何婷，宋晶晶，陳鐘，孔簫，項(xiàng)艷*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園林學(xué)院，安徽 合肥230036；2.望江縣林業(yè)局，安徽 安慶246200；3.安徽省興誠生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，安徽 安慶246200）

香樟（Cinnamomum caphora），樟科樟屬，樹形雄偉壯觀，主干高大挺拔，四季常綠，冠大濃蔭，枝葉秀麗而有香氣，是我國南方城市非常優(yōu)美優(yōu)良的行道樹，也是風(fēng)景園林中形成植物造園景觀常見的樹種之一[1]。香樟是具有較強(qiáng)耐水淹特性的優(yōu)良樹種，發(fā)展?jié)摿薮?。目前國?nèi)外對(duì)香樟組培研究取得了一定的成果。國內(nèi)一些學(xué)者分別利用香樟伐根萌條[2-3]、不同齡期的莖段[4-12]、莖尖[13]、種子[14]、離體胚[15]、幼葉[16]、嫩芽[17-20]等作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究工作并誘導(dǎo)出完整植株；K.Nirmal Babu 等[21]也報(bào)道香樟莖段組織培養(yǎng)技術(shù)的研究成果。目前雖然有不少香樟組織培養(yǎng)獲得成功的報(bào)道，但不同學(xué)者間觀點(diǎn)還存在一定分歧，對(duì)香樟的組培體系的建立，成年香樟組培再生體系中增殖環(huán)節(jié)出現(xiàn)落葉、生根率不高等問題，尚需加強(qiáng)其高效組培再生體系建立的研究。為進(jìn)一步規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持，本試驗(yàn)以香樟萌發(fā)的莖段為外植體材料，對(duì)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究[6，8]，以期通過組織培養(yǎng)，在保持母本優(yōu)良性狀的同時(shí)促進(jìn)香樟快速繁殖，實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，滿足市場(chǎng)需求[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇安徽省望江縣興誠生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司林業(yè)基地中具有較強(qiáng)耐水淹能力的優(yōu)良香樟種子為試驗(yàn)材料，將所獲種子消毒萌發(fā)形成無菌苗，取其幼嫩帶腋芽莖段作為組織培養(yǎng)外植體材料。

1.2 方法

1.2.1 種子消毒

選取顆粒飽滿的種子，將其浸泡到無菌水中4 h 后，在超凈工作臺(tái)上利用75%酒精迅速漂洗15 s，重復(fù)3 次，再用1%次氯酸鈉浸泡5 min，接著用無菌水沖洗5 次，最后用無菌吸水紙將種子上的水分吸干備用。

將處理過的種子放至MS 培養(yǎng)基中，每瓶1 粒種子，3 周后觀察，共接50 瓶，重復(fù)3 次試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率及污染率。

試驗(yàn)選取0.5%次氯酸鈉、1%次氯酸鈉為消毒劑，每種消毒劑分別處理3 min、5 min、7 min，即一共6 個(gè)處理組合。

A：0.5%次氯酸鈉處理3 min；B：0.5%次氯酸鈉處理5 min；C：0.5%次氯酸鈉處理7 min；D：1%次氯酸鈉處理3 min；E：1%次氯酸鈉處理5 min；F：1%次氯酸鈉處理7 min。

3 周后統(tǒng)計(jì)不同消毒處理后種子污染率及發(fā)芽率。

種子污染率(%)=(污染種子數(shù)/接種種子總數(shù))×100%

種子發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽的種子數(shù)/接種的種子總數(shù))×100%

1.2.2 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光照時(shí)間14～16 h/d，光照強(qiáng)度1 500 ～2 000 lx。

1.2.3 芽的誘導(dǎo)

無菌條件下將生長30 d 左右的香樟無菌苗幼嫩莖段作為外植體，切成0.55 cm長，再轉(zhuǎn)接到添加有6-BA0.5、1、1.5 mg/L 和NAA0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過10～20 d 培養(yǎng)觀察出芽情況。

1.2.4 芽的增殖

將新芽分割成單株接種到添加有6-BA 1、2、3、4 mg/L 和NAA 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 組合的增殖培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，觀察增殖情況。

當(dāng)培養(yǎng)基選定為MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 時(shí)，分別添加濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L 的活性炭，接種新芽分割的單株芽，觀察不同濃度活性炭對(duì)芽苗褐化率和增殖的影響。

1.2.5 芽的生根

當(dāng)芽苗長至3 cm 高時(shí)接種到添加IBA 0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L 和NAA 0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L 的1/2MS培養(yǎng)基中，觀察芽苗的生根情況。

當(dāng)培養(yǎng)基選定為1/2MS+0.5 mg/LIBA+0.3 mg/L NAA 時(shí)，分別添加濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L 的活性炭，接種3 cm 高的芽苗進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同濃度活性炭對(duì)芽苗褐化和生根率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒組合對(duì)種子污染及發(fā)芽率的影響

接種7 d 后可見種子萌芽，培養(yǎng)30 d 后無菌芽伸長，芽體葉片呈綠色。由表1 可以看出，消毒效果最好的是E 處理，污染率為0。由表2，可以看出E處理對(duì)種子發(fā)芽率的影響最小，發(fā)芽率為95%。綜合種子污染率以及種子發(fā)芽率結(jié)果，最佳的消毒處理方式為E，即1%次氯酸鈉處理5 min。

