

對照品溶液：取蘆丁對照品10 mg，精密稱定，置25mL容量瓶中，以60%乙醇超聲（功率100W，頻率40 kHz）處理，并定容，即得質(zhì)量濃度為0.4mg/mL的蘆丁對照品溶液。

供試品溶液：取鐵力木干燥花蕾粉末1 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，加60%乙醇30mL，回流提取2.0 h，提取3次。合并3次提取液，以60%乙醇定容至25mL，即得。

2.1.2 方法學(xué)考察

檢測波長選擇：取對照品溶液，在200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果蘆丁在510 nm波長處有最大吸收，故選擇510 nm作為測定波長。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.1.1溶液制備項下對照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，置10mL容量瓶中，加60%乙醇定容，搖勻，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液適量，在選定波長處進(jìn)樣測定，記錄吸光度（A），以蘆丁質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=15.38C-0.028，r=0.999 0（n=5）。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在0.01～0.08mg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取上述對照品溶液適量，在選定波長處測定6次，記錄吸光度。結(jié)果蘆丁吸光度的RSD為0.51%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，10，12 h時在選定波長處測定，記錄吸光度。結(jié)果總黃酮吸光度的RSD為2.55%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品適量，精密稱定，按2.1.1溶液制備項下方法制備供試品溶液，在選定波長處測定6次，記錄吸光度并計算含量。結(jié)果總黃酮含量平均值的RSD為1.96%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的對照品溶液，依法制備供試品溶液，在選定波長處測定，記錄吸光度并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 蘆丁加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.1 Resu lts of recovery tests（n=9）

2.2 含量測定和出膏率測定

取樣品適量，分別依法制備供試品溶液，在選定波長處測定，平行測定3次，記錄吸光度并計算樣品含量。精密吸取供試品溶液適量，置蒸發(fā)皿中，蒸干，冷卻后稱定質(zhì)量，計算出膏率。出膏率（%）=［（蒸發(fā)皿質(zhì)量+浸膏質(zhì)量）-蒸發(fā)皿質(zhì)量］/藥材質(zhì)量×100%。

2.3 總黃酮測定方法權(quán)衡

采用綜合評分法，設(shè)定藥材中總黃酮含量的權(quán)重為0.7，出膏率的權(quán)重為0.3。綜合評分（Y）=總黃酮含量×0.7+出膏率×0.3。

2.4 單因素試驗

提取方法：取樣品1 g，精密稱定，分別以超聲法、回流提取法提取總黃酮。結(jié)果超聲法、回流提取法綜合評分分別為45.72分，59.90分，故選擇回流提取法。

提取溶劑：取樣品1g，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，分別加水及20%，40%，60%，80%，100%乙醇25mL，回流提取2.0 h。結(jié)果以60%乙醇提取時，總黃酮綜合評分最高，故選擇60%乙醇作提取溶劑。詳見圖1。

圖1 提取溶劑篩選Fig.1 Selection of extraction solvent

提取時間：取樣品1 g，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，加60% 乙醇25 mL，分別回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h。結(jié)果，回流提取2.0時，總黃酮綜合評分最高，故選擇提取2.0 h。詳見圖2。

圖2 提取時間篩選Fig.2 Selection of extraction time

溶劑量：取樣品1g，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，分別加60%乙醇10，15，20，25mL，回流提取2.0 h。結(jié)果以25mL乙醇進(jìn)行回流提取時，總黃酮綜合評分最高，故選擇溶劑量為25mL。詳見圖3。

圖3 溶劑量篩選Fig.3 Selection of solvent amount

2.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以提取時間（A）、提取次數(shù)（B）、溶劑量（C）為考察因素，以浸膏得率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗設(shè)計優(yōu)選鐵力木花蕾總黃酮提取工藝。因素與水平見表2，試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見4。由表3、表4可知，鐵力木花蕾總黃酮提取效率的影響大小依次為提取次數(shù)（B）＞溶劑量（C）＞提取時間（A），其中提取次數(shù)為主要影響因素，其次為溶劑量。故確定最優(yōu)提取工藝為A1B3C3。

表2 L9（34）正交試驗因素與水平表Tab.2 Factors and their levels

2.6 驗證試驗

取樣品5.0 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，取適量，在選定波長處測定吸光度，并計算含量。結(jié)果樣品中總黃酮的平均含量為221.97 mg/g，綜合評分為155.49分，表明該提取工藝合理，結(jié)果見表5。

3 討論

本研究中，采用單因素試驗考察了鐵力木花蕾總黃酮的提取方法、提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)、溶劑量等因素，在此基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗設(shè)計優(yōu)選鐵力木花蕾總黃酮的提取工藝。結(jié)果顯示，鐵力木花蕾總黃酮提取效率的主要影響因素為提取次數(shù)，其次是提取溶劑量。按此最佳提取工藝得到的鐵力木花蕾60%乙醇提取物中總黃酮含量較高，達(dá)221.97mg/g。表明該方法提取效率較高，同時操作簡便，成本較低，可為鐵力木花蕾的進(jìn)一步開發(fā)利用提供可靠依據(jù)。

表3 L9（34）正交試驗設(shè)計與結(jié)果（n=9）Tab.3 Design and results of L9（34）orthogonal test（n=9）

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of ANOVA

表5 驗證試驗結(jié)果Tab.5 Resu lts of verification test