李 涵

（濮陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南濮陽 457000）

大氣中包括甲烷在內(nèi)的溫室氣體濃度增加會導(dǎo)致全球變暖，這是近年來人們關(guān)注的主要問題。近年，畜牧業(yè)中反芻動物排放的甲烷引起重視。甲烷是一種比二氧化碳強23倍的溫室氣體，反芻動物腸道發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷主要是由于兼性厭氧條件對細(xì)菌、原生動物和真菌的生長有利（孫福昱等，2018）。瘤胃內(nèi)的甲烷排放被認(rèn)為是一個能量浪費過程（Johnson等，1995）。許多化學(xué)食品添加劑已經(jīng)被證明具有減降低瘤胃甲烷排放的潛力，但它們要么對宿主動物有毒，要么對有益的瘤胃微生物產(chǎn)生副作用。為降低反芻動物甲烷排放，選擇具有生物活性的化合物來降低原生動物活性已成為一種研究方法。但在供人類食用的動物身上使用化學(xué)物質(zhì)的風(fēng)險越來越受到公眾關(guān)注。Kim等（2012）研究表明，植物提取物可以控制瘤胃微生物多樣性，是降低甲烷排放的較好替代選擇，這種方法也是動物營養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為最有潛力的策略。本研究旨在評估松樹和銀杏葉提取物對瘤胃發(fā)酵、瘤胃產(chǎn)甲烷和產(chǎn)甲烷相關(guān)微生物的體外作用。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與體外發(fā)酵 以100 g/300 mL的溶劑，用70%的乙醇制備松樹和銀杏葉提取物。將含70%乙醇的燒瓶塞住，在39℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上孵育24 h。從壓碎的葉子中提取松樹和銀杏葉汁液，然后用濾紙過濾，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將70%乙醇溶劑除去，4℃保存?zhèn)溆?。?頭500 kg重、帶有瘤胃瘺管荷斯坦奶牛瘤胃中收集瘤胃液，瘤胃液經(jīng)四層紗布過濾后分為5組，對照組不添加植物提取物，T1組添加5%松樹液，T2組添加5%松樹70%乙醇提取物，T3組添加5%銀杏葉液，T4組添加5%銀杏葉70%乙醇提取物。將瘤胃液注入血清瓶，置于39℃的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。體外試驗每組3個重復(fù)。孵育后分別測定瘤胃液pH、揮發(fā)性脂肪酸總量、乙酸、丙酸和丁酸含量。參考王榮等（2019）的研究方法測定瘤胃發(fā)酵氣體生成總量、甲烷和二氧化碳量。

1.2 微生物定量 從培養(yǎng)液中取30 mL樣品，用寬口徑的移液管取1.0 mL的溶液，以確保樣品中含有液體和消化液，用核酸提取試劑盒提取RNA。參考Ohene-Adjei等（2008）的方法設(shè)計纖毛蟲、產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)琥鉑酸絲狀桿菌的引物，并進(jìn)行實時熒光定量PCR分析，測定結(jié)果以對照組進(jìn)行歸一化，處理組表示為相對于對照組的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)分析采用SAS統(tǒng)計分析軟件的一般線性模型，利用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物提取物對瘤胃體外發(fā)酵特征的影響由表1可知，松樹和銀杏葉提取物顯著影響瘤胃體外發(fā)酵總氣體產(chǎn)量、甲烷排放和二氧化碳排放量（P＜0.05），其中松樹和銀杏葉乙醇提取物較對照組顯著降低了氣體總量和甲烷排放量（P＜0.05），而5%松樹液和5%銀杏葉乙醇提取物較對照組瘤胃體外發(fā)酵二氧化碳產(chǎn)量顯著降低了31.17%和33.02%（P＜0.05）。