表1 不同消毒組合處理后對(duì)香樟種子污染率的影響

表2 不同消毒組合處理后對(duì)香樟種子發(fā)芽率的影響

2.2 不同激素配比對(duì)芽誘導(dǎo)的影響

取香樟無菌苗上幼嫩的帶腋芽莖段接入不同組合的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)過10～20 d 培養(yǎng)，觀察出芽情況。添加不同細(xì)胞分裂素6-BA 與生長素NAA 激素配比對(duì)無菌外植體啟動(dòng)誘導(dǎo)。由表3 可知，培養(yǎng)基中隨著添加6-BA 的量增加，誘導(dǎo)率也隨之增加，但到1.5 mg/L 時(shí)，有部分莖芽出現(xiàn)半透明狀，說明6-BA mg/L的量偏高，不利于腋芽的誘導(dǎo)啟動(dòng)和培養(yǎng)。當(dāng)6-BA的量為1 mg/L、添加NAA 的量到0.1 mg/L 時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)到最高。因此激素組合為MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA 時(shí)芽苗誘導(dǎo)率最高為81%。

表3 不同激素配比對(duì)芽的誘導(dǎo)的影響

2.3 不同激素配比對(duì)芽增殖的影響

隨著6-BA 量的增加，不定芽團(tuán)增殖倍數(shù)隨之增加，但添加超過3 mg/L 后，有部分莖芽出現(xiàn)彎曲、基部膨大、葉片半透明狀等現(xiàn)象，說明6-BA 的量超過3 mg/L 后屬于分裂素偏高，不利于不定芽的增殖和培養(yǎng)，可供生根的苗很少。當(dāng)6-BA 的濃度不變，添加NAA 的量達(dá)到0.5 mg/L 時(shí)增殖效果最好。因此激素組合MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 時(shí)增殖效果最好，增殖系數(shù)為6.7。

但是從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在繼代培養(yǎng)過程中，褐化率比較高，芽苗褐化死亡，嚴(yán)重影響再生效率。于是在表4 增殖系數(shù)最高的激素組合基礎(chǔ)上添加活性炭進(jìn)行試驗(yàn)，觀察不同濃度活性炭對(duì)褐化率和增殖系數(shù)的影響。由表5 可知，當(dāng)活性炭濃度為2 g/L 時(shí)，增殖系數(shù)為6.9 相較于之前的6.7 有所提高。同時(shí)褐化率最低為3.1%，相比于不添加活性炭時(shí)，褐化率降低了23.1%，大大提高了組培苗的再生效率。

表4 不同激素配比對(duì)芽的增殖的影響

表5 不同濃度活性炭對(duì)褐化率和增殖的影響

2.4 不同激素配比對(duì)苗生根的影響

由表6 可知，生根率最高為93%，生根率最低為71%。激素組合為1/2MS+0.5 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA 時(shí)生根效果最好，生根率為93%，且生根較粗，均勻。

但是從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在生根過程中，褐化率比較高，芽苗褐化不生根甚至死亡，嚴(yán)重影響再生效率。于是在表6 生根率最高的激素組合基礎(chǔ)上添加活性炭進(jìn)行試驗(yàn)，觀察不同濃度活性炭對(duì)褐化率和生根率的影響。由表7 可知，當(dāng)活性炭濃度為2 g/L 時(shí)，生根率為98%，相較于之前的93%有所提高，同時(shí)褐化率最低為3.4%。相比于不添加活性炭時(shí)，褐化率降低了21.6%，大大提高了組培苗的再生效率。

表6 不同激素配比對(duì)苗生根的影響

2.5 試管苗的煉苗與移栽

將試管苗在無菌組培室進(jìn)行初期煉苗時(shí)發(fā)現(xiàn)，水分缺失非?？?。所以逐步在開蓋的組培瓶中加入無菌水，以保持試管苗正常生長所需的水分。將試管苗取出培養(yǎng)基時(shí)，盡量減少對(duì)根部的傷害，用流水將其基部殘留的培養(yǎng)基全部沖洗干凈，再轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基質(zhì)中。前期生長較緩慢，移植時(shí)根系較發(fā)達(dá)的香樟試管苗生長旺盛。

表7 不同濃度活性炭對(duì)褐化率和生根率的影響

3 結(jié)論與討論

目前國內(nèi)外不少關(guān)于香樟的組織培養(yǎng)的研究工作并取得成功，多數(shù)研究者在香樟組培過程中選用的基本培養(yǎng)基為MS、改良MS、1/2 MS 并按照不同的培養(yǎng)階段進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，在腋芽誘導(dǎo)所使用的植物生長調(diào)節(jié)劑以及濃度范圍為6-BA（1~2 mg/L）和NAA（0.05~0.5 mg/L）；增殖階段為6-BA（3~5 mg/L）和IBA（0.2~0.1 mg/L），不同學(xué)者對(duì)于最佳濃度組合的觀點(diǎn)存在一定的分歧。這可能與外植體采集的品種、時(shí)間、樹齡等諸多因素有關(guān)。本試驗(yàn)中使用的基本培養(yǎng)基與其他研究者基本一致，但使用的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度有些許差異。在腋芽誘導(dǎo)過程中最適激素組合為MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。而在增殖過程中所選用的激素為6-BA和NAA 組合，相比之下6-BA 與IBA 組合容易導(dǎo)致芽苗生長衰弱。

同時(shí)香樟在組織培養(yǎng)過程中，自身生長累積了各種代謝物質(zhì)，常會(huì)出現(xiàn)不生根、褐化等現(xiàn)象，不同程度地影響到其正常生長[22]。本試驗(yàn)中加入適量濃度的活性炭，能夠吸收各種代謝物質(zhì)，很好地改善組培苗生長環(huán)境，使得組培苗的褐化率降低、生根率提高[23]，從而非常有效地提高香樟組織培養(yǎng)的再生效率，更大量高效獲得耐水淹香樟組培苗，滿足市場(chǎng)需求。