張?zhí)祢?，楊秀敏，魏愛華

泛發(fā)性雀斑樣痣（generalized lentiginosis，GL）是一種罕見的色素障礙性皮膚病，多呈常染色體顯性遺傳。臨床表現(xiàn)為嬰幼兒時(shí)期即出現(xiàn)的大量棕褐至黑褐色色素沉著斑，以日光暴露區(qū)域?yàn)橹?，可累及口腔黏膜、外陰黏膜和掌跖等部位，部分患者可并發(fā)心血管疾病、神經(jīng)性耳聾、智力低下、性腺發(fā)育不全、骨骼發(fā)育異常、身材矮小等系統(tǒng)性疾病。目前已報(bào)道PTPN1、BRAF、RAF1及SASH1基因的變異與GL的發(fā)病相關(guān)[1]。本研究收集了3例臨床診斷為GL的患者，為明確診斷并提供遺傳咨詢，通過全外顯子測(cè)序的方法，對(duì)該3例患者進(jìn)行了基因檢測(cè)和遺傳學(xué)分析。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

先證者1，男，9歲。全身皮膚色素沉著斑8年余?；純撼錾?個(gè)月后，面頸部出現(xiàn)粟粒至黃豆粒大小的褐色斑疹，無痛癢等自覺癥狀，漸延及軀干、四肢?；純褐橇φ?，生長發(fā)育良好，系統(tǒng)查體及多種輔助檢查均未見異常。否認(rèn)家族類似疾病史及近親婚育史。皮膚科查體：面頸部、軀干及四肢散在粟粒至蠶豆粒大小的棕褐色斑疹，以曝光部位為著，掌跖及口腔黏膜未見累及（圖1a）。

先證者2，男，8歲。全身皮膚色素沉著斑7年余。患兒出生6個(gè)月后，面部出現(xiàn)粟粒至綠豆粒大小的褐色斑疹，顏色深淺不一，漸延及軀干、四肢。近1年，面部皮損部分消退。患兒智力正常，生長發(fā)育良好，系統(tǒng)查體及輔助檢查均未見異常。否認(rèn)家族史及家族近親婚育史。皮膚科查體：面頸部、軀干及四肢彌散粟粒至綠豆粒大小的淺褐色至黑褐色斑疹，以曝光部位為著，掌跖及口腔黏膜未見累及（圖1b）。

先證者3，女，6歲。全身皮膚色素沉著斑5年余。患兒出生6個(gè)月后，面部及雙上肢曝光部位出現(xiàn)粟粒至黃豆粒大小的棕褐色斑疹，圓形或橢圓形，漸延及頸部、軀干及雙下肢。患兒智力正常，生長發(fā)育良好，系統(tǒng)查體及輔助檢查均未見異常。否認(rèn)家族類似疾病史及近親婚育史。皮膚科查體：面部、四肢彌漫粟粒至黃豆大小棕褐色斑疹，部分融合成片；軀干部亦可見散在分布的少量類似皮損（圖1c）。

圖1 泛發(fā)性雀斑樣痣患兒臨床皮損表現(xiàn)

3位先證者的監(jiān)護(hù)人均拒絕皮膚組織病理檢查，故無相關(guān)組織病理檢查資料。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 由監(jiān)護(hù)人簽署知情同意后，分別采集3例先證者及其父母外周血各2 ml，采用磁珠法通用型DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取外周血基因組DNA。

1.2.2 全外顯子組測(cè)序 先證者DNA樣品通過Covaris破碎儀隨機(jī)打斷成長度為180-～80 bp的片段并制備文庫，利用Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲，Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)變異進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 Sanger測(cè)序 Sanger測(cè)序驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果，并對(duì)其父母行家系內(nèi)驗(yàn)證，確定變異的親本來源。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以GRCh37/UCSC hg19作為參考基因組進(jìn)行比對(duì)，依據(jù)嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)變異進(jìn)行過濾，并添加人類基因組突變頻率數(shù)據(jù)庫（Genome Aggregation Database, gnomAD）東亞人群、千人基因組數(shù)據(jù)庫（1000 Genomes Project）、RefSeq參考序列數(shù)據(jù)庫、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（the Human Gene Database,HGMD）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）以及蛋白功能預(yù)測(cè)軟件等相關(guān)注釋信息。對(duì)于未見文獻(xiàn)報(bào)道及數(shù)據(jù)庫收錄的新變異，根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）發(fā)布的《序列變異解讀的標(biāo)準(zhǔn)和指南》，對(duì)變異進(jìn)行致病性分級(jí)。