由表2可知，銀杏葉液和銀杏葉乙醇提取物組瘤胃pH較對照組顯著提高了0.94%和0.79%（P＜0.05），而對照組揮發(fā)性脂肪酸總量最高，較處理組分別顯著提高10.39%、11.12%、8.58%和9.62%（P＜0.05），處理組間對揮發(fā)性脂肪酸總量的影響無顯著差異（P＞0.05）。此外，對照組乙酸、丙酸和丁酸含量也表現(xiàn)最高，其中乙酸含量較T1、T2和T4組分別顯著提高9.15%、10.30%和9.80%（P＜0.05），丙酸含量較T1和T2組分別顯著提高11.69%和12.62%（P＜0.05），丁酸含量較處理組分別顯著提高12.28%、13.52%、10.36%和10.44%（P＜0.05）。T1組乙酸與丙酸比值最高，分別較對照組、T3和T4組顯著提高2.55%、1.52% 和 3.08%（P＜ 0.05）。

2.2 植物提取物對瘤胃體外發(fā)酵微生物相對表達(dá)量的影響 由表3可知，與對照組相比，處理組瘤胃體外發(fā)酵中纖毛蟲、產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)琥鉑酸絲狀桿菌的相對表達(dá)量降低了25%～49%（P＜ 0.05）。

3 討論

體外瘤胃發(fā)酵可能受植物提取物的用量和提取溶劑的影響，如Pfister等（1992）指出，牛飼料中添加15%～30%的松樹葉似乎是瘤胃發(fā)酵毒性作用的閾值。但植物提取物對牛消化性能的不良影響還有待進(jìn)一步研究。在本研究中，松樹和銀杏葉乙醇提取物較對照組顯著降低了氣體總量和甲烷排放量。銀杏葉提取物對pH的影響也顯著，同時各植物提取物的揮發(fā)性脂肪酸總量均顯著低于對照組，這表明氫氣產(chǎn)物可能被用作瘤胃產(chǎn)甲烷菌轉(zhuǎn)移甲烷的底物。因此，氫氣對反芻動物的微生物生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。此外，由琥珀酸形成丙酸會導(dǎo)致氫氣的產(chǎn)甲烷能力降低。腸內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生的氫氣是反芻動物甲烷生成的前體，調(diào)控氫氣而非甲烷是控制反芻動物甲烷排放的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明，植物提取物特別是銀杏葉乙醇提取物可能影響甲烷生成，降低瘤胃甲烷排放。

表1 植物提取物對瘤胃體外發(fā)酵氣體生成的影響 mL/g

表2 植物提取物對瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

表3 植物提取物對瘤胃體外發(fā)酵微生物相對表達(dá)量的影響

本試驗使用的松樹和銀杏葉提取物具有驅(qū)蟲劑、抗菌和抗氧化活性，并已被用作藥物用途（Lee等，2006）。松樹和銀杏葉中的次生化合物（如黃酮類化合物）可能調(diào)控瘤胃發(fā)酵，抑制瘤胃內(nèi)的微生物，尤其是原生動物。特別是銀杏葉提取物具有天然的殺蟲作用，可能還具有驅(qū)蟲劑和抗菌作用。Yoo等（2004）在離體試驗?zāi)Ｐ椭袑λ蓸淙~提取物的抗氧化活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)松樹提取物中總多酚類化合物的含量為1.61%。本研究通過實時熒光定量PCR分析了體外瘤胃發(fā)酵液中微生物的表達(dá)量。一些瘤胃纖毛蟲和產(chǎn)甲烷菌被認(rèn)為是共生體，本研究結(jié)果表明，補充松樹和銀杏葉提取物可降低纖毛蟲數(shù)量，抑制甲烷生成，進(jìn)而降低瘤胃甲烷排放。Broudiscou等（2000）篩選了植物提取物，對其產(chǎn)甲烷作用、發(fā)酵模式和原生動物數(shù)量進(jìn)行了評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物提取物對產(chǎn)甲烷有輕微的抑制作用。Jo等（1997）在體研究了牧草（紫花苜蓿、金合歡葉和松樹葉）對韓國山羊采食量和消化率的影響，體內(nèi)研究結(jié)果表明，松樹葉組的干物質(zhì)攝入量和干物質(zhì)消化率均低于其他飼料，但本試驗體外研究結(jié)果未顯示添加植物提取物對產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌基因表達(dá)有不利影響。

4 結(jié)論

植物提取物（松樹和銀杏葉乙醇提取物）降低了瘤胃體外發(fā)酵甲烷產(chǎn)量，但有必要進(jìn)一步探討植物提取物的劑量和植物提取物是否對瘤胃具有副作用。