2 結(jié)果

在3例先證者SASH1基因上檢出3種雜合變異，根據(jù)ACMG指南，分級(jí)為致病性變異和可能致病性變異，未發(fā)現(xiàn)PTPN11，RAF，BRAF，PTEN，LKB1等文獻(xiàn)報(bào)道的其他可伴有雀斑樣痣表現(xiàn)的基因變異。結(jié)合臨床表型和分子診斷，3例先證者均確診為泛發(fā)性雀斑樣痣。

先證者1. 檢出SASH1基因c.1526_1527insAAGT（p.Leu511Lysfs*21）雜合移碼變異，先證者父母（通過親子鑒定）均未攜帶，考慮為de novo變異（不排除生殖系嵌合等可能）。此變異在gnomAD東亞人群及1000 Genomes中國人群中均未收錄，在HGMD數(shù)據(jù)庫中為已報(bào)道的致病性突變。根據(jù)ACMG指南，該變異分級(jí)為致?。≒S2+PS4）（表1，圖2）。

先證者2. 檢出SASH1基因c.1520C＞T（p.Ser507Phe）雜合錯(cuò)義變異，先證者父母（通過親子鑒定）均無攜帶，考慮de novo變異（不排除生殖系嵌合等可能）。該變異尚無文獻(xiàn)報(bào)道，在gnomAD東亞人群、1000 Genomes中國人群及HGMD中國人群中均無收錄，生物信息分析軟件SIFT、Mutation_Taster和PolyPhen2均預(yù)測(cè)有害。根據(jù)ACMG指南，c.1520C＞T（p.Ser507Phe）分級(jí)為可能致?。≒S2+PM2+PP2+PP3+PP4）（表1，圖2）。

表1 3例先證者基因檢測(cè)結(jié)果

圖2 3例先證者家系圖及家系SASH1基因Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

先證者3. 檢出SASH1基因c.1761C＞G（p.Ser587Arg）雜合錯(cuò)義變異，母親未攜帶（父親已故）。該變異已有文獻(xiàn)報(bào)道[2,3]，但gnomAD東亞人群、1000 Genomes中國人群和HGMD中國人群中目前均無收錄。該變異在SASH1基因高度保守的SH3功能域上，Clinvar收錄該區(qū)域的錯(cuò)義突變?yōu)橹虏∽儺?。已有功能研究證實(shí)，該變異可引起SASH1蛋白表達(dá)量顯著降低[3]。生物信息分析軟件SIFT、Mutation_Taster和PolyPhen2均預(yù)測(cè)有害。根據(jù)ACMG指南，該變異分級(jí)為致?。≒S3+PM1+PM2+PP2+PP3+PP4）（表1，圖2）。

3 討論

GL是一種以幼年時(shí)期迅速出現(xiàn)的大量黑褐色斑疹為主要特征的色素障礙性皮膚病[4,5]。根據(jù)有無系統(tǒng)受累，分為發(fā)疹性黑子病（eruptive lentiginosis）和泛發(fā)性黑子綜合征（multiple lentigines syndrome）。前者表現(xiàn)為僅累及皮膚的損害，后者除典型的皮膚表現(xiàn)外，可并發(fā)眼距增寬、內(nèi)眥贅皮、上瞼下垂等特殊面容及心血管、呼吸、神經(jīng)、骨骼，泌尿生殖等全身系統(tǒng)的異常。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，超過90%的泛發(fā)性黑子綜合征的發(fā)生與PTPN11、BRAF及RAF1基因突變相關(guān)[6]，而發(fā)疹性黑子病基因研究相對(duì)較少。2015年，Shellman等[7]將發(fā)疹性黑子病的致病基因定位于SASH1基因。SASH1基因定位于染色體6q24.3區(qū)域，共包含22個(gè)外顯子，其編碼蛋白是由l 247個(gè)氨基酸組成的SLY家族的信號(hào)銜接蛋白，包含1個(gè)高度保守的功能域，1個(gè)SH3功能域和2個(gè)SAM功能域。研究證實(shí)，該基因的突變與人類的異常皮膚色素沉著有關(guān)。Shellman等[7]發(fā)現(xiàn)，突變的SASH1蛋白通過增加與Gαs亞基和IQ功能域GTP酶激活蛋白1（IQGAP1）的結(jié)合導(dǎo)致E鈣黏素表達(dá)減少，引起GL發(fā)病過程中黑素細(xì)胞特定的遷移和分布。在一項(xiàng)最新的研究中，Cui等[3]發(fā)現(xiàn)SASH1突變可通過抑制SASH1-TGF-β1信號(hào)途徑，導(dǎo)致表皮中黑素細(xì)胞的形態(tài)和定位異常，從而引起異常的色素沉著。

迄今，僅在4例診斷為發(fā)疹性黑子病的患者中檢測(cè)到了SASH1變異[4,7,8]，而在泛發(fā)性黑子綜合征型的患者中尚未發(fā)現(xiàn)該基因上的變異。值得注意的是，SASH1基因變異導(dǎo)致的色素異常表型具有異質(zhì)性，可與其他臨床綜合征發(fā)生重疊?；蛲蛔兾稽c(diǎn)不同，表型可不同。例如，SASH1基因變異也可致遺傳性泛發(fā)性色素異常癥（dyschromatosis universalis hereditarian，DUH）。DUH是一種常染色體顯性遺傳病，常表現(xiàn)為不同程度的色素沉著與色素減退斑相互間雜，呈現(xiàn)斑駁樣外觀，皮損常均勻泛發(fā)全身而與日光暴露無關(guān)。皮損的形態(tài)和顏色不隨年齡增長和季節(jié)變化而改變。本研究中的3例先證者均表現(xiàn)為以曝光部位為主的雀斑樣斑疹，全身未見類似DUH的色素減退斑。先證者2面部皮損隨著年齡增長有部分消退。對(duì)比既往報(bào)道的DUH患者的表型，結(jié)合基因檢測(cè)結(jié)果，本研究3例先證者均診斷為泛發(fā)性雀斑樣痣。3例先證者均未發(fā)現(xiàn)皮膚以外的系統(tǒng)病變，推測(cè)原因可能為：①均屬于發(fā)疹性黑子病；②GL的皮損常發(fā)生在幼年，系統(tǒng)性病變多發(fā)生于成年以后或者更晚，3例患兒均還未到系統(tǒng)性損害的發(fā)病年齡。目前尚無確切方法早期區(qū)分發(fā)疹性黑子和泛發(fā)性黑子綜合征。GL的早期確診，有利于檢測(cè)可能出現(xiàn)的系統(tǒng)病變并及時(shí)干預(yù)。筆者將對(duì)這3例患兒進(jìn)行長期的隨訪觀察。

目前文獻(xiàn)共報(bào)道了11種SASH1基因變異與色素異常性皮膚病的發(fā)生相關(guān)。其中，SASH1基因p.S507A,p.S513R,p.S519N和c.1527_1530dupAAGT變異與GL表型相關(guān)[4,7,8]，涉及4例患者。這些患者均表現(xiàn)為以曝光部位為主的散在或密集分布的黑褐色斑疹，僅有1例患者伴有少量散在的色素減退斑[4]。SASH1基因p.S587R，p.E509K，p.L515P，p.Y551H，p.Y551D和p.M595T變異與DUH的發(fā)生相關(guān)[2,9,10]，患者均表現(xiàn)為全身泛發(fā)的不規(guī)則色素沉著斑，夾雜均勻分布的色素減退斑，呈網(wǎng)狀或斑駁樣外觀。SASH1基因純合變異p.E617K可導(dǎo)致以色素異常、掌跖角化、復(fù)發(fā)性鱗狀細(xì)胞癌和斑禿為表現(xiàn)的臨床綜合征[11]。

本研究中，先證者1檢出的SASH1基因c.1526_1527dupAAGT變異，曾在1例臨床診斷為GL的中國患者中檢出。該患者與本研究中的3例患者具有相似的臨床表型[4]。先證者2檢出的SASH1基因p.S507F變異，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道與數(shù)據(jù)庫收錄，但在相同氨基酸位置的p.S507A變異曾在1例表現(xiàn)為GL的中國患者中檢出[8]。先證者3檢出的SASH1基因p.S587R變異已有文獻(xiàn)報(bào)道，在兩個(gè)不同研究中的中國DUH家系中，患者均檢出了此變異[2,3]。本研究為首次報(bào)道該變異可致GL表型，進(jìn)一步證實(shí)了SASH1基因變異所致的臨床表型具有異質(zhì)性。

本研究通過全外顯子組測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法，確診了3例GL散發(fā)病例，鑒定出SASH1基因的3種變異，進(jìn)一步證實(shí)了SASH1是導(dǎo)致雀斑樣痣表型伴或不伴色素異常癥的致病基因[4,5]。新變異的鑒定，豐富了人類基因突變數(shù)據(jù)庫，為泛發(fā)性雀斑樣痣的遺傳咨詢提供了有益信息